純化后中藥多糖對雞新城疫疫苗免疫、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及IgG、IgM的影響

楊紅洋，朱曉慶，谷新利*

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

純化后中藥多糖對雞新城疫疫苗免疫、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及IgG、IgM的影響

楊紅洋，朱曉慶1，谷新利1*

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

為探究中藥復(fù)方多糖對雞新城疫抗體含量、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及IgG、IgM含量的影響，本研究將200羽黃麻肉雞分成高、中、低劑量組和空白對照組，每組50羽，于7、28日齡進(jìn)行新城疫疫苗免疫；各試驗組雞于8日齡分別肌肉注射不同劑量純化中藥復(fù)方多糖，連續(xù)7 d；采集21、42、56、70日齡雞外周血，ELISA法檢測血清中新城疫抗體、IgG和IgM含量，MTT法測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示：與空白對照組相比，各試驗組雞新城疫抗體含量、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及IgG、IgM的含量均有顯著的提高(P<0.05)；中劑量組免疫增強效果顯著高于高劑量組和低劑量組 (P<0.05)，高劑量組免疫增強效果高于低劑量組。由此可見，中劑量多糖免疫增強作用優(yōu)于高劑量和低劑量，為增強免疫作用的最佳濃度。

復(fù)方多糖；雞；新城疫；免疫球蛋白；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

雞養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，人們通過接種疫苗的方式進(jìn)行多種雞傳染病的預(yù)防，但受多種因素影響，疫苗免疫效果并不理想[1]。而疫苗接種時，配合使用免疫增強劑則可提高疫苗接種成功率。我國傳統(tǒng)藥物中藥，具有藥效長、毒副作用小、低殘留等多種優(yōu)點，在畜禽生產(chǎn)中，將其作為提高機體免疫能力的免疫增強劑的研究與應(yīng)用逐漸增多。

中藥多種有效成分對雞免疫力均有一定影響[2-3]，主要起免疫增強作用的是多糖成分，同時植物多糖還具有抗菌、抗氧化作用[4-5]。目前，對單味中藥多糖的研究較多[6]，如五味子多糖[7]、黃芪多糖[8-9]、牛膝多糖[1 0]等。雖然它們均可提高動物免疫力，但相對于中藥復(fù)方，單味中藥的作用效果仍有一定差距。目前，國內(nèi)對中藥復(fù)方多糖在提高畜禽集體免疫力方面的研究逐漸增多。

因此，根據(jù)石河子大學(xué)中獸醫(yī)實驗室前期工作，從中藥復(fù)方（由當(dāng)歸、黨參、熟地、川芎、山楂、何首烏等11味中藥組成）中提取，并通過AB-8大孔吸附樹脂純化獲得的一定純度中藥多糖，對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。本研究利用該中藥復(fù)方多糖，在雞進(jìn)行新城疫疫苗免疫后，注射不同劑量多糖，檢測不同日齡雞新城疫抗體、IgG、IgM含量及T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的動態(tài)變化，從體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面探討中藥復(fù)方多糖對雞免疫力的影響，篩選中藥復(fù)方多糖增強雞免疫力的最佳濃度，以期為其開發(fā)成新的免疫增強劑和在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物

中藥復(fù)方（由當(dāng)歸、黨參、熟地、川芎、山楂、何首烏等11味中藥組成）多糖（含量為77.10%）由本院中獸醫(yī)學(xué)實驗室提供。用滅菌蒸餾水配成高劑量(50 mg/mL)、中劑量(25 mg/mL)、低劑量(12.5 mg/mL)3個質(zhì)量濃度。

1.1.2 藥品與試劑

ND活疫苗購自石河子市八師獸醫(yī)站；雞新城疫抗體(NDV-Ab)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自北京城林生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；雞IgG、IgM ELISA檢測試劑盒購自上海藍(lán)基生物有限公司生產(chǎn)；MTT、胎牛血清、雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（美國熱電，F(xiàn)C）、微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及處理

200羽1日齡黃麻肉雞購自石河子市孵化場，臨床檢測健康。隨機分為4組，每組50羽，于7和28日齡分別進(jìn)行新城疫疫苗點眼滴鼻免疫。3個試驗組于8日齡分別肌肉注射 50、25、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖水溶液，連續(xù)7 d，空白對照組注射等體積滅菌蒸餾水。

于 21、42、56、70日齡時采集雞外周靜脈血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞新城疫抗體含量測定

根據(jù)雞新城疫抗體ELISA試劑盒說明書，利用ELISA檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測樣品吸光度值(OD值)，在回歸方程中計算出各個樣品新城疫抗體的含量。

1.2.3 雞血清IgG、IgM含量的檢測

根據(jù)雞IgG、IgM ELISA檢測試劑盒說明書，利用ELISA檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算分別得到2種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，通過2種試劑盒檢測樣品后，再用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測樣品吸光度值(OD值)，分別在相應(yīng)的回歸方程中計算樣品IgG、IgM的含量。

1.2.4 雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的檢測

采用MTT法檢測雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[14]。在21、42、56、70日齡，翅靜脈采血，按照雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒說明書，分離雞淋巴細(xì)胞，得到的淋巴細(xì)胞用懸浮液懸浮，加入96孔板中，設(shè)置空白對照孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前3 h加入10 mg/mL MTT 10 μL。培養(yǎng)結(jié)束，離心去上清，加入150 μL DMSO溶液，450 nm處檢測吸光度。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率公式如下：

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=(試驗組平均吸光度-對照平均吸光度)/對照平均吸光度×100%。

根據(jù)上式，計算得到淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，用log2處理后進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示結(jié)果，采用方差分析和多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方多糖對雞新城疫抗體含量的影響

由表1可知：21日齡時，中劑量組與空白對照組相比差異顯著；同時，中劑量組顯著高于高劑量組、低劑量組 (P<0.05)；42和56日齡，各多糖組均顯著高于空白對照組(P<0.05)，中劑量組顯著高于高劑量組和低劑量組(P<0.05)，高劑量組和低劑量組差異不顯著；70日齡，中劑量組與其他3組差異顯著(P<0.05)。

結(jié)果表明，各中藥復(fù)方多糖組雞新城疫抗體含量均有提高。

表1 雞新城疫抗體含量檢測結(jié)果 pg/mL Tab.1 The results of Newcastle Disease antibody content

2.2 中藥復(fù)方多糖對雞血清IgM、IgG含量的影響

由表2可知，21和56日齡，中劑量組顯著高于高、低劑量組和空白對照組(P<0.05)，高劑量組、低劑量組與空白對照組之間差異不顯著。42和70日齡，多糖組顯著高于空白對照組(P<0.05)，中劑量組顯著高于高劑量組和低劑量組(P<0.05)，高劑量組和低劑量組之間差異不顯著。

結(jié)果表明，中藥復(fù)方多糖能夠提高雞血清中的IgM的含量。

表2 IgM含量檢測結(jié)果 mg/mLTab.2 The content of IgM

由表3可知，21和42日齡時，中劑量組顯著高于高劑量組、低劑量組和空白對照組 (P<0.05)，高劑量組、低劑量組、空白對照組之間差異不顯著；56和70日齡，各多糖組IgG含量均顯著高于空白對照組(P<0.05)，中劑量組顯著高于高劑量組、低劑量組(P<0.05)，高劑量組和低劑量組之間差異不顯著。

結(jié)果表明，各日齡中藥復(fù)方多糖組雞血清IgG含量相對于空白對照組均有提高。

表3 IgG含量檢測結(jié)果 mg/mLTab.3 The content of IgG

2.3 中藥復(fù)方多糖對雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

由表4可知，21日齡時，中劑量組的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于高劑量組、低劑量組和空白對照組 (P<0.05)，高劑量組、低劑量組和空白對照組之間差異不顯著。42、56和70日齡，各多糖組均顯著高于空白對照組(P<0.05)，且中劑量組極顯著高于空白對照組(P<0.01)，中劑量組顯著高于高劑量組、低劑量組 (P<0.05)。

表4 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測結(jié)果Tab.4 T lymphocyte transformation rate

3 討論

3.1 中藥復(fù)方多糖對雞新城疫抗體含量的影響

目前，主要通過接種疫苗的方法對新城疫疾病進(jìn)行防治，免疫增強劑可大大提高疫苗接種成功率。劉蓉蓉等[15]在雛雞免疫新城疫免疫后，用飲水方式投喂不同濃度的香菇多糖，發(fā)現(xiàn)各試驗組新城疫抗體水平顯著提高，但本試驗結(jié)果更優(yōu)，這可能與給藥途徑不同有關(guān)。本試驗以肌肉注射為方式給藥，喬海博等[16]通過口服用藥，兩者所得結(jié)果有所差異，這一差異也證明給藥途徑不同，對中藥多糖的效果也有影響。此外，雖然本研究與陳家磊等[17]的用藥方式相同，但其為單味車前草多糖，而本研究采用的是中藥復(fù)方多糖，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方多糖的作用效果優(yōu)于單味中藥多糖。

本試驗中，多糖組雞血清中新城疫抗體的含量水平均有提高，且以中劑量組的效果最好，其原因可能是多糖的濃度越高，鞣質(zhì)等其他成分含量也越高，影響了多糖的作用效果，或者是由于多糖能直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，高劑量的多糖由于濃度過高，對雞免疫能力的調(diào)節(jié)有一定的干擾。

3.2 中藥復(fù)方多糖對雞血清IgM、IgG含量的影響

IgG和IgM均是血清中重要的抗體，IgG約占血清總免疫球蛋白的75%，IgM是分子量最大的免疫球蛋白，2種抗體在動物機體的體液免疫中起主要作用。本試驗中，中藥復(fù)方多糖提高了2種免疫球蛋白含量，表明其可提高雞體液免疫，這與Wang等[18]的研究報道一致。本研究中，雞21日齡時中劑量中藥復(fù)方多糖組增強IgG、IgM效果顯著，而王佳麗等[19]將中藥復(fù)方直接烘干飼喂的研究中21日齡時并未表現(xiàn)出明顯差異，表明中藥復(fù)方通過提取純化得到的一定純度多糖能更迅速地提高動物機體體液免疫。另外，42、56和70日齡，多糖組增強IgG、IgM效果顯著，這與梁英等[20]飼喂黃芩多糖研究結(jié)果的趨勢一致，但本研究的增強效果更明顯，這可能與本研究中的復(fù)方多糖經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸后獲得純度更高的多糖以及用藥方式不同有關(guān)。

3.3 中藥復(fù)方多糖對雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

T淋巴細(xì)胞是機體內(nèi)一種重要的淋巴細(xì)胞，最終分化成多個細(xì)胞亞群，轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞，并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，發(fā)揮細(xì)胞免疫的作用。多糖是一種典型的淋巴細(xì)胞激活劑，研究表明多糖能夠影響淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，而鈣離子作為一種重要的信使分子，對淋巴細(xì)胞的功能有著重要作用。中藥多糖可通過影響淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例增強淋巴細(xì)胞免疫活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化等途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。王思蘆等[21]報道雞樅菌多糖(TAP)能明顯升高免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞CD3+和CD4+陽性率，并降低CD8+比率，使各組CD4+/CD8+比值明顯升高，同時也使淋巴細(xì)胞總數(shù)升高，提示TAP在促進(jìn)T細(xì)胞增殖的同時對B細(xì)胞及單核細(xì)胞也具有增殖作用，從而提高機體免疫功能。本試驗的結(jié)果顯示，中藥復(fù)方多糖組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均高于空白對照組，驗證了這一結(jié)論。在本研究中，42、56和70日齡，各中藥復(fù)方多糖組均提高了T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，且中劑量中藥復(fù)方多糖組增強效果高于其他各組，這與商云霞等 的研究結(jié)果基本一致。章世元等[23]在苜蓿多糖和黃芪多糖對體外培養(yǎng)雞外周血淋巴細(xì)胞影響的研究表明，3種不同濃度的黃芪多糖對雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有促進(jìn)作用，且以中劑量濃度(200 μg/mL)效果最好，與本研究結(jié)果基本一致。另外，隨著苜蓿多糖濃度不斷提高 (最高濃度為50 μg/mL)，其作用效果也逐漸加強，與本研究的結(jié)果不一致，這可能與其所用苜蓿多糖的濃度較低有關(guān)。

4 小結(jié)

本研究提示，中藥復(fù)方多糖能提高雞新城疫抗體含量，增加雞血清IgM、IgG含量，促進(jìn)雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且中劑量中藥復(fù)方多糖免疫增強效果最好。中藥復(fù)方多糖作為來源于植物的天然有效成分，具無毒副作用，低殘留，作用效果明顯，有效作用持續(xù)時間長，容易獲得等特點，在未來畜牧業(yè)發(fā)展中具有廣闊的前景。同時，本研究也為將來中藥復(fù)方多糖的研究提供一定的參考。

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Effects of purified Chinese herbal medicinal polysaccharides on Newcastle Disease vaccine,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content in chicken

Yang Hongyang1,Zhu Xiaoqing1,Gu Xinli1*
(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

To explore the effects of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on Newcastle Disease (ND)antibody content,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content.200 HuangMa chickens randomly divided into high does group,middle does group,low does group and control group.Each group was vaccinated with NDV at age of 7 and 28 days old respectively.Each experimental group intramuscular injection of three different purified polysaccharide traditional Chinese medicine at 8-day-old,for 7 consecutive days.Detected 21,42,56,70-day-old chicken serums Newcastle Disease antibody content and IgG,IgM content by ELISA,detected T lymphocyte transformation rate by MTT.The results showed that the experimental groups Newcastle Disease antibody content,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content was significantly improved,which compared with the control group(P<0.05).The middle dose group was significantly higher than that of high dose group and low dose group(P<0.05),and high dose group higher than the low dose group.It is showed that the best immune enhancing effect is the median concentrations of polysaccharide.

polysaccharide compound;chicken;Newcastle Disease;immunoglobulin;T lymphocyte transformation rate

S858.31；S853.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.004

1007-7383(2017)02-0152-05

2016-08-23

國家自然科學(xué)基金項目(31460673)

楊紅洋(1987-)，男，碩士研究生，專業(yè)研究方向為臨床獸醫(yī)學(xué),e-mail:hongyangy527@126.com。

*通信作者：谷新利（1963-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥制劑開發(fā)與應(yīng)用方面研究，e-mail:xlgu@shzu.edu.cn。