快速超廣譜β-內(nèi)酰胺酶篩查在尿路感染中的應(yīng)用價(jià)值研究

王憲靈 王縛鯤 趙會(huì)海 張盼 賈克然 張海譜

·論著·

快速超廣譜β-內(nèi)酰胺酶篩查在尿路感染中的應(yīng)用價(jià)值研究

王憲靈 王縛鯤 趙會(huì)海 張盼 賈克然 張海譜

目的 探討快速超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)篩查實(shí)驗(yàn)在住院尿路感染(urinary tract infection，UTI)患者中的應(yīng)用價(jià)值，為及時(shí)有效治療UTI提供依據(jù)。方法 快速ESBLs篩查實(shí)驗(yàn)采用液體培養(yǎng)基添加頭孢噻肟比濁法測(cè)定。UTI患者送檢中段尿培養(yǎng)標(biāo)本1 160份，離心鏡檢分為可疑革蘭陰性桿菌感染組(502例)，可疑革蘭陽(yáng)性球菌感染組(103例)，可疑念珠菌感染組(15例)，可疑混合感染組(85例)，可疑陰性組(431例)。采用ESBLs快速篩查方法和ESBLs確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)其中的可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的差異。結(jié)果 在可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組3組，ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)共檢測(cè)到產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性標(biāo)本346例(33.21%)，快速ESBLs篩查試驗(yàn)共檢測(cè)到產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性標(biāo)本386例(37.04%)，兩者陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.369，P=0.066)。在可疑革蘭陰性桿菌感染組，兩者的符合率為84.03%，快速ESBLs篩查試驗(yàn)的假陽(yáng)性率為23.91%，假陰性率為9.80%。在可疑混合感染組，兩者的符合率為70.58%，快速ESBLs篩查試驗(yàn)的假陽(yáng)性率為54.05%，假陰性率為10.42%。在可疑陰性組，兩者的符合率為99.77%。結(jié)論 快速ESBLs篩查實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、宜行，并且快速，可以用來作為尿路感染患者尿培養(yǎng)標(biāo)本細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果指導(dǎo)UTI治療。

尿路感染；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；快速；篩查

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是臨床常見的感染性疾病之一，治療方面多種抗生素均可用于治療UTI。在引起UTI的致病菌中，以革蘭陰性桿菌為主，其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥菌株占所培養(yǎng)出的革蘭陰性桿菌的60%以上[1-3]。針對(duì)UTI推薦的經(jīng)驗(yàn)性治療抗感染藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：除呋喃妥因外，尚無其他能滿足廣譜需要的單種口服抗生素用于治療UTI。由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能及時(shí)報(bào)告細(xì)菌耐藥結(jié)果，一方面造成無效治療，另一方面增加患者負(fù)擔(dān)，造成疾病遷延不愈，因此快速準(zhǔn)確鑒別出產(chǎn)超廣譜β-ESBLs致病菌在UTI治療中非常重要。本研究探討快速超廣譜β-ESBLs篩查實(shí)驗(yàn)在UTI中的應(yīng)用價(jià)值，為及時(shí)有效治療UTI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2013年1月至2013年12月我院住院疑似UTI患者送檢中段尿培養(yǎng)標(biāo)本1 160份。所有標(biāo)本為晨起留取的中段尿，2 h內(nèi)送檢?；颊咧心?09例，女1 051例；年齡1～96歲，平均(56.2±1.5)歲。

1.2 儀器與試劑 惠州市陽(yáng)光生物科技公司SS-1000B型細(xì)菌測(cè)定/藥敏分析儀及配套檢測(cè)板；DNM-9602型酶標(biāo)儀為北京普朗新技術(shù)公司產(chǎn)品；抗菌藥敏紙片、血基礎(chǔ)培養(yǎng)基、M-H培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；ESBLs篩查培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基中添加頭孢噻肟至終濃度2.0 μg/ml。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本篩選和預(yù)處理:取中段尿標(biāo)本5 ml加入無菌離心管中，1 000 g/min離心1 min，上清轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中，5 000 g/min離心20 min，吸棄上清留底部約0.2 ml混勻，取50 μl滴加在玻片上自然干燥，固定后染色鏡檢，鏡檢僅發(fā)現(xiàn)革蘭陰性桿菌為可疑革蘭陰性桿菌感染組，鏡檢僅發(fā)現(xiàn)革蘭陽(yáng)性球菌做為可疑革蘭陽(yáng)性球菌感染組，鏡檢僅發(fā)現(xiàn)念珠菌做為可疑念珠菌感染組，鏡檢發(fā)現(xiàn)兩種以上細(xì)菌做為可疑混合感染組，鏡檢未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌做為可疑陰性組，然后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 快速ESBLs篩查試驗(yàn):取可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組、和可疑陰性組離心后尿標(biāo)本50 μl加入到950 μl快速ESBLs篩查培養(yǎng)基中混勻，取200 μl加入到96孔無菌培養(yǎng)板中，每個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，輕振板1次，檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm吸光度值。然后將培養(yǎng)板放入35℃溫箱中保濕培養(yǎng)4 h，取出在酶標(biāo)儀中檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm吸光度值。結(jié)果判定：每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔吸光度值明顯改變，≥2倍初始值判為ESBLs陽(yáng)性。

1.3.3 常規(guī)尿標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏:中段尿標(biāo)本常規(guī)培養(yǎng)按臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[4]方法進(jìn)行，利用陽(yáng)光生物SS-1000B型細(xì)菌測(cè)定/藥敏分析儀和微量生化管鑒定細(xì)菌到種。藥敏試驗(yàn)采用陽(yáng)光生物SS-1000B型細(xì)菌測(cè)定/藥敏分析儀測(cè)定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.3.4 ESBLs確認(rèn)試驗(yàn):采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的ESBLs表型確證試驗(yàn)，按照常規(guī) 標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作。方法為將常規(guī)培養(yǎng)的待檢菌株用0.9%氯化鈉溶液配成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海?個(gè)不同角度均應(yīng)涂布于MH瓊脂板上，貼上每片含頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)的藥敏紙片，當(dāng)復(fù)合物藥敏紙片抑菌環(huán)直徑大于或等于單一藥敏紙片5 mm，即判定為ESBLs陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本篩選與分組情況 經(jīng)離心涂片鏡檢的方法篩選，1 160份標(biāo)本中526份(45.34%)為可疑革蘭陰性桿菌感染，103份(8.88%)為可疑革蘭陽(yáng)性球菌感染，85份(7.33%)為可疑混合感染，15份(1.29%)為可疑念珠菌感染，其他431份(37.16%)為可疑陰性。

2.2 常規(guī)尿標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定結(jié)果 1 160份尿標(biāo)本共檢測(cè)到細(xì)菌768株，其中大腸埃希菌422株(54.95%)，為UTI的主要致病菌。見表1。

表1 768株細(xì)菌構(gòu)成比

2.3 ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)和快速篩查試驗(yàn)在不同組中檢測(cè)情況 在可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組3組中，確認(rèn)試驗(yàn)共檢測(cè)到產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性標(biāo)本346例(33.21%)，快速篩查試驗(yàn)共檢測(cè)到產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性標(biāo)本386例(37.04%)，兩者陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.369，P=0.066)。見表2。

表2 不同組別樣本中產(chǎn)ESBLs菌株的檢測(cè)情況 例(%)

注:與ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)比較,*P<0.05

2.4 ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)和快速ESBLs篩查試驗(yàn)的一致性 在可疑革蘭陰性桿菌感染組，可疑混合感染組和可疑陰性組3組共1 042例樣本中，兩種方法均為陽(yáng)性的標(biāo)本例數(shù)為311例(29.85%)，均為陰性的樣本例數(shù)為621例(59.60%)，兩者總的符合率為89.45%；在可疑革蘭陰性桿菌感染組，兩者的符合率為84.03%，以ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，快速篩查試驗(yàn)的假陽(yáng)性率為23.91%，假陰性率為9.80%。在可疑混合感染組，兩者的符合率為70.58%，以ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，快速篩查試驗(yàn)的假陽(yáng)性率為54.05%，假陰性率為10.42%。在可疑陰性組431例標(biāo)本中，僅有一例ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性，快速ESBLs篩查試驗(yàn)陰性，其他完全符合，符合率為99.77%。見表3、4。

表3 可疑革蘭陰性桿菌感染組產(chǎn)ESBLs菌株檢測(cè)情況 例

表4 可疑混合感染組產(chǎn)ESBLs菌株檢測(cè)情況 例

3 討論

ESBLs主要是革蘭陰性菌尤其是由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的，其編碼基因位于細(xì)菌的質(zhì)粒上，耐藥性可通過質(zhì)粒在細(xì)菌間擴(kuò)散。ESBLs能夠水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而使抗生素失效。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性尤其是產(chǎn)ESBLs的菌株所致的耐藥性迅速增加[5]，此耐藥菌株不僅在細(xì)菌間傳播，而且還能夠在患者間甚至醫(yī)院之間互相傳播[6]，給臨床的抗感染治療帶來極大困難。

自從1983年首次分離出ESBLs以來，產(chǎn)ESBLs菌株引起的感染發(fā)病率在逐漸提高，在UTI中ESBLs陽(yáng)性菌株引起的泌尿系感染占分離培養(yǎng)出革蘭陰性桿菌的60%以上[1-3]，因此準(zhǔn)確及時(shí)的檢測(cè)出產(chǎn)ESBLs的耐藥菌株，選擇合適的治療藥物，對(duì)UTI的治療非常重要。然而傳統(tǒng)的ESBLs確認(rèn)實(shí)驗(yàn)首先需要經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定和藥敏過程，需要48 h以上的時(shí)間，嚴(yán)重影響患者的用藥治療，并增加患者負(fù)擔(dān)，因此，在UTI治療中，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株的方法有很大的實(shí)用價(jià)值。國(guó)外對(duì)檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株的方法進(jìn)行了許多研究，包括紙片確證實(shí)驗(yàn)、肉湯稀釋法、雙紙片協(xié)同法和三維實(shí)驗(yàn)等[7]，但這些方法的共同缺點(diǎn)是都需要分離菌株，用時(shí)較長(zhǎng)?，F(xiàn)在最新的方法是應(yīng)用多重PCR的方法[8]，雖然準(zhǔn)確性較高用時(shí)較短，但操作繁瑣對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，現(xiàn)在還不能廣泛推廣使用。因此我們以肉湯稀釋法為基礎(chǔ)，建立UTI快速ESBLs篩查試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)首先將尿標(biāo)本低速離心去除引起標(biāo)本渾濁的尿中沉淀物，然后高速離心最大程度的濃縮細(xì)菌，液體培養(yǎng)基使細(xì)菌快速增值，4 h 即可進(jìn)行檢測(cè)，原因：(1)實(shí)驗(yàn)證明大多革蘭陰性桿菌在4 h既可檢測(cè)到快速增值，而相應(yīng)的球菌或念珠菌大量增殖需要5 h以上或更長(zhǎng)的時(shí)間，最大程度避免了干擾；(2)為了患者當(dāng)天可以拿到初步檢測(cè)結(jié)果，用來指導(dǎo)臨床用藥。

由于革蘭陽(yáng)性球菌和念珠菌不產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，所以本研究?jī)H針對(duì)可疑單一革蘭陰性桿菌感染、可疑混合感染和可疑陰性組標(biāo)本。本研究結(jié)果表明，結(jié)合尿標(biāo)本離心涂片，快速ESBLs篩查試驗(yàn)與確認(rèn)試驗(yàn)總的符合率為89.45%。可疑革蘭陰性桿菌感染組兩者的符合率為84.03%，引起假陽(yáng)性的原因主要是由鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等的非ESBLs來源的耐藥菌株引起的，假陰性主要是因?yàn)榛颊吣驑?biāo)本中菌量較低或者患者采樣近期應(yīng)用抗生素等因素引起的。在可疑混合感染組兩者的符合率為70.58%，除了與可疑革蘭陰性桿菌感染組類似的原因，革蘭陽(yáng)性球菌以及念珠菌的干擾也是一個(gè)原因。在可疑陰性組，兩者的符合率高達(dá)99.77%，提示快速ESBLs篩查試驗(yàn)的陰性預(yù)測(cè)值對(duì)無細(xì)菌感染的尿標(biāo)本有很高的準(zhǔn)確性。ESBLs篩查試驗(yàn)?zāi)康膽?yīng)該是能夠最大程度的給醫(yī)生提供抗生素治療建議，雖然快速ESBLs篩查試驗(yàn)假陽(yáng)性較高，但是由于引起假陽(yáng)性菌株多是耐藥菌株，所以仍具有參考意義；針對(duì)假陰性患者，由于主要是因?yàn)槟驑?biāo)本中菌量較低引起，這部分患者一般都屬于慢性病患者，而且多經(jīng)過抗生素治療，可以考慮暫不治療等細(xì)菌培養(yǎng)分離確認(rèn)結(jié)果后再進(jìn)行治療?？焖貳SBLs篩查試驗(yàn)雖然有許多不完善，但是對(duì)于UTI臨床抗生素治療仍有很大的參考意義。

綜上所述，UTI感染和復(fù)發(fā)作為一種常見病，細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)用來指導(dǎo)UTI感染治療存在諸多不足，耗時(shí)較長(zhǎng)，受細(xì)菌生物膜影響體外藥敏試驗(yàn)敏感抗生素體內(nèi)無效等。所以如何合理應(yīng)用抗生素，有效治療UTI，減少?gòu)?fù)發(fā)，臨床實(shí)驗(yàn)室有許多工作要做?？焖貳SBLs篩查試驗(yàn)做為一種耐藥菌的初篩實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用有很大的局限性，但對(duì)于減少盲目用藥，避免無效治療，減輕患者負(fù)擔(dān)，避免更多的耐藥菌產(chǎn)生仍具有積極的意義。

1 齊慧敏,呂媛.衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2011年女性尿標(biāo)本來源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè).中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2012,28:899-904.

2 齊慧敏,呂媛,錢霞.衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2010年女性尿標(biāo)本來源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè).中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2011,27:913-918.

3 鄭波,呂媛.衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2011年男性尿標(biāo)本來源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè).中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2012,28:893-898.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.13.028

050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科

張海譜,050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科;

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2017-01-06)