測(cè)序分析轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控阿司匹林刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的可變表達(dá)

劉芳，單偉，李舒，王鶴鳴，孫苑紅

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

1 研究目的

分析藥物（阿司匹林）刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后基因差異表達(dá)，通過(guò)高通量測(cè)序分析差異基因的表達(dá)及相關(guān)的調(diào)控，以及對(duì)基因富集分析。

阿司匹林已應(yīng)用百年，是醫(yī)藥史上三大經(jīng)典藥物之一，至今仍是世界上應(yīng)用最廣泛的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎藥，也是作為比較和評(píng)價(jià)其他藥物的標(biāo)準(zhǔn)制劑。此外，研究已經(jīng)證實(shí)阿司匹林具有抗炎抗栓等多種細(xì)胞保護(hù)作用[1]。阿司匹林因能使環(huán)加氧酶活性中心的絲氨酸乙?；Щ睿瑥亩钄嘌ㄋ睾铣梢砸种蒲“寰奂?，起到防止血栓形成的作用，因此，阿司匹林已被作為心腦血管病患者的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防的主要措施[2]。阿司匹林是最早被應(yīng)用于抗栓治療的抗血小板藥物，已經(jīng)被確立為治療急性腦梗死、心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定心絞痛及心肌梗死(MI)Ⅱ期預(yù)防的經(jīng)典用藥。COXs是AA生成TXA2和前列腺素I2（PGI2）過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，在人體內(nèi)有COX-1和COX-2兩種形式，COX-1是PLT固有的[3]。盡管阿司匹林有明顯的益處，但在最佳劑量和阿司匹林抵抗問(wèn)題上仍存爭(zhēng)議[4]。隨著對(duì)抗血小板聚集藥物研究的不斷深入，臨床面臨的主要問(wèn)題是確定抗血小板聚集藥物的療效和副作用的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞傳代

⑴將細(xì)胞取回后，放入37℃的培養(yǎng)箱中預(yù)溫1～2 h后再做處理，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。⑵吸光培養(yǎng)基，加入0.25%的胰蛋白酶液，37℃靜置5 min。⑶加1640培養(yǎng)基終止消化，吹打，懸浮細(xì)胞。⑷離心（1 000rpm，5 min），棄上清，加 1640培養(yǎng)基（10%FBS+1%PS+1%EGS），吹打沉淀，形成重懸細(xì)胞。⑸以1傳2或3接種于新培養(yǎng)瓶中，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞凍存

⑴待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，吸光培養(yǎng)基，加入0.25%的胰蛋白酶液，37℃靜置5 min。⑵加1640培養(yǎng)基終止消化，吹打，懸浮細(xì)胞。⑶離心（1 000rpm，5 min），棄上清，加培養(yǎng)基，吹打沉淀，形成重懸細(xì)胞，離心，棄上清。⑷加凍存液，重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管中，-80℃凍存盒過(guò)夜，第2天取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)（凍存液配制：10%DMSO，90%小牛血清）。

2.3 細(xì)胞復(fù)蘇

⑴從液氮容器中取出凍存管，迅速浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。⑵待融化后，立即從37℃水浴中取出凍存管，在安全柜中打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至含有10倍以上培養(yǎng)液的離心管中，混勻。⑶離心（1 000 rpm，5 min），棄去上清液，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。⑷次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 阿司匹林實(shí)驗(yàn)

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿司匹林對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖影響：⑴鋪96孔板，每孔8×103人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）。阿司匹林藥業(yè)的配制：800 mg阿司匹林加入1 L ddH2O中，混勻，得到的濃度為1600 mg/L，作為母液使用。分別稀釋成800mg/L，400mg/L備用。⑵第2天，處理細(xì)胞。藥物處理組稀釋藥物濃度后的阿司匹林加入100μL的96孔板中，使阿司匹林的終濃度為 800 mg/L，400 mg/L，200 mg/L，100 mg/L，處理4 d。不加入阿司匹林作為對(duì)照組。⑶處理4 d后，加入10μL CCK-8至96孔板中，37℃反應(yīng)4 h左右，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度。阿司匹林對(duì)HUVEC細(xì)胞有明顯的增殖作用，在400 mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的增殖能力達(dá)到最大。

2.5 測(cè)序樣本的處理

⑴將HUVEC消化，計(jì)數(shù)，用1640培養(yǎng)基（10%FBS+1%PS+1%EGS）稀釋，鋪平皿（60 mm平皿），每個(gè)平皿為2×105細(xì)胞。⑵第2天，加入阿司匹林使終濃度為400 mg/L，處理細(xì)胞4 d。對(duì)照組為加入完全培養(yǎng)基。⑶處理細(xì)胞4 d后收集細(xì)胞，加入1 mL TRizol，保存于-80℃。⑷待建庫(kù)及測(cè)序。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 RNA的提取

收獲孵育后的細(xì)胞，RNAs用Trizol(Invitrogen Carlsbad,CA)提取。然后，RNA采用2%瓊脂糖凝膠電泳與Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行驗(yàn)證，RNA純度根據(jù)在260 nm和280 nm吸光光度值，（ABS）驗(yàn)證（標(biāo)準(zhǔn)：abs260/ABS280＞1.8）。

3.2 CDNA文庫(kù)構(gòu)建與RNA測(cè)序

根據(jù)NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina 構(gòu)建 CDNA文庫(kù)（(Invitrogen,Carlsbad,CA)。首先，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增cDNA 12個(gè)周期循環(huán)。此后，構(gòu)建CDNA文庫(kù)。利用IlluminaHiSeq2500測(cè)序儀進(jìn)行RNA測(cè)序(Illumina,San Diego,CA,USA)。參數(shù)設(shè)置如下：模式，HiSeq 2500 V4 100 PE；策略、雙末端測(cè)序；讀長(zhǎng)，125 nt；數(shù)據(jù)大?。? G。

3.3 讀取濾過(guò)數(shù)據(jù)和成圖

原始的讀取數(shù)據(jù)包含一些低質(zhì)量的讀取數(shù)據(jù)，其20%或更多的堿基對(duì)質(zhì)量評(píng)估得分小于20。因此，用NGS QC Toolkit(Patel and Jain 2012)重新讀取數(shù)據(jù)，產(chǎn)生無(wú)異質(zhì)的讀取數(shù)據(jù)。然后，利用TopHat2 tool(Kim et al.2013)對(duì)比參考人類基因組（hg19）用 Bno-mixed模式進(jìn)行數(shù)據(jù)成圖，并從加州大學(xué)克魯茲的網(wǎng)站下載RefSeq注釋文件讀取數(shù)據(jù)。

3.4 微分表達(dá)分析和聚類分析

基因的差異表達(dá)被定義為差異表達(dá)基因（DEGS）。為了確定阿司匹林組和對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因，用Cuffdiff softwar(Trapnell et al.2012)對(duì)計(jì)算得到的差異表達(dá)基因值進(jìn)行分析，這項(xiàng)分析的標(biāo)準(zhǔn)為P值＜0.05，log2中心性介數(shù)（FC）＞0.58。為了確定阿司匹林組和對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因的特異性，用pheatmap軟件執(zhí)行雙向聚類分析(Kolde 2012)。也用Euclidean distances相似模式進(jìn)行聚類分析差異基因表達(dá)(Deza 2009)。

3.5 通路富集分析

為了確定差異表達(dá)基因的生物學(xué)通路，采用GOFunction package(Wang et al.2012)，通路富集分析。注釋文件設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)：基因計(jì)數(shù)≥2和P值＜0.05。

3.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)

構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)：相關(guān)的差異表達(dá)基因是從 STRINGdatabase(Franceschini et al.2013)提取，選擇PPIs結(jié)合評(píng)分＞0.7。然后，利用Cytoscape軟件(Smoot et al.2011)構(gòu)建，并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

3.7 差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子分析

基于TRED database (Jiang et al.2007)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行確定，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子目標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape software將其可視化。

3.8 外顯子的使用和選擇性剪接

為了找出阿司匹林組與對(duì)照組的差異表達(dá)外顯子，使用軟件包DexSeqsoftwarepackage(Anders et al.2012)進(jìn)行外顯子應(yīng)用分析。標(biāo)準(zhǔn)：生物傳導(dǎo)的錯(cuò)誤發(fā)生率＜0.1。此后，對(duì)比阿司匹林組與對(duì)照組的HUVECs，確定相應(yīng)的選擇性剪接事件。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 目標(biāo)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

紅圈的節(jié)點(diǎn)代表差異表達(dá)基因阿司匹林組上調(diào)，綠色圓圈代表節(jié)點(diǎn)度下調(diào)阿司匹林組，和黃色的鉆石節(jié)點(diǎn)代表轉(zhuǎn)錄因子。某一節(jié)點(diǎn)的大小與該節(jié)點(diǎn)的度呈正相關(guān)。阿司匹林組與對(duì)照組間的基因差異表達(dá)。

4.2 通路富集分析

差異表達(dá)基因顯著富集于11條通路（P值＜0.05和基因計(jì)數(shù)≥2），而這些途徑主要與細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號(hào)粘著相關(guān)。主要通路為細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptorinteraction），ECM 受體相互作用（ECM-receptor interaction），類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis），粘著（Focal adhesion），補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián) （Complement and coagulation cascades），軸突指導(dǎo) （Axon guidance），瘧疾（Malaria），趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Chemokine signaling pathway），糖胺聚糖合成硫酸軟骨素（Glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate），粘蛋白型O-聚糖的生物合成（Mucin type O-glycan biosynthesis）及RIG-I樣受體信號(hào)通路。通路富集分析，差異表達(dá)基因顯著富集于11條通路（P值＜0.05和基因計(jì)數(shù)≥2）

5 結(jié)論

⑴篩選出119個(gè)差異表達(dá)基因（DEGS）識(shí)別于阿司匹林組和對(duì)照組之間，發(fā)現(xiàn)它們都富集在與細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號(hào)相關(guān)的11條通路上。⑵構(gòu)建阿司匹林刺激下的差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)ISG15和MX1是關(guān)鍵樞紐性差異表達(dá)基因。構(gòu)建差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（TFS）發(fā)現(xiàn)CCL2和FN1（樞紐中心性表達(dá)基因）受NFKB1和RELA共同調(diào)節(jié)（樞紐性轉(zhuǎn)錄因子TFS）。⑶分析外顯子的使用和選擇性剪接發(fā)現(xiàn)在阿司匹林刺激下ADORA2A剪接發(fā)生改變。阿司匹林可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，可能通過(guò)調(diào)節(jié) ISG15，MX1，CCL2，F(xiàn)N1 以及 ADORA2A 的表達(dá)來(lái)參與血管生成過(guò)程。

圖1 阿司匹林組與對(duì)照組之間的基因差異表達(dá)

表1 差異表達(dá)基因通路富集分析

6 討論

本文首先對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)化處理，篩選差異表達(dá)基因；再對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，獲取差異基因影響的生物學(xué)通路信息；然后對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，查看差異基因之間的互作關(guān)系并給出與其他差異基因互作較多的差異基因；對(duì)差異基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析；對(duì)序列比對(duì)文件進(jìn)行外顯子使用分析，篩選阿司匹林可能引起的基因選擇性剪接。在體外，阿司匹林可誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖和遷移，并且促進(jìn)血管形成，有益于腦卒中后功能恢復(fù)[5](Yin et al.2007)。然而，相應(yīng)的機(jī)制還沒(méi)有得到清楚的理解，特別是在轉(zhuǎn)錄因子目標(biāo)調(diào)節(jié)和選擇性剪接方面。在這項(xiàng)研究中，使用和未使用阿司匹林處理過(guò)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。測(cè)定結(jié)果，像ISG15和Mx1這些差異表達(dá)基因（DEGs）在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)有高度的表達(dá)，CCL2和 FN1這些差異性表達(dá)基因被NFKB1和 RELA共同調(diào)解。此外選擇性剪切差異表達(dá)基因ADORA2被確定[6]。在以上的DEGs差異性表達(dá)基因中，ISG15編碼的干擾素刺激基因15，對(duì)炎癥介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化及心血管疾病起作用。在阿司匹林刺激下，在HUVECs中ISG15和MX1表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明阿司匹林可能通過(guò)調(diào)節(jié)ISG15和MX1的表達(dá)影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。編碼的趨化因子配體2（C-C配型），CCL2被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞因子及其受體相互作用和趨化因子的信號(hào)通路[7]。推測(cè)阿司匹林可能通過(guò)調(diào)節(jié)FN1的表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，阿司匹林可能通過(guò)調(diào)節(jié)ISG15和MX1的表達(dá)影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，影響趨化因子信號(hào)通路通過(guò)，調(diào)節(jié)CCL2和FN1表達(dá)后的增殖和遷移，通過(guò)調(diào)節(jié)剪接表達(dá)ADORA2A促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[8]。雖然更多的研究仍然需要驗(yàn)證這些預(yù)測(cè)，這項(xiàng)研究的結(jié)果可能為進(jìn)一步研究阿司匹林刺激背后的響應(yīng)機(jī)制提供方向。此外，這些結(jié)果可能為臨床使用阿司匹林恢復(fù)中風(fēng)后功能提供基礎(chǔ)知識(shí)。此外，未來(lái)的研究將更加關(guān)注本研究確定的差異性基因表達(dá)和選擇性剪接。提示阿司匹林不僅能抗血小板聚集，預(yù)防血栓形成，而且有促進(jìn)血管內(nèi)皮因子生成的作用，可以上調(diào)相關(guān)血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，從而增加缺血部位的側(cè)支循環(huán)，改善供血及預(yù)防血管狹窄、血栓形成[9]。在臨床治療血管疾病應(yīng)用中，阿司匹林極其便捷，且價(jià)格便宜，臨床應(yīng)用前景廣泛。

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