特異的隱藻藻膽蛋白的性質(zhì)及存在狀態(tài)

陳 敏, 楊多利, 李雪薇

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

特異的隱藻藻膽蛋白的性質(zhì)及存在狀態(tài)

陳 敏, 楊多利, 李雪薇

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

隱藻藻膽蛋白繼承自紅藻, 但其蛋白和色基結(jié)構(gòu)、組成、性質(zhì)、在葉綠體中的存在部位等方面都與報(bào)道較多的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白不同, 是藻膽蛋白中較為特異的一個(gè)進(jìn)化分支。目前對(duì)隱藻藻膽蛋白的了解比紅、藍(lán)藻藻膽蛋白要少得多, 且各種報(bào)道之間存在差異甚至矛盾之處。本文從隱藻藻膽蛋白的生化特性、聚合形式和在類囊體膜腔中的存在狀態(tài)等方面入手, 對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的隱藻藻膽蛋白的研究近況做了綜述和分析, 并就存在的問題和解決方法做了討論。

隱藻; 藻膽蛋白; 生化特性; 聚合; 膜腔定位

藻膽蛋白(phycobilinprotein, PBP)是由開鏈四吡咯結(jié)構(gòu)色基與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成的色素蛋白復(fù)合物, 在光合作用過程中承擔(dān)著吸收和傳遞光能的重任, 是重要的捕光天線蛋白。同時(shí)不同藻膽蛋白具有各自獨(dú)特的熒光特性和很高的熒光量子產(chǎn)率[1], 因此, 在理論研究和應(yīng)用方面都具有重要的意義。

目前發(fā)現(xiàn)的藻膽蛋白存在于紅藻、藍(lán)藻以及部分隱藻和甲藻4類光合藻類中。其中隱藻(cryptophytes)是由真核紅藻經(jīng)二次內(nèi)共生產(chǎn)生的單細(xì)胞真核藻類[2-3], 但其光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和組成特殊, 除了類囊體膜上存在著由葉綠素Chla、Chlc和膜蛋白組裝形成的脂溶性光合系統(tǒng)外, 在部分種屬中還含有水溶性的藻膽蛋白。與其他3種來源的藻膽蛋白不同, 隱藻藻膽蛋白不形成藻膽體, 存在部位也非附著于類囊體膜外表面, 而是在類囊體膜腔內(nèi)部[4], 是藻膽蛋白家族中十分特殊的一類[5]。

對(duì)于紅、藍(lán)藻中的藻膽蛋白以及組裝而成的藻膽體的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能等已有相當(dāng)透徹的研究[6-9]。相較而言, 對(duì)隱藻藻膽蛋白的了解要少得多, 尤其在隱藻藻膽蛋白的亞基組成、組裝方式、細(xì)胞定位以及能量傳遞方式等方面, 還存在諸多不確定甚至矛盾之處, 而這些方面正是了解隱藻光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化的重要基礎(chǔ)。有關(guān)隱藻藻膽蛋白結(jié)構(gòu)和能量傳遞等問題, 已在陳敏等[10]一文中給予了綜述。本文就隱藻藻膽蛋白的生化性質(zhì)、聚合形式以及葉綠體內(nèi)的定位等方面, 對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的隱藻藻膽蛋白的研究近況做了綜述和分析, 旨在為今后深入了解隱藻藻膽蛋白及其特殊的光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能研究理清思路。

1 隱藻藻膽蛋白的種類和基本結(jié)構(gòu)組成

目前已報(bào)道的隱藻藻膽蛋白共有8種[10-11], 其中3種屬于隱藻藻紅蛋白(cryptophytic phycoerythrin, Cr-PE), 根據(jù)最大吸收不同被分別稱作PE545、PE555、PE566; 其余5種為隱藻藻藍(lán)蛋白(cryptophytic phycocyanin, Cr-PC), 分別為PC570 (或PC569)、PC577、PC612、PC630和PC645。在隱藻中沒有發(fā)現(xiàn)別藻藍(lán)蛋白(allophcocyanin, APC)或藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin, PEC)。

隱藻藻膽蛋白至少含有兩種α亞基和一種β亞基, 其中α1亞基分子質(zhì)量約10 kDa; α2亞基大小只有紅、藍(lán)藻藻膽蛋白亞基的一半左右, 約8～9 kDa; 而β亞基約為18～20 kDa, 與紅、藍(lán)藻藻膽蛋白相似[12-15]。隱藻藻膽蛋白通常以穩(wěn)定的(α1β)(α2β)異二聚體形式存在, 而非紅、藍(lán)藻的藻膽蛋白的三聚體(αβ)3或六聚體(αβ)6。但2011年Zhang等[16]報(bào)道藍(lán)隱藻(Chroomonas placoidea)的PC645可能存在一種分子質(zhì)量為15～18 kDa的新的發(fā)光β亞基(命名為β2, 而將已報(bào)道的β亞基稱為β1), 只是目前還沒有給出該亞基的全序列, 因而性質(zhì)還有待于進(jìn)一步的確定。

2 隱藻藻膽蛋白特性

隱藻藻膽蛋白是一類熒光蛋白, 可能屬于膜外周蛋白, 也可能是游離的水溶性蛋白, 或者兩種形式都存在, 目前不能確定。對(duì)其生化特性進(jìn)行研究是了解藻膽蛋白結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ), 也是走向應(yīng)用的重要前提條件。

2.1 光譜特性

藻膽蛋白含有各種共價(jià)結(jié)合的藻膽素色基, 因而其吸收和熒光特性成為表征藻膽蛋白特性的重要指標(biāo)。隱藻藻膽蛋白的開鏈四吡咯色基與脫輔基蛋白之間一般以1個(gè)或2個(gè)硫醚鍵共價(jià)結(jié)合。目前在隱藻中發(fā)現(xiàn)有7種藻膽素[10,13,17-23]。其中藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin, PCB)、藻紅膽素(phycoerythrobilin, PEB)、藻尿膽素(phycourobilin, PUB)和15, 16-二氫膽綠素(15, 16-dihydrobiliverdin, DBV)4種同樣存在于紅、藍(lán)藻中, 而另外3種為隱藻所特有, 其中膽綠素(mesobiliverdin, MBV, Amax697 nm)已有明確報(bào)道,但CB618(有報(bào)道為CB596, Amax618 nm或596 nm)、CB584(Amax584 nm)兩種色基目前還有不確定之處。

由于通常藻膽蛋白處于溶液中時(shí), 其亞基性質(zhì)、聚合狀態(tài)甚至色基狀態(tài)均會(huì)受藻膽蛋白的種類、濃度、溶液離子強(qiáng)度、pH、溫度等條件影響, 因而呈現(xiàn)的光譜特性會(huì)有所變化。表1總結(jié)并列出了全部8種隱藻藻膽蛋白在特定pH條件下典型的吸收及熒光光譜特性。

表1 隱藻藻膽蛋白光譜特性Tab. 1 Spectroscopic properties of crypotomonad phycobiliproteins

2.2 疏水特性

現(xiàn)有的研究表明, 沉淀隱藻藻膽蛋白普遍需要很寬的硫酸銨飽和度范圍[12,16,25]。PC645可在60%～100%硫銨飽和度時(shí)被分步沉淀下來[10,15,33], 顯然這些沉淀物的水溶性是不同的。說明隱藻藻膽蛋白在水溶液中可形成疏水特性不同的多種形式。只是這些不同形式的沉淀物并未表現(xiàn)出明顯的光譜特性的差異[15]。由于一種隱藻通常只含有一種藻膽蛋白[27], 因此推測(cè)不同PC645沉淀物疏水性的差異有可能和蛋白的聚合程度不同有關(guān), 也可能與亞基比例或者種類不同有關(guān)。但目前有關(guān)隱藻藻膽蛋白的聚合度問題, 尚沒有相關(guān)的報(bào)道, 因此這一推論是否正確還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

2.3 構(gòu)象穩(wěn)定性

由于藻膽蛋白在可見光區(qū)和近紫外區(qū)都有明顯的特征吸收甚至熒光發(fā)射, 其色基作為一個(gè)天然內(nèi)標(biāo), 與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合狀態(tài)以及蛋白質(zhì)所處的內(nèi)部微環(huán)境的微小變化, 都可以在其光譜性質(zhì)上呈現(xiàn)出很靈敏的反映, 因此成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的良好材料。

目前, 借助pH變化、加入去污劑或者變性劑等,改變?cè)迥懙鞍兹芤涵h(huán)境, 同步監(jiān)測(cè)吸收、熒光或圓二色譜(CD譜)等的變化, 對(duì)多種隱藻藻膽蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性和柔性進(jìn)行了分析。MacColl等[34]報(bào)道了溫度變化對(duì)隱藻藻膽蛋白構(gòu)象的影響, 認(rèn)為低溫情況下更有利于隱藻藻膽蛋白的穩(wěn)定: 在10～20℃, PE545和PC645都保持二聚體狀態(tài), 吸收譜、熒光譜和圓二色譜穩(wěn)定; 40～50℃時(shí), 藻膽蛋白形成單體和二聚體混合形式; 50℃以上PE545光譜出現(xiàn)不可逆變化; 60℃以上時(shí)PC645完全變性。隱藻PC645和PE566在pH4條件下或者加入0.3 mol/L以上濃度的NaSCN時(shí), 藻膽蛋白異二聚體可解聚為單體, 但是吸收、熒光性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)都沒有明顯變化, 只在CD譜的可見光區(qū)有所反映; 當(dāng)回復(fù)到pH6時(shí), 單體還可以恢復(fù)二聚體狀態(tài)[35]。李文軍等[36]以藍(lán)隱藻(C. placoidea) PC645為材料的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明, PC645的構(gòu)象在3 mol/L濃度的尿素中變性24 h基本保持穩(wěn)定, 光譜特性沒有質(zhì)的變化。除去尿素后, 可在2h內(nèi)基本復(fù)性。同時(shí), PC645在很寬的pH 范圍(pH 3.5～10)表現(xiàn)出構(gòu)象與功能對(duì)環(huán)境變化的高度適應(yīng)性[36]: 蛋白在pH 3.5～7時(shí), 吸收和熒光光譜都比較穩(wěn)定, 顯示蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能在此區(qū)域都保持正常; 而在pH 7～10時(shí)光吸收依然保持平穩(wěn), 說明亞基內(nèi)部的色基的狀態(tài)和疏水微環(huán)境都沒有改變, 但熒光傳遞效率降低, 可能是由亞基表面局部構(gòu)象變化、解離(四級(jí)結(jié)構(gòu)變化)或者色素基團(tuán)間的空間距離變化引起。

隱藻屬于深水藻類, 藻膽蛋白對(duì)10～20℃低溫的適應(yīng)與隱藻所處的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。而PC645在酸性條件下比堿性時(shí)更穩(wěn)定, 則與隱藻藻膽蛋白所處的特殊生理環(huán)境有關(guān)。隱藻藻膽蛋白處于類囊體腔內(nèi), 不像紅、藍(lán)藻藻膽蛋白附著在類囊體膜的外表面,與葉綠體基質(zhì)相接觸。在光合作用的光反應(yīng)過程中,光驅(qū)動(dòng)電子傳遞的結(jié)果使葉綠體基質(zhì)pH升高, 而類囊體腔則逐步酸化, 所以對(duì)于隱藻藻膽蛋白而言, 在酸性條件下維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是保證其功能的前提。

2.4 亞基等電點(diǎn)與表面電荷特性

藻膽蛋白亞基的等電點(diǎn)及酸堿性可反映其表面電荷的數(shù)量和分布, 后者直接影響到亞基之間組裝方式和相互作用面。紅、藍(lán)藻藻膽蛋白的亞基通常為中性或微酸性的, pI大多在5.5～7之間[12], 由堿性的連接多肽(pI為8～9)通過靜電引力等連接組裝成為結(jié)構(gòu)精細(xì)的超分子復(fù)合物[7,37]。而隱藻藻膽蛋白的亞基等電點(diǎn)分布則跨度較大[38]。氨基酸序列分析[12]和核酸序列推測(cè)[39]均證實(shí)隱藻藻膽蛋白的β亞基與紅、藍(lán)藻藻膽蛋白α、β亞基的氨基酸序列相似性[40], 且其pI值也分布在微酸性區(qū)(pI 5.7～6.0)[15]; 但兩個(gè)α亞基均含有大量的帶電氨基酸[13], PC645的兩個(gè)α亞基的pI值分別為9.1和7.1[15], 說明其亞基表面電荷分布存在巨大差異。其中強(qiáng)堿性的α1亞基(pI 9.1)大小約10kDa極為特別, 等電點(diǎn)與紅、藍(lán)藻連接多肽相似, 甚至更偏于堿性, 它的存在可使酸性的β亞基與其產(chǎn)生強(qiáng)烈的電荷相互作用, 幫助穩(wěn)定(αβ)單體的結(jié)構(gòu)。以上等電點(diǎn)特性研究表明, 靜電引力在隱藻藻膽蛋白亞基相互作用方面很可能起到至關(guān)重要的作用, 其中α1亞基的作用更為突出, 此結(jié)論在PE545晶體結(jié)構(gòu)分析中得到了證實(shí)[32,41]。

2.5 隱藻藻膽蛋白的組裝

2.5.1 異二聚體內(nèi)部的亞基組裝

目前對(duì)隱藻藻膽蛋白亞基組裝的信息主要來自兩個(gè)方面, 一是晶體結(jié)構(gòu)解析, 二是圓二色譜研究。結(jié)果顯示, 隱藻藻膽蛋白的異二聚體狀態(tài)是極為穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)形式, 通常不解離為游離的(αβ)單體或α、β亞基形式[34-35,42]。據(jù)報(bào)道, 隱藻藻膽蛋白的單體可以所謂開放式和閉合式兩種方式組裝成異二聚體空間結(jié)構(gòu)[42]。開放式的PE555和PC612異二聚體內(nèi)部每個(gè)單體的亞基接觸面積平均為618 ?2和511 ?2, 而閉合式的PE545和PC645更是達(dá)到了1060 ?2和1230 ?2, 說明亞基之間的結(jié)合相當(dāng)牢固[41-43]。此外, 異二聚體中的兩個(gè)(αβ)單體之間的結(jié)合可能主要依靠α亞基, 而β亞基的脫輔基蛋白之間幾乎沒有接觸[41]。但由于兩個(gè)α亞基pI值明顯不同, 尤其是α1亞基的脫輔基蛋白僅比α2多10個(gè)氨基酸殘基,但等電點(diǎn)相差2個(gè)pH單位, 因此堿性較強(qiáng)的α1與近中性的α2在藻膽蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)定過程中可能承擔(dān)著不完全相同的任務(wù)。此外, 與已報(bào)道的β1亞基(pI6.0)相比, 新發(fā)現(xiàn)的β2亞基等電點(diǎn)更低(pI＜5.7)[15], 所以推測(cè), 異二聚體內(nèi)部的2個(gè)β亞基在結(jié)構(gòu)和功能上有可能也是不相同的。

2.5.2 隱藻藻膽蛋白的聚合

隱藻中沒有發(fā)現(xiàn)APC或PEC, 而且每種隱藻只含有一種類型的藻膽蛋白, 因此隱藻藻膽蛋白不可能組裝形成和紅、藍(lán)藻膽蛋白類似的復(fù)雜的藻膽體結(jié)構(gòu)。目前對(duì)隱藻藻膽蛋白的研究多集中于異二聚體或更小的單體形式, 幾乎未有隱藻藻膽蛋白聚合或者組裝的報(bào)道。至于是否存在類似藻膽體中的連接多肽, 也沒有明確的結(jié)論。Lichtlé等[29]從隱藻(C. rufescens)中分離到的富含PE超離心組分中含有兩種高分子質(zhì)量無色多肽(97和87 kDa), 由于分子質(zhì)量與藻膽體的末端發(fā)射體LCM相似, 當(dāng)時(shí)曾猜測(cè)是某種幫助PE錨定于膜上的連接多肽, 只是此后沒再有明確相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道過類似多肽的存在。

3 隱藻藻膽蛋白在類囊體腔中的存在狀態(tài)

隱藻藻膽蛋白與紅、藍(lán)藻藻膽蛋白最突出的差別是隱藻藻膽蛋白存在部位是類囊體腔內(nèi)部, 有人曾懷疑這一現(xiàn)象是否因隱藻的類囊體在進(jìn)化過程中內(nèi)外翻轉(zhuǎn)造成的。但Spear-Bernsteinl等[44]使用電鏡觀察經(jīng)冰凍撕裂及蝕刻處理的隱藻R. lens類囊體膜,證實(shí)其膜上光合系統(tǒng)的排布與其他藻類及綠色植物完全相同, 膜沒有翻轉(zhuǎn)的痕跡。長(zhǎng)期以來, 藻膽蛋白在隱藻類囊體膜腔內(nèi)的實(shí)際存在狀況頗受關(guān)注, 但目前得到的結(jié)果不一而足, 無法定論。

目前對(duì)隱藻藻膽蛋白定位研究主要針對(duì)含有PE545的隱藻類型, 含有其他藻膽蛋白類型的未見有報(bào)道。Ludwig等[45]采用免疫顯微標(biāo)記法對(duì)隱藻R. lens的類囊體膜的觀察結(jié)果顯示, PE545是緊密結(jié)合在類囊體膜的內(nèi)表面上, 在膜腔中偶然會(huì)觀察到有棒狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn); Lichtlé等[46]早期以Cryptomonasrufescens的生化分離和光譜學(xué)研究結(jié)果為依據(jù)提出的簡(jiǎn)要模型(圖1)認(rèn)為, PE545是以某種方式組裝并橫跨膜腔內(nèi)部, 邊緣只與光合系統(tǒng)(PS)II天線接觸, 該模型實(shí)際上暗示了藻膽蛋白應(yīng)有聚合或組裝形式存在; 但后期采用免疫顯微觀察后又提出, 在C.rufescens類囊體膜腔內(nèi)的PE545有兩種形式, 一是與膜結(jié)合的,另一類以游離狀態(tài)散布在膜腔中[47]; Spear-Bernstein等[48-49]也報(bào)道隱藻藻膽蛋白大部分是散布于膜腔內(nèi),有少部分與膜結(jié)合; 1992年Vesk等[50]采用了多種方法, 包括生化分離、固定化及免疫細(xì)胞化學(xué)方法等試圖對(duì)PE545進(jìn)行定位, 但他們得出的結(jié)論是, 上述方法均無法確定PE545是與膜結(jié)合還是散布在膜腔中; 2006年Doust等[32]和Wit等[51]在對(duì)隱藻PE545晶體結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上, 結(jié)合活體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨光譜以及圓二色譜等光譜學(xué)研究結(jié)果[22,25,32,41,51],提出了一個(gè)新的模型, 如圖2所示。由于PE545晶體呈斜方形[41,51], 因而該模型認(rèn)為PE545可能是以斜方形狀態(tài)游離、密集地填充于類囊體腔中, 并暗示PE545異二聚體是最小的、獨(dú)立的存在單元。首次提出PE545彼此之間以及PE545與類囊體膜之間都沒有傾向性的結(jié)合關(guān)系, 因?yàn)楦鶕?jù)他們的計(jì)算, PE545與膜的結(jié)合對(duì)于實(shí)現(xiàn)PE545與膜上葉綠素蛋白復(fù)合物之間有效的能量傳遞來說不是必需的。

圖1 藻膽蛋白與C. rufescens類囊體膜葉綠素蛋白相互作用簡(jiǎn)圖[46]Fig. 2 Schematic interpretation of the phycobiliprotein and chlorophyll antennae in the thylakoid of Cryptomonas rufescens[46](A1和A2: PSⅠ和PSⅡ的葉綠素天線)(A1and A2: chlorophyll antennae of PSI and PSⅡ)

圖2 隱藻光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模型[32]Fig. 2 Scaled model of photosynthesis systems in cryptophytic algae[32](類囊體腔中斜方體為PE545; OEC: 放氧復(fù)合物; b6f: 細(xì)胞色素b6f復(fù)合物)[Rhombic forms inside the lumen are PE545, oxygen-evolving complex (OEC), and cytochrome b6f complex (b6f)]

歸納以上研究結(jié)果, 對(duì)于隱藻藻膽蛋白在類囊體膜腔中的定位的關(guān)鍵是與膜是否有接觸, 兩類觀點(diǎn)各有實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。Hiller等[22]的圓二色譜研究結(jié)果認(rèn)為藻膽蛋白在膜腔內(nèi)是非定向排列的, 暗示其處于游離狀態(tài); Doust等[25]提出游離PE545能量傳遞模式來解釋其最新的隱藻光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模型, 支持膜不接觸觀點(diǎn)。提出離散的藻膽蛋白可在非接觸情況下以F?ster共振方式有效地將吸收的能量在彼此之間傳遞, 并最終傳遞給位于類囊體膜上的Chla[25]。只是根據(jù)該模型進(jìn)行計(jì)算, 其能量傳遞速率較之活體狀態(tài)慢得多[32,52]。

更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持隱藻藻膽蛋白在結(jié)構(gòu)上與膜組分處于結(jié)合狀態(tài)的觀點(diǎn)。電鏡分析直接觀察到至少有一部PE545是結(jié)合在類囊體膜的內(nèi)表面的[45-49]; Lichtlé等[29]曾經(jīng)報(bào)道借助蔗糖密度梯度離心方法從C. rufescens中分離到一種活性的PE-葉黃素-PSⅡ復(fù)合物組分; Chen等[53]則采用等電聚焦電泳法從藍(lán)隱藻(C. placoidea)中分離到一種特殊的PC-Chla/c2-蛋白復(fù)合物, 并且該復(fù)合物中PC645吸收的能量可直接傳遞給復(fù)合物內(nèi)的Chla; Chen等[53]以及徐偉[54]等均報(bào)道在充分洗滌的藍(lán)隱藻(C. placoidea)類囊體膜上緊密結(jié)合有PC645, 后者與膜上的Chla之間存在能量傳遞關(guān)系。這些結(jié)果說明, 隱藻藻膽蛋白在結(jié)構(gòu)上是與膜上的PSⅡ或者Chla/c-蛋白復(fù)合物直接相結(jié)合的,通過與膜組分接觸實(shí)現(xiàn)能量傳遞。此外, Mirkovic等[55]借助光漂白熒光恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)和共聚焦顯微方法觀測(cè)了R. CS24活體細(xì)胞中的PE545的擴(kuò)散情況, 發(fā)現(xiàn)該隱藻中大部分(73%)的天線蛋白在類囊體腔中是移動(dòng)狀態(tài)的, 但是平均擴(kuò)散系數(shù)比在水中理論擴(kuò)散速率小兩個(gè)數(shù)量級(jí), 與藻膽體的擴(kuò)散能力相接近。進(jìn)而提出PE545在膜腔中遷移時(shí)是受到了某種限制的, 受限的原因可能與PE545與膜相互作用或者蛋白聚合有關(guān)。

4 隱藻藻膽蛋白性質(zhì)和存在狀態(tài)研究方面有待闡明的問題

目前對(duì)已發(fā)現(xiàn)的全部8種隱藻藻膽蛋白的生理生化特性研究, 目前已取得了大量的研究結(jié)果。在結(jié)構(gòu)與功能研究方面, 雖都有涉及, 但了解程度不一。其中PE545(最高分辨率1.63 ?)[25,41]、PE555(分辨率1.8 ?)[42]、PC577[56]、PC612(分辨率1.7 ?)[42,56]、PC630[56]和PC645(最高分辨率1.35 ?)[25,42,57]6種已有晶體結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)解析的報(bào)道, 而對(duì)PE566、PE570的了解則比較有限。此外, 借助穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨光譜[25,41,57-60]以及二維光子反射光譜技術(shù)[56,61-65]等研究手段對(duì)PE545、PE555和PC577、PC612、PC630、PC645異二聚體內(nèi)部能量傳遞途徑等方面也取得了一定的進(jìn)展。但由于對(duì)隱藻藻膽蛋白的性質(zhì)和在內(nèi)囊體腔內(nèi)的存在狀態(tài)等方面仍有諸多待解之處, 因此必然影響到對(duì)其整個(gè)光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和工作原理, 尤其是與膜上脂溶性葉綠素蛋白復(fù)合物之間能量的傳遞方式等的認(rèn)識(shí), 許多實(shí)驗(yàn)結(jié)論依然有待修正和補(bǔ)充。

目前有關(guān)隱藻藻膽蛋白特性、組裝和在類囊體腔中存在狀態(tài)方面的已取得的認(rèn)識(shí)和爭(zhēng)議之處主要有以下幾個(gè)方面。

4.1 異二聚體的亞基種類及均一性問題

盡管目前一般認(rèn)為, 隱藻異二聚體形式只有(α1β)(α2β)一種, 但隱藻PC645中新的β2亞基的發(fā)現(xiàn),意味著隱藻異二聚體形式未必都是單一的形式。曾有報(bào)道稱PC645在加入去污劑的情況下可形成三角形和斜方對(duì)稱形兩種非同型晶體, 進(jìn)而提出為隱藻藻膽蛋白的可能是不均一的觀點(diǎn)[66]。因此, 隱藻藻膽蛋白異二聚體種類問題還有待確定, 進(jìn)一步的晶體解析以及基因結(jié)構(gòu)分析將有助于問題的闡明。

4.2 隱藻藻膽蛋白的聚合和組裝問題

目前對(duì)隱藻藻膽蛋白的研究, 大多以游離的異二聚體或者更小的單體為對(duì)象, 而對(duì)于異二聚體之間的進(jìn)一步組裝問題則尚無定論。盡管已經(jīng)明確隱藻藻膽蛋白不形成藻膽體樣結(jié)構(gòu), 但對(duì)于其是否存在進(jìn)一步組裝之后的聚合形式, 如果存在的話在什么條件下以何種方式聚合, 聚合物是否像紅、藍(lán)藻藻膽蛋白那樣存在連接多肽, 亦或隱藻某個(gè)亞基(例如堿性的α1亞基)是否起到與紅、藍(lán)藻連接多肽相似的作用等均有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Doust等[25,51]認(rèn)為隱藻藻膽蛋白亞基不傾向于進(jìn)一步聚合; 但也有報(bào)道提出隱藻藻膽蛋白存在多種不同的形式[19]; 還可能存在聚合程度更高的藻膽蛋白復(fù)合物(實(shí)驗(yàn)室未報(bào)道結(jié)果); 甚至有可能存在棒狀結(jié)構(gòu)[45,55]。因此, 如何分離和獲得可能存在的天然狀態(tài)的藻膽蛋白復(fù)合物, 以及對(duì)已取得的溶液中不同形式藻膽蛋白的深入比較, 可能會(huì)對(duì)隱藻藻膽蛋白聚合或者組裝問題的認(rèn)識(shí)帶來一些突破性信息。

4.3 類囊體膜內(nèi)的定位及與類囊體膜的關(guān)系問題

隱藻藻膽蛋白在膜腔內(nèi)的存在狀態(tài)及其與膜上葉綠素蛋白之間的接觸機(jī)制問題, 是了解特異的隱藻光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和工作原理的關(guān)鍵。目前報(bào)道中隱藻藻膽蛋白與膜的接觸關(guān)系總結(jié)起來主要分為以下幾種: 緊密結(jié)合在類囊體膜的內(nèi)表面上; 一部分與膜結(jié)合, 其余游離或者散布在類囊體腔中; 以某種方式結(jié)合并橫跨膜腔內(nèi)部, 邊緣與膜接觸; 均勻地填充于類囊體腔中, 不需與膜結(jié)合。綜合上述情況,我們提出了一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)合模型[54], 即藻膽蛋白在類囊體腔中與膜的結(jié)合狀態(tài)有可能是動(dòng)態(tài)的, 具有膜結(jié)合型和游離型兩種狀態(tài), 兩者之間可借助小幅度的遷移實(shí)現(xiàn)互變, 至于與膜結(jié)合與否可能與其所處的環(huán)境和功能狀態(tài)有關(guān)。這一模型是否正確, 將有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

由于隱藻藻膽蛋白沒有如藻膽體那樣體積較大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、便于觀察的組裝后結(jié)構(gòu)形式, 同時(shí)在膜腔中還處于游離或遷移狀態(tài), 因此一般的免疫電鏡觀測(cè)結(jié)果通常不理想或者比較片面, 而針對(duì)離體的藻膽蛋白的研究又無法反應(yīng)出活體狀態(tài)下的真實(shí)情況[32], 導(dǎo)致這方面研究結(jié)果始終沒有足夠說服力。因此, 在完整葉綠體水平上引進(jìn)熒光漂白技術(shù)觀察藻膽蛋白的動(dòng)態(tài)遷移, 或者借助原子力顯微(ATM)技術(shù)觀測(cè)保持天然狀態(tài)類囊體膜內(nèi)表面形態(tài), 對(duì)于進(jìn)一步了解隱藻藻膽蛋白在類囊體膜腔中的實(shí)際存在狀態(tài)將會(huì)大有助益。

[1] MacColl R, Kapoor S, Montellese D R, et al. Bilin chromophores as reporters of unique protein conformations of phycocyanin 645[J]. Biochemistry, 1996, 35(48): 15436-15439.

[2] Grzebyk D, Schofield O, Vetriani C, et al. The mesozoic radiation of eukaryotic algae: the portable plastid hypothesis [J]. J Phycol, 2003, 39: 259-267.

[3] Kim E, Lane C E, Curtis B A, et al. Complete sequence and analysis of the mitochondrial genome of Hemiselmis andersenii CCMP644 (Cryptophyceae) [J]. BMC Genomics, 2008, 9: 215-219.

[4] Gantt E, Edwards M R, Provasoli L. Chloroplast structure of the Cryptophyceae. Evidence for phycobiliproteins within intrathylakoidal spaces [J]. J Cell Biol, 1971, 48(2): 280-290.

[5] Glazer A N, Wedemayer G J. Cryptomonad biliproteins - an evolutionary perspective [J]. Photosynth Res, 1995, 46(1-2): 93-105.

[6] Chang L F, Liu X W, Li Y B, et al. Structural organization of an intact phycobilisome and its association with photosystem II [J]. Cell Res, 2015, 25: 726-737.

[7] Watanabe M, Semchonokc A D, Webber-Birungic M T, et al. Attachment of phycobilisomes in an antennaphotosystemI supercomplex of cyanobacteria[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(7): 2512-2517.

[8] Watanabe M, Ikeuchi M. Phycobilisome: architecture of a light-harvesting supercomplex[J]. Photosynth Res, 2013, 116(2-3): 265-276.

[9] Scholes G D, Fleming G R, Olaya-Castro A, et al. Lessons from nature about solar light harvesting[J]. Nat Chem, 2011, 3: 763-774.

[10] 陳敏, 王寧, 楊多利, 等.隱藻藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)與能量傳遞功能[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51(12): 2070-2082. Chen Min, Wang Ning, Yang Duoli, et al. The Structure and Energy Transfer of Phycobiliproteins in Cryptophytic Algae. [J].Plant Physiology Journal, 2015, 51(12): 2070-2082.

[11] Overkamp K E, Langklotz S, Aras M, et al. Chromophore composition of the phycobiliprotein Cr-PC577 from the cryptophyteHemiselmispacifica [J].Photosynth Res, 2014, 122(3): 293-304.

[12] Sidler W, Kumpf B, Suter F, et al. Structural studies on cryptomonad biliprotein subunits. Two different alpha-subunits in Chroomonas phycocyanin-645 and Cryptomonas phycoerythrin-545[J]. Biol Chem Hoppe Seyler, 1985, 366(3): 233-244.

[13] Sidler W, Nutt H, Kumpf B, et al. The complete amino-acid sequence and the phylogenetic origin of phycocyanin-645 from the cryptophytan alga Chroomonas sp.[J]. Biol Chem Hoppe-Seyler, 1990, 371(7): 537-547.

[14] MacColl R, Guard-Friar D. Phycocyanin 645. The chromophore assay of phycocyanin 645 from the cryptomonad protozoa Chroomonas species[J]. J Biol Chem, 1983, 258(23): 14327-14329.

[15] Overkamp K E, Gasper R, Kock K, er al. Insights into the biosynthesis and assembly of cryptophycean phycobiliprotein[J]. J Biol Chem, 2014, 289: 26691-26707.

[16] Zhang Y Y, Chen M, Cui H. Isolation and characterization of a new subunit of phycocyanin from Chroomonas placoidea[J]. Chin Chem Lett, 2011, 22(10): 1229-1232.

[17] Wedemayer G J, Kidd D G, Glazer A N . Cryptomonad biliproteins: bilin types and locations[J]. Photosynth Res, 1996, 48: 163-170.

[18] Wedemayer G J, Kidd D G, Wemmer D E, et al. Phycobilins of cryptophycean algae. Occurrence of dihydrobiliverdin and mesobiliverdin in cryptomonad biliproteins[J]. J Biol Chem, 1992, 267(11): 7315-7331.

[19] Wedemayer G J, Wemmer D E, Glazer A N. Phycobilins of cryptophycean algae. Structures of novel bilins with acryloyl substituents from phycoerythrin 566[J], J Biol Chem, 1991, 266: 4731-4741.

[20] Wemmer D E, Wedemayer G J, Glazer A N. Phycobilins of cryptophycean algae. Novel linkage of dihy-drobiliverdin in a phycoerythrin 555 and a phycocyanin 645[J], J Biol Chem, 1993, 268(3): 1658-1669.

[21] Hiller R G, Martin C D. Multiple forms of type I phycoerythrin from a Chroomonas sp. (Cryptophyceace) varying in subunit composition [J]. Biochim Biophys Acta, 1987, 923: 98-102.

[22] Hiller R G, Scaramuzzi C D, Breton J. The organisation of photosynthetic pigments in a cryptophyte alga: a linear dichroism study [J]. Biochim Biophys Acta, 1992, 1102(3): 360-364.

[23] MacColl R, Guard-Friar D, Ryan T J, et al. The route of exciton migration in phycocyanin 612 [J]. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1988, 934(3): 275-281.

[24] MacColl R, Guard-Friar D. Phycobiliproteins [M]. Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987.

[25] Doust A B, Marai C N J, Harrop S J, et al. Developing a structure-function model for the cryptophyte phycoerythrin 545 using ultrahigh resolution crystallography and ultrafast laser spectroscopy [J]. J Mol Biol, 2004, 344: 135-153.

[26] Guard-Friar, MacColl R, Berns D S, et al. Picosecond fluorescence of cryptomonad biliproteins. Effects of excitation intensity and the fluorescence decay times of phycocyanin 612, phycocyanin 645, and phycoerythrin 545 [J].Biophys J, 1985, 47(6): 787-793.

[27] Hill D R A, Rowan K S. The biliproteins of the cryptophyceae [J]. Phycologia, 1989, 28 (4): 455-463.

[28] Hoef-Emden K. Molecular phylogeny of phycocyanin-containing crypotophytes: evolution of biliproteins and geographical distribution [J]. J Phycol, 2008, 44(4): 985-993.

[29] Lichtlé C, Duval J C, Lemoine Y. Comparative biochemical, functional and ultrastructural studies of photosystem particles from a Cryptophycea: Cryptomonas rufescens; isolation of an active phycoerythrin particle[J]. Biochim Biophys Acta - Bioenergetics, 1987, 894(1): 76-90.

[30] MacColl R, Eisele L E, Dhar M, et al. Bilin organization in cryptomonad biliproteins [J].Biochemistry, 1999, 38(13): 4097-4105.

[31] Rowan K S. Photosynthetic pigments of algae [M]. New York: Cambridge University Press, The United States of America, 1989.

[32] Doust A B, Wilk K E, Curmi P M G, et al. The photophysics of cryptophyte light-harvesting [J]. JPhotochemPhotobiolA: Chemistry, 2006, 184(1–2): 1-17.

[33] 張?jiān)试? 陳敏. 藍(lán)隱藻藻藍(lán)蛋白的分離、純化及性質(zhì)研究[J]. 煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與工程版), 2011, 24(4): 281-286. Zhang Yunyun, Chen Min. Isolation, purification and characterization of phycocyanin from Chroomonasplaciodea. [J]. Journal of Yantai University (Natural Science and Engineering Edition), 2011, 24(4): 281-286.

[34] MacColl R, Malak H, Gryczynski I, et al. Phycoerythrin 545: monomers, energy migration, bilin topography, and monomer/dimer equilibrium [J]. Biochemistry, 1998, 37(1): 417-423.

[35] MacColl R, Malak H, Cipollo J, et al. Studies on the dissociation of cryptomonad biliproteins [J]. J Biol Chem. 1995, 270(46): 27555-27561.

[36] 李文軍, 陳敏. 藍(lán)隱藻藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性研究[J]. 海洋科學(xué), 2013, 37(7): 33-40. Li Wenjun, Chen Min. Structural and Functional Stability of Phycocyaninfrom Chroomonasplacoidea[J]. Marine Sciences, 2013, 37(7): 33-40.

[37] Liu L N, Chen X L, Zhang Y Z, et al. Characterization, structure and function of linker peptides in phycobilisomes of cyanobacteria and red algae; An overview [J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1708: 113-142.

[38] Morschel E, Wehrmeyer W. Cryptomonad biliprotein: phycocyanin-645 from a Chroomonas species [J]. Arch Microbiol, 1975, 105(2): 153-158.

[39] Reith M, Douglas S. Localization of beta-phycoerythrin to the thylakoid lumen of Cryptomonas phi does not involve a signal peptide [J]. 1990, 15(4) : 585-592.

[40] Zimmermann J G, Sheil M, Wrench P M, et al. Amino acid sequence of β-subunit of phycoerythrin from the crypotophyte algae Chroomonas CS 24 [J]. Biochim Biophys Acta, 1992, 1120: 117-121.

[41] Wilk K E, Harrop S J, Jankova L, et al. Evolution of a light-harvesting protein by addition of new subunits and rearrangement of conserved elements: crystal structure of a cryptophyte phycoerythrin at 1.63 ? resolution [J]．Proc Nat Acad Sci Usa, 1999, 96: 8901-8906.

[42] Harrop S J, Wilk K E, Dinshaw R, et al. Single-residue insertion switches the quaternary structure and exciton states of cryptophyte light-harvesting proteins [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111 (26): 2666-2675.

[43] Spear-Bernstein L, Miller K R. Immunogold localization of the phycobiliprotein of a cryptophyte alga to the intrathylakoidal space [M]//Biggens J. Progress in Photosynthesis Research. The Netherlands: Martinus Nijhoff Publishing, 1987: 309 -312.

[44] Spear-Bernstein L, MillerK R. Are the photosynthetic membranes of cryptophyte algae inside out? [J]. Protoplasma, 1985, 129(1): 1-9.

[45] Ludwig M, Gibbs S P. Localization of phycoerythrin at the lumenal surface of the thylakoid membrane in Rhodomonas lens [J]. J Cell Biol, 1989, 108(3): 875-884.

[46] Lichtlé C, Jupin H, Duval J C. Energy transfers fromPhotosystem II to Photosystem I in Cryptomonas rufescens (Cryptophyceae) [J]．Biochim Biophy Acta, 1980, 591: 104-112.

[47] Lichtlé C, McKay R M L, Gibbs S P. Immunogold localization of photosystem I and photosystem II lightharvesting complexes in Cryptomonad thylakiods [J]. Biol Cell Acta, 1992, 74: 187-194.

[48] Spear-Bernstein L, Miller K R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the cryptophyceae [J]. J Phycol, 1989, 25: 412-419.

[49] Spear-Bernstein L, Miller K R. Immunogold localization of the phycobiliprotein of a cryptophyte alga to the intrathylakoidal space [M]//Biggens J. Progress in Photosynthesis Research．The Netherlands: Martinus Nijhoff Publishing, 1987: 309-312.

[50] Vesk M, Dwarte D, Fowler S, et al. Freeze fracture immunocytochemistry of light-harvesting pigment complexes in a cryptophyte [J]. Protoplasma, 1992, 170: 166-176.

[51] van der Weij-De Wit C D, Doust A B, Stokkum H M, et al. How Energy funnels from the phycoerythrin antenna complex to photosystem I and photosystem II in cryptophyte Rhodomonas CS24 Cells [J]. J Phys Chem, 2006, B 110, 25066-25073.

[52] van der Weij-De Wit C D, Doust A B, van Stokkum I H M, et al. Phycocyanin sensitizes both photosystem I and photosystem II in cryptophyte Chroomonas CCMP270 cells [J]. Biophys J, 2008, 94: 2423-2433.

[53] Chen M, Li S H, Sun L. A novel phycocyanin-Chl a/c2-protein complex isolated from chloroplasts of Chroomonas placoidea [J]. Chin Chem Let, 2007, 18: 1374-1378.

[54] 徐偉, 梁源, 陳敏, 等. 隱藻藻藍(lán)蛋白與類囊體膜的動(dòng)態(tài)結(jié)合模型[J]. 海洋科學(xué), 2015, 39(4): 21-29. Xu Wei, Liang Yuan, Chen Min. The dynamic combination model ofcryptomonadphycocyaninandthylakoid[J]. Marine Sciences, 2015, 39(4): 21-29.

[55] Mirkovic T, Wilk K E, Curmi P M G, et al. Phycobiliprotein diffusion in chloroplasts of cryptophyte Rhodomonas CS24 [J]. Photosynth Res, 2009, 100(1): 7-17. [56] Arpin P C, Turner D B, McClure S D, et al. Spectroscopic studies of cryptophyte light harvesting proteins: vibrations and coherent oscillations [J]. J Phys Chem B, 2015, 119(31): 10025-10034.

[57] Mirkovic T, Doust A B, Kim J, et al. Ultrafast lightharvesting dynamics in the cryptophyte phycocyanin 645 [J]. PhotochemPhotobiol Sci, 2007, 6(9): 964-975.

[58] Marin A, Doust A B, Scholes G D, et al. Flow of excitation energy in thecryptophyte light-harvesting antenna phycocyanin 645 [J]. BiophysJ, 2011, 101(4): 1004-1013.

[59] Novoderezhkin V I, Doust A B, Curutchet C, et al. Excitation dynamics in phycoerythrin 545: modeling of steady-state spectra and transient absorption withmodified redfield theory [J]. Biophys J, 2010, 99(2): 344-352.

[60] Bruce D, Biggins J, Steiner T. Excitation energy transfer in the cryptophytes. Fluorescence excitation spectra and picosecond time-resolved emission spectra of intact algae at 77K [J]. Photochem Photobiol, 1986, 44(4): 425-554.

[61] Huo P F, Coker D F. Theoretical study of coherent excitation energy transfer in cryptophyte phycocyanin 645 at physiological temperature [J]. J Phys Chem Lett, 2011, 5: 825-833.

[62] Turner D B, Dinshaw R, Lee K K, et al. Quantitative investigations of quantum coherencefor a light-harvesting protein at conditions simulatingphotosynthesis [J]. Phys Chem Chem Phys, 2012, 14 (14): 4857-4874.

[63] Collini E, Wong C Y, Wilk K E, et al. Coherently wired light-harvesting in photosynthetic marine algae at ambient temperature [J]. Nature, 2010, 463: 644-647.

[64] McClure S D, Turner D B, Arpin P C, et al. Coherent oscillations in the PC577 cryptophyte antenna occur in the excited electronic state [J]. J Phys Chem B, 2014, 118(5): 1296-1308.

[65] Chenu A, Scholes G D. Coherence in energy transfer and photosynthesis[J]. Annu Rev Phys Chem, 2015, 66: 69-96.

[66] Morisset W, Wehrmeyer W, Schirmer T, et al. Crystallization and preliminary x-ray diffraction data of the cryptomonad biliprotein phycocyanin-645 from a Chroomonas spec [J]. Archives of Microbiology, 1984, 140(2-3): 202-205.

Characteristics and existential states of novel phycobiliproteins in cryptophyte algae

CHEN Min, YANG Duo-li, LI Xue-wei
(College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China)

Sep. 21, 2016

cryptophyte; phycobiliprotein; biochemical characteristics; aggregation; location in the lumen

Cryptophyte phycobiliproteins are derived from red algae, but they vary in their protein and phycobilin structures, composition, properties, and existential states within chloroplasts compared to phycobiliproteins derived from red and blue–green algae; therefore, they are considered as a unique evolutionary branch of phycobiliproteins. Currently, cryptophyte phycobiliproteins are considerably less understood than phycobiliproteins derived from red and blue algae; among reports, many differences and even contradictions appear. In this study, the present research status regarding biochemical characteristics, aggregation forms, and existential states in the thylakoid lumen of cryptophyte phycobiliproteins currently found are summarized and reviewed; current research of the unknown and solutions for future investigations are also discussed.

Q946.1

A

1000-3096(2017)04-0128-09

10.11759/hykx20160921001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-09-21;

2016-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40976083)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.40976083]

陳敏(1966-), 女, 廣東陽江人, 教授, 主要從事藻類色素蛋白復(fù)合物研究, 電話: 0535-6902743-8005, E-mail: chenmclm@163.com