紫外輻射對(duì)孔石莼抗氧化酶活性及其同工酶表達(dá)的影響

李麗霞, 王秀靜, 趙吉強(qiáng)

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

紫外輻射對(duì)孔石莼抗氧化酶活性及其同工酶表達(dá)的影響

李麗霞, 王秀靜, 趙吉強(qiáng)

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

潮間帶海藻不可避免地要遭受UV-B的脅迫。本研究以孔石莼(Ulva pertusa)為試材, 研究了UV-B脅迫對(duì)其抗氧化酶體系中SOD、CAT、POX、APX、GR、GPX活性及前4種酶的同工酶表達(dá)的影響。結(jié)果顯示: SOD、CAT、POX酶活性應(yīng)激反應(yīng)較為迅速; APX活性始終保持較穩(wěn)定水平; GR、GPX酶應(yīng)激表達(dá)啟動(dòng)稍晚, 酶活高峰在處理中期6d時(shí)出現(xiàn)。SOD同工酶譜有4條酶帶, 在UV-B3種劑量處理下, SODⅠ及SODⅡ同工酶活性有所增加; POXⅡ同工酶活性呈小幅增加; 在UV-B誘導(dǎo)下, CAT產(chǎn)生了2條新的同工酶譜帶CATⅠ及CATⅡ; APX同工酶僅有1條譜帶, 在UV-B處理下與對(duì)照差異不大。抗氧化成分AsA及GSH含量在處理前中期與對(duì)照相近。孔石莼的特定增長(zhǎng)率(SGR)在1.6 kJ/(m2·d)、4.8 kJ/(m2·d)和9.6kJ/(m2·d)3種劑量UV-B輻射處理下均呈下降趨勢(shì), 且在后兩種劑量處理下降低尤為顯著, 而相應(yīng)的H2O2及TBARS含量呈不同程度增加。上述結(jié)果表明: 孔石莼對(duì)UV-B輻射具有一定程度的耐受性, 可以通過(guò)提高酶促過(guò)氧化體系活性來(lái)應(yīng)答UV-B導(dǎo)致的氧化脅迫, 并且酶活性變化體現(xiàn)出劑量和時(shí)間效應(yīng)。

UV-B輻射; 孔石莼(Ulva pertusa); 抗氧化體系; 同工酶

平流層中臭氧層的減薄是當(dāng)今最引人注目的全球重大環(huán)境問(wèn)題之一。由于臭氧層的侵蝕和破壞使到達(dá)地面的紫外線, 尤其是對(duì)生物具有顯著作用的紫外線B波段(ultraviolet-B, UV-B, 280-320nm)的輻射增強(qiáng)[1-2]。在我國(guó), 總臭氧層也呈現(xiàn)顯著的降低趨勢(shì)[3-4]。近年來(lái), 盡管導(dǎo)致臭氧降解的化學(xué)物質(zhì)排放已受到控制, 但由于溫室氣體效應(yīng), 臭氧層的完全恢復(fù)將被延滯, 而基于一個(gè)全球氣候變化的模型預(yù)測(cè), 最嚴(yán)重的臭氧層衰減將在2010～2019年發(fā)生[5]。

潮間帶是陸地生態(tài)系統(tǒng)和海洋生態(tài)系統(tǒng)的交錯(cuò)地帶, 屬生物圈中最敏感的生態(tài)系統(tǒng)之一。生活于潮間帶的大型海藻要經(jīng)受波動(dòng)范圍最大的光輻射環(huán)境, 尤其在低潮時(shí), 干露的大型海藻必將暴露于全光照條件下, 因而受到的UV-B輻射的直接危害將比淹沒(méi)時(shí)更加嚴(yán)重[6-7]。迄今, 關(guān)于UV-B輻射對(duì)潮間帶大型海藻的影響, 研究多集中在紫外輻射對(duì)海藻的生長(zhǎng)[8]、光合作用[9]、DNA傷害[7,10]、單一抗氧化酶活性[11]等方面, 而迄今對(duì)潮間帶大型綠藻體內(nèi)抗氧化保護(hù)體系及其同工酶對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)時(shí)的響應(yīng)尚缺乏系統(tǒng)研究。已經(jīng)證明, 大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在細(xì)胞內(nèi)的生成及滯留是UV-B輻射對(duì)海藻產(chǎn)生毒性與傷害作用的主要緣故之一[12-13], 而當(dāng)遭受到紫外脅迫時(shí), 海藻中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)及修復(fù)的機(jī)制, 因此, 紫外輻射的危害在一定程度上是可忍受、可抵消、可避免的[14]?？寡趸到y(tǒng)是植物抗脅迫保護(hù)機(jī)制的一個(gè)主要組成部分, 其整體活性高低決定其對(duì)活性氧自由基的清除能力, 而這一能力與植物適應(yīng)或抵抗脅迫能力的增加息息相關(guān)[13]。

孔石莼(Ulva pertusa)又名海白萊, 是潮間帶大型海藻的1種常見(jiàn)類型, 在我國(guó)各沿海地區(qū)分布廣泛, 具備生長(zhǎng)快、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、方便易得等特性, 因而具有良好的綜合應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)發(fā)展前景[15]。本文中, 筆者測(cè)定了孔石莼中各種重要的抗氧化酶(劑)活性及同工酶類型的增減規(guī)律, 結(jié)合過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)及硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)的動(dòng)態(tài)變化, 分析了UV-B輻射程度與同工酶表達(dá)趨勢(shì)及調(diào)控的相關(guān)性, 以期為進(jìn)一步了解潮間帶大型海藻有效應(yīng)對(duì)紫外光脅迫的生化機(jī)制及保護(hù)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 海藻和處理

孔石莼采集自青島太平角中潮帶, 采樣后立刻用消毒海水反復(fù)沖洗去除可見(jiàn)的附生物及沉積物。新鮮海藻用打孔器制備成直徑約1 cm的圓片, 約20 g鮮質(zhì)量作為一個(gè)處理, 預(yù)培養(yǎng)于盛有2.5 L滅菌海水的玻璃缸中, 缸直徑為50 cm。海水持續(xù)充氣并每日更換。

經(jīng)過(guò)3 d的預(yù)培養(yǎng)后, 海藻材料置于6個(gè)直徑為18 cm平皿內(nèi)接受紫外輻射處理。采用北京師范大學(xué)生產(chǎn)的UV-B 型紫外輻射強(qiáng)度儀測(cè)定輻射強(qiáng)度。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)3種不同輻射劑量的處理組: 1.6 kJ/(m2·d)為輕度劑量 (Luv), 4.8 kJ/(m2·d)為中度劑量 (Muv), 9.6 kJ/(m2·d)為高度劑量UV-B輻射(Huv)[6]。對(duì)照(ck)采用正常日光燈管照射, 光強(qiáng)為 3 500 lx, 培養(yǎng)溫度保持在20～25℃, 光周期為12 h︰12 h。試驗(yàn)周期為12 d。

1.2 生長(zhǎng)測(cè)定

為測(cè)定生長(zhǎng)情況, 20片新鮮海藻另培養(yǎng)于裝有300 mL海水的規(guī)格為500 mL的錐形瓶中, 每個(gè)處理3次重復(fù)組。按照2種海藻的最終濕質(zhì)量來(lái)計(jì)算其特定生長(zhǎng)率(specific growth rate, RSG), 計(jì)算公式為:

RSG(%/d)= (lnWT–lnW0)/t×100%

式中, WT和W0分別表示藻體的最終濕質(zhì)量和初始濕質(zhì)量(g); t為試驗(yàn)周期(d)。

1.3 抗氧化酶活性測(cè)定

取1 g藻體材料用5 mL提取緩沖液(構(gòu)成為0.05 mol/L pH=7.0的磷酸緩沖液PBS中包含1%PVP, 0.001 mol/L EDTA)在冰浴條件下研磨提取后, 14 000 r/min 離心15 min, 立即取上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)及過(guò)氧化物酶(Peroxidase, POX)活性。酶液保存及相應(yīng)的活性測(cè)定都在0～4℃條件下進(jìn)行, 設(shè)置3次重復(fù), 每3 d測(cè)定1次。

SOD活性測(cè)定波長(zhǎng)為560 nm, 依據(jù)氮藍(lán)四唑(Nitro blue tetrazolium, NBT)的光抑制反應(yīng)[16]進(jìn)行。CAT活性測(cè)定依據(jù)Chance等[17]的方法, 測(cè)定H2O2在240 nm下的降解速度。POX測(cè)定由于愈創(chuàng)木酚的形成導(dǎo)致470 nm下光吸收的增加[18]。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)的提取緩沖液包含0.05 mol/L PBS (pH7.0), 0.001 mol/L EDTA, 0.002 mol/L AsA 及 1% PVP。APX的活性測(cè)定是檢測(cè)290 nm下基于抗壞血酸的氧化而使光吸收降低的速度[19]。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)及谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase, GR)的提取緩沖液中包括(0.055 mol/L pH=7.0 PBS; 0.001 mol/L EDTA-Na2; 1%PVP; 0.005 mol/LMgcl2; 0.001 mol/L AsA)。取適量材料加入提取液冰浴研磨勻漿, 4℃下10 000r/min離心10 min, 取上清酶液用于酶活測(cè)定。GPX測(cè)定基本參照黃愛(ài)纓等[20]的方法并略作改進(jìn),測(cè)定反應(yīng)酶液在412 nm的光吸收值。GR測(cè)定方法參照Kn?rzer[21]的方法并作改進(jìn), 此方法是基于還原型輔酶Ⅱ的氧化反應(yīng)在340 nm下的吸光度的減少來(lái)測(cè)量。

1.4 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量測(cè)定參照沙愛(ài)華等[22]的方法進(jìn)行,并加以改進(jìn)。提取液為預(yù)冷的冷丙酮液研磨勻漿后14 000 r/min離心20 min, 取上清加入反應(yīng)物后測(cè)定吸光值A(chǔ)410。同樣方法制作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 TBARS含量測(cè)定

取冷凍的海藻材料0.3 g用1%TCA溶液3 mL研磨提取, 14 000 r/min 離心10 min。TBARS含量計(jì)算參照Health及Packer[23]方法, 基于535 nm和600 nm的光吸收值來(lái)計(jì)算。

1.6 電泳及同工酶譜分析

電泳試驗(yàn)均于處理12 d時(shí)進(jìn)行, 采用非變性不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳, 4℃下20 mA/gel穩(wěn)流電泳。SOD同工酶染色方法參照Laemmli[24]的方法, 將凝膠在黑暗條件下于0.25 mmol/LNBT中浸泡20 min后, 置于含8 mmol/L EDTA 的0.05 mmol/L核黃素溶液中20 min, 曝光至藍(lán)紫色背景上出現(xiàn)透明條帶, 根據(jù)其對(duì)KCN及H2O2不同的敏感性進(jìn)一步確認(rèn)其同工酶譜帶的3種類型[25]。CAT同工酶染色根據(jù)Woodbury等[26]的方法, 將凝膠于0.003 3 mol/L H2O2中浸沒(méi)25 min后, 再放置于1% FeCl3和1% K3Fe (CN6)溶液中染色, 直至綠色條帶出現(xiàn)。POX同工酶染色時(shí)將凝膠在包含0.3% H2O2和0.002 mol/L聯(lián)苯胺的0.2 mol/L的醋酸溶液中染色20 min后, 褐色條帶顯現(xiàn)[27]。用于APX電泳檢測(cè)的條件與上述條件均相同, 但需在電泳緩沖液中包含0.002 mol/L的AsA, 以便使預(yù)電泳30 min讓AsA進(jìn)入膠內(nèi)。APX活性染色按照以下方式進(jìn)行: 將凝膠浸沒(méi)于含0.002 mol/L AsA 的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中30 min后, 于含0.004 mol/L AsA 及0.002 mol/L H2O2的0.05 mol/L PBS (pH7.0)中溫育20 min。最后轉(zhuǎn)移至包含0.002 5 mol/L NBT及0.03 mol/L TEMED的0.05 mol/L PBS (pH7.8)溶液中10 min左右, 直至APX譜帶顯現(xiàn)[28]。采用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.7 抗氧化成分抗壞血酸(Ascorbate, AsA)及谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量測(cè)定

參照Marschner等[29]的方法稍加改進(jìn)測(cè)定AsA含量, 海藻材料用5%偏磷酸研磨提取, 24 000 r/min離心15 min, 取上清測(cè)定。GSH提取液為50 mmol/L pH=7.0的PBS溶液, 其中加入適量AsA, 測(cè)定反應(yīng)體系在412nm處的光吸收值[30]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

研究結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析, 處理結(jié)果之間的多重比較采用Duncan’s檢驗(yàn)方法。圖表采用Sigma Plot 10.0軟件繪制, 圖中的誤差棒表示基于3次重復(fù)值的均值標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 特定增長(zhǎng)率的變化

UV-B對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。輕度劑量下SGR值呈下降趨勢(shì), 但與對(duì)照并未達(dá)到差異顯著水平(P＞0.05); 中度劑量照射下的SGR值顯著下降(P＜0.05), 高度劑量輻射處理下降低更為顯著, 與對(duì)照之間的差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

2.2 孔石莼抗氧化體系對(duì)UV-B輻射的響應(yīng)

圖2顯示出孔石莼抗氧化體系的幾種關(guān)鍵酶對(duì)UV-B輻射的響應(yīng)變化。在UV-B輻射誘導(dǎo)下, 前期SOD酶應(yīng)激反應(yīng)迅速, 其活性呈大幅度上升, 其中中度劑量處理下的酶活在3～6 d時(shí)均與對(duì)照組達(dá)到極顯著差異(P＜0.01); 輕度劑量脅迫下SOD活性也始終高于對(duì)照水平; 高度劑量處理下酶活性初期顯著升高, 隨脅迫時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng), 酶活明顯回落 (圖2a)。POX酶活性見(jiàn)圖2b。由圖可知, 在UV-B輻射處理初期, 輕度及中度劑量脅迫下POX活性增加顯著, 分別與對(duì)照達(dá)到極顯著(P＜0.01)及顯著水平(P＜0.05); 在處理中后期, 輕度脅迫下POX仍然與對(duì)照活性水平相近, 而中度及高度處理水平的酶活性顯著降低(P＜0.05); 在試驗(yàn)期間對(duì)照的POX活性也表現(xiàn)出較大的變化幅度, 中期時(shí)(6 d) 酶活性最高。CAT活性在UV-B處理初期即誘導(dǎo)出較高的活性表達(dá), 與對(duì)照值均達(dá)到顯著以上水平(P＜0.05); 在處理中期6 d時(shí), 中度劑量UV-B處理下CAT活性達(dá)到峰值, 隨后明顯下降; 在處理后期, 不同劑量UV-B處理水平下的CAT酶仍維持較高活性水平, 與對(duì)照值之間差異顯著或極顯著(P＜0.05; P＜0.01, 圖2c)。圖2d顯示出孔石莼APX活性與上述酶活性變化規(guī)律不同, 除在9d時(shí)輕度劑量UV-B處理下活性短暫增加外(P＜0.05), 其他時(shí)間始終保持較穩(wěn)定水平, 對(duì)照與3種輻射處理間差異皆不明顯(P＞0.05)。

圖1 UV-B處理下孔石莼的特定生長(zhǎng)率Fig.1 SGR of Ulva pertusa following exposure to different doses of UV-B radiationsLuv、Muv、Huv分別表示輕度、中度及高度劑量UV-B輻射, Ck為對(duì)照, 下同Luv, Muv, and Huv indicate mild, moderate, and high doses of UV-B radiation, respectively; Ck is the control, the same below

GR酶活性在處理中期6 d時(shí)有較大幅度的升高,但其中僅有輕度UV-B脅迫下的GR酶活性與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05), 隨后呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì); 高度劑量UV-B處理下GR酶活性下降較多,至試驗(yàn)期末12 d時(shí)活性顯著低于對(duì)照的相應(yīng)值(P＜0.05, 圖2e)。UV-B處理下GPX 酶活性變化見(jiàn)圖2f。輕度及中度UV-B輻射誘導(dǎo)GPX酶活性先表現(xiàn)上升趨勢(shì), 輕度UV-B輻射水平下上升幅度更大, 在處理6d時(shí)出現(xiàn)峰值 (P＜0.05); 中度劑量UV-B處理下后期GPX酶活急劇下降, 與對(duì)照差異顯著(P＜ 0.05); 而重度UV-B脅迫使GPX酶活性始終保持在較低水平。

2.3 UV-B輻射對(duì)孔石莼AsA及GSH含量的影響

圖2 不同劑量UV-B輻射下孔石莼SOD(a)、POX(b)、CAT(c)、APX(d)、GR(e)及GPX (f)酶的活性變化Fig. 2 Activities of SOD(a), POX(b), CAT(c), APX(d), GR(e), and GPX(f) in Ulva pertusa following exposure to different doses of UV-B radiation

圖3 UV-B輻射下孔石莼的AsA(a)及GSH(b)含量Fig. 3 AsA (a) and GSH (b) contents in Ulva pertusa following exposure to different doses of UV-B radiation

孔石莼體內(nèi)抗氧化成分AsA及GSH含量在不同劑量UV-B輻射時(shí)的變化狀況如圖3所示。從圖3a可以看出, 處理初期及中期(3～6 d)時(shí), 輕度及中度脅迫水平下AsA水平均呈上升趨勢(shì), 并且中度處理的AsA含量升高幅度較大, 在6 d時(shí)與對(duì)照間的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05); 隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 各個(gè)處理下的孔石莼AsA水平均顯著降低(P＜0.05; P＜0.01)。由圖3b可知, UV-B輻射初始階段, 孔石莼體內(nèi)GSH活性水平變化不明顯, 至處理9 d時(shí), 高度劑量下處理的GSH含量明顯下降(P＜0.01); 至試驗(yàn)期末12 d時(shí), 中度UV-B輻射處理的GSH含量亦顯著地低于對(duì)照水平(P＜0.01), 而輕度UV-B處理的孔石莼的GSH含量雖然低于對(duì)照值, 但其差異并未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

2.4 同工酶檢測(cè)

從圖4a可以看出孔石莼SOD同工酶有4條酶帶, 分別表示為SODⅠ、SODⅡ、SODⅢ、 SODⅣ。本研究進(jìn)一步鑒定SODⅠ、SODⅢ及SODⅣ譜帶類型均為Mn-SOD, 而SODⅡ排除為Mn-SOD的可能,而未能準(zhǔn)確鑒定為Fe-SOD或者CuZn-SOD。與對(duì)照組相比較, 3種UV-B劑量處理下孔石莼的SODⅠ及SODⅡ2條同工酶活性有所增加; 而SODⅢ與SODⅣ同工酶活性與對(duì)照組相比, 無(wú)明顯變化。由圖4b可知, POX同工酶主要有2條酶帶。輕、中度及重度UV-B照射使POXⅡ同工酶活性呈小幅增加; 同時(shí)在重度UV-B脅迫下POXⅠ同工酶活性有所下降。

圖4 孔石莼的SOD (a), POX (b), CAT(c) 及 APX (d)同工酶對(duì)UV-B輻射的響應(yīng)Fig. 4 SOD (a), POX (b), CAT (c), and APX (d) isoforms in Ulva pertusa in response to exposure to UV-B radiation

孔石莼具有較高的CAT酶活性, 在同工酶譜上即表現(xiàn)為高亮度的條帶(圖4c)。在UV-B誘導(dǎo)條件下,除CATⅢ譜帶比相應(yīng)對(duì)照明顯增強(qiáng)外, CAT酶還出現(xiàn)2條新的、較細(xì)的同工酶譜帶CATⅠ及CAT, Ⅱ且在低度及中度劑量下其活性高于高度劑量下相應(yīng)的同工酶活性。

圖4d顯示出孔石莼APX同工酶的活性狀態(tài), 在UV-B處理下APX酶僅有1條譜帶, 且與對(duì)照的APX活性差異不大。

2.5 UV-B輻射對(duì)孔石莼H2O2及TBARS含量的影響

由圖5a可知, 在不同劑量UV-B處理下孔石莼體內(nèi)的H2O2含量并未快速積累, 處理后期9～12 d時(shí),中度及高度劑量下的H2O2水平比對(duì)照顯著增加(P＜0.05), 而輕度UV-B輻射條件下H2O2含量始終與對(duì)照值差異不明顯(P＞0.05)。由圖5b可知, TBARS含量變化與H2O2水平的變化規(guī)律相似, 在試驗(yàn)前期時(shí), 3種劑量水平處理下的TBARS含量與相應(yīng)對(duì)照差異不大, 隨處理時(shí)間延長(zhǎng), TBARS含量逐步升高, 6 d時(shí)高度劑量處理下TBARS含量與對(duì)照差異已達(dá)顯著水平(P＜0.05), 至12 d時(shí), 輕度及中度劑量處理的TBARS含量也比對(duì)照顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

圖5 UV-B輻射下孔石莼H2O2(a)及TBARS(b)含量Fig. 5 H2O2and TBARS contents in Ulva pertusa following exposure to different doses of UV-B radiation

活性氧(ROS)是植物生理生化代謝過(guò)程中不可避免的副產(chǎn)物。近年來(lái)研究表明, ROS清除系統(tǒng)的各組分之間存在共調(diào)節(jié)機(jī)制, 抗氧化酶的活性平衡對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的穩(wěn)定水平起著關(guān)鍵作用, 改變這些酶的平衡就會(huì)誘發(fā)補(bǔ)償機(jī)制, 海藻抗UV-B輻射的能力與抗氧化系統(tǒng)間協(xié)同作用、基礎(chǔ)活性、應(yīng)激性和敏感性差異等因素均有密切關(guān)系[31-32]。如在脅迫條件下, 抗壞血酸(AsA)減少, APX由于缺乏底物而失活或活性降低, 此時(shí)CAT會(huì)增加防止H2O2過(guò)度累積,同樣, CAT活性降低時(shí), APX和GPX的轉(zhuǎn)錄水平增加使表達(dá)提高[33]。Kono等[34]指出因?yàn)镺·2會(huì)抑制CAT活性, 而SOD在活性氧清除反應(yīng)過(guò)程中第一個(gè)發(fā)揮作用, 可以歧化O2·, 故而SOD活性高的個(gè)體CAT活性也應(yīng)該高。本研究結(jié)果基本符合這一結(jié)論。孔石莼SOD、CAT與POX活性應(yīng)激反應(yīng)較為迅速, 均在處理的前期顯著增加(圖2a、圖2b、圖2c), 而APX、GPX及GR等酶活性高峰在中后期出現(xiàn)(圖2d、圖2e、圖2f), 且低度及中度劑量下酶活性增加尤其明顯。這是UV-B 輻射脅迫誘導(dǎo)的結(jié)果, 可能是孔石莼細(xì)胞為了適應(yīng)逆境脅迫條件的一種調(diào)節(jié)性應(yīng)激梯度反應(yīng), 產(chǎn)生類似的“毒物興奮效應(yīng)”。此種效應(yīng)具有低劑量促進(jìn)高劑量抑制特征, 是機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到外界脅迫條件擾動(dòng)后的響應(yīng), 即生物體在最初的抑制反應(yīng)之后會(huì)出現(xiàn)補(bǔ)償效應(yīng), 這個(gè)補(bǔ)償效應(yīng)可能會(huì)逐漸超過(guò)控制行為, 從而導(dǎo)致一種凈刺激效應(yīng)[35]。該效應(yīng)能夠在一定程度上使酶系統(tǒng)活性增加, 抑制活性氧在短期內(nèi)爆發(fā)性累積, 從而增強(qiáng)孔石莼對(duì)UV-B脅迫的抵抗力; 但伴隨著輻射劑量的增加及輻射時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng), 藻體細(xì)胞內(nèi)活性氧分子如H2O2會(huì)過(guò)量生成(圖5a), 最終超越了防御系統(tǒng)的清除能力, 此時(shí),作為表示脂質(zhì)過(guò)氧化程度的有效指示器TBARS含量亦顯著增加(圖5b), 表明細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇, 酶活部分喪失, 機(jī)體生長(zhǎng)代謝受損。

進(jìn)一步對(duì)連續(xù)測(cè)定的H2O2及TBARS含量與各類型、不同處理下酶活性相關(guān)分析表明, CAT活性與TBARS含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r =–0.9296); 高度劑量處理下GPX活性與H2O2含量之間亦存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r = –0.8924),其他抗氧化酶活性與活性氧之間的相關(guān)性并未達(dá)到顯著水平。解析其原因, 一方面在試驗(yàn)期間內(nèi)連續(xù)5次測(cè)定, 這些指標(biāo)均表現(xiàn)為一定閾值內(nèi)的動(dòng)態(tài)性變化, 另一方面也同時(shí)印證孔石莼通過(guò)多種抗氧化酶協(xié)同作用來(lái)控制細(xì)胞內(nèi)活性氧水平, 而并非由某一種酶發(fā)揮絕對(duì)核心作用。

作為抗氧化體系的另一主要成分, AsA具有多種抗氧化功能, 可以還原, 清除·OH, 猝滅及H2O2等從而使植物體內(nèi)的活性氧維持在較低范圍[36]。此外, 海藻藻體內(nèi)GSH含量能夠受到UV-B輻射的顯著影響, 并且其變化情況與輻射劑量及輻射時(shí)間的改變關(guān)系密切, 如海洋綠藻Ulva fasciata隨輻射劑量加大, AsA從較小值躍升至峰值并一直保持在較高水平; GSH含量隨輻射劑量加大, GSH含量也逐漸增大, 但超過(guò)一定范圍后, GSH含量反而又降至較低水平[11]。本文的研究結(jié)果與前人稍有不同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)孔石莼具有較高的AsA及GSH基礎(chǔ)含量, 在低、中劑量時(shí), 二者在處理的初中期均會(huì)被誘導(dǎo)升高,但高度劑量及較長(zhǎng)時(shí)間的輻射脅迫又會(huì)使其含量呈下降的必然趨勢(shì)(圖3a, 圖3b), 這可能是由于試驗(yàn)中輻射劑量不同及種間差異性導(dǎo)致。Roleda同樣指出對(duì)紫外線的敏感性取決于海藻的種類及生態(tài)型[37]。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明, 高度劑量處理下AsA含量與H2O2水平之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r = –0.9848), 與TBARS含量之間則相關(guān)顯著(相關(guān)系數(shù)r = –0.9381)。

同工酶是催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶的分子類型, 是植物細(xì)胞代謝的重要調(diào)節(jié)成分。本研究中, 孔石莼不但表現(xiàn)出較高的SOD應(yīng)激活性,并且SOD同工酶也在UV-B作用下發(fā)生了一定的改變。SOD是一種金屬蛋白酶, 根據(jù)其金屬輔基的不同又分為3種類型, 分別為Mn-SOD、Cu/Zn-SOD及Fe-SOD, 分布于細(xì)胞中的不同部位[38]。在本研究中,孔石莼中鑒定出SODⅠ、SODⅢ及SODⅣ譜帶類型均為Mn-SOD(圖4a)。有的研究者曾經(jīng)報(bào)道O3及UV-B處理能夠誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD, 但不能影響Mn-SOD[39]。然而, 本研究結(jié)果顯示Mn-SOD (SODI)在UV-B誘導(dǎo)下活性顯著增加, 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異, 亦可能為SOD同工酶的種間差異所導(dǎo)致。此外, 上述結(jié)果同時(shí)表明海藻中SOD同工酶對(duì)不同劑量紫外輻射的響應(yīng)可以在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平。Sano等[40]研究發(fā)現(xiàn),一種海藻Galdieria partita中至少含有兩種APX同工酶, 這是海藻細(xì)胞中關(guān)于APX同工酶的最早報(bào)道。本研究中, 孔石莼APX同工酶變化相對(duì)穩(wěn)定(圖4d),而CAT酶同工酶活性相對(duì)較高, 在電泳圖上表現(xiàn)為高亮度的譜帶(圖4c), 表明藻體細(xì)胞具有一定的紫外保護(hù)能力, 能在一定程度上降低對(duì)藻體的傷害。筆者推測(cè), 某些SOD或CAT保留或加強(qiáng)的同工酶與孔石莼對(duì)紫外的抗性緊密相關(guān)。

生長(zhǎng)速率的變化亦被普遍用于衡量脅迫水平[41]。在本研究中, 輕度劑量導(dǎo)致輕微脅迫, 而中、高度劑量導(dǎo)致中度及嚴(yán)重脅迫。與中、高度劑量相比, 海藻在輕度劑量下SGR相對(duì)較高(圖1), 表明孔石莼能在較溫和的脅迫下保持一定生長(zhǎng)速度, 而在更嚴(yán)重的脅迫下受到傷害。

綜上所述, 孔石莼中抗氧化系統(tǒng)在紫外處理下表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。SOD、POX、CAT及在紫外處理初期均有不同程度增加, GR、GPX、APX酶活性應(yīng)激反應(yīng)滯后, 在處理中、后期活性上升, 尤其在低度及中度劑量下上升幅度較大; 然而, 隨著紫外劑量的加大, 保護(hù)酶活性亦受抑, 正常代謝受阻,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物累積, SGR不可避免呈降低趨勢(shì)。因此, 孔石莼通過(guò)提高抗氧化系統(tǒng)活性作為一種生化防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)紫外輻射所產(chǎn)生的氧化脅迫, 僅可在一定程度及一定范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

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Effect of UV radiation on the activities of antioxidant enzymes and their isoforms in Ulva pertusa (Chlorophyta)

LI Li-xia, WANG Xiu-jing, ZHAO Ji-qiang
(College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China)

Jul. 5, 2016

UV-B radiation; Ulva pertusa; antioxidant system; isoenzyme

The marine ecosystem inevitably undergoes stress because of exposure to enhanced UV-B radiations. The response of the antioxidant defense system, including that of SOD, CAT, POX, APX, GR, and GPX, of the intertidal macroalgae Ulva pertusa to different doses of UV-B radiation and the first four isoenzyme patterns were investigated. SOD, CAT, and POX rapidly responded to UV-B radiation. The response significantly increased during the initial stage of UV-B treatments. The APX activity remained at a more stable level throughout the exposure. The responses of GR and GPX to UV-B stress were observed later, and an activity peak appeared on day 6. The enzymatic assay revealed four distinct bands of SOD, and SODⅠ and SODⅡ activities increased following exposure to UV-B radiation. The activity of POXⅡ isoenzyme slightly increased following the exposure to UV-B radiation. In addition, new bands of CATⅠ and CATⅡ were detected in response to UV treatments. Only one APX band was detected, and there was no significant difference with respect to Ck. The concentrations of antioxidants such as AsA and GSH were similar to those in the control during the early-to-medium term. SGR reduced following exposure to all three doses, including 1.6, 4.8, and 9.6 kJ/(m2·d), and significantly decreased in the latter two treatments. H2O2and TBARS concentrations significantly increased compared with those in the control. These data suggested that the protection mechanisms of the antioxidant defense system are partly inducible by UV-B to prevent damage and that the enzyme activities change in response to UV-B radiation in a time- and dose-dependent manner.

X171.5

A

1000-3096(2017)04-0001-09

10.11759/hykx20160528002

(本文編輯: 梁德海)

2016-07-05;

2016-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31300326)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China , No.31300326]作者簡(jiǎn)介: 李麗霞(1975-), 女, 河北行唐人, 副教授, 博士, 主要從事海藻抗逆性研究, 電話: 0535-6902638, E-mail: lilixianet@126.com