融合胸腺素α1的豬干擾素α在畢赤酵母中的表達及效價測定

劉敏,張晨瑤,王飛,翟彥生,肖穎,馬立新,余曉嵐

(生物資源綠色轉化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

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融合胸腺素α1的豬干擾素α在畢赤酵母中的表達及效價測定

劉敏,張晨瑤,王飛,翟彥生,肖穎,馬立新,余曉嵐

(生物資源綠色轉化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

豬干擾素α(IFN-α)是在特定條件下由細胞產(chǎn)生的一種具有廣譜、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白，胸腺素α1(Tα1)是一種具有免疫調(diào)節(jié)的活性肽.本研究中將Tα1基因與去掉信號肽序列的豬IFN-α N端融合，構建酵母表達載體PHBM-Tα1-IFNα，同時構建單獨表達IFNα的重組質(zhì)粒PHBM-IFNα，重組質(zhì)粒電轉化至畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株，甲醛誘導表達.利用SDS-PAGE法檢測融合蛋白的表達，并用細胞病變抑制法測定干擾素的效價.實驗結果表明，酵母表達上清中IFNα的效價為2.916×106U/mL；Tα1-IFNα的效價為2.860×107U/mL，該結果證實胸腺素α1可提高融合表達蛋白豬干擾素的活性，因此，通過酵母表達體系獲得高活性胸腺素-豬干擾素融合蛋白，可為高效、低成本獲得抗病毒藥物提供一種新的模式.

干擾素； 胸腺素Tα1； 畢赤酵母表達系統(tǒng)； 細胞病變抑制法

0 引言

干擾素是在特定條件下由細胞產(chǎn)生的一種高活性、多功能、低分子量的可溶性糖蛋白，具有廣譜、高效抗病毒功能，且對免疫系統(tǒng)起速效多能的調(diào)節(jié)作用[1-2].干擾素根據(jù)免疫原性和分子結構的不同可分為3類：IFNα、IFNβ、IFNγ，IFNα因其獨特的抗病毒活性、促機體免疫功能強、毒副作用小而并倍受研究者的重視，常用于病毒性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的治療[3-7].臨床證明，IFNα是抗乙型肝炎病毒(HBV)、慢性乙型肝炎(CHB)的干擾素藥物中最具優(yōu)勢的一員，也是被FDA批準治療慢性丙型肝炎的藥品[8-9]，研究者利用IFNα聯(lián)合抗病毒藥物，對慢性丙型肝炎患者等具有不同程度的療效[10].IFNα具有調(diào)節(jié)免疫的功能，可作為免疫佐劑，增強特異性免疫應答，Schijns V等用破傷風毒素作為細菌抗原模型免疫3周齡的雞，發(fā)現(xiàn)重組雞IFNα可調(diào)節(jié)其體液免疫應答的產(chǎn)生[11-12].

胸腺肽Tα1是由28個氨基酸殘基組成的高度保守的酸性肽，可促進免疫系統(tǒng)的活化.干擾素和胸腺肽具有相似和相輔相成的生物活性，它們的聯(lián)合應用具有促進T細胞的生長、增殖、分化和激活NK細胞活性等功能，并有協(xié)同作用，可增強機體的免疫能力，對腫瘤和艾滋病以及其他病毒性疾病的治療作用比它們單獨使用時更強[13].已有研究者在大腸桿菌和家蠶中表達了人和雞干擾素α2a和胸腺肽α1融合蛋白，但這些融合蛋白共同之處都是將胸腺肽α1融合在干擾素C端，有的沒有加連接肽，有的連接肽為5個氨基酸(GGGGS)，有的連接肽為12個氨基酸，有的連接肽為15個氨基酸(3個重復的GGGGS)[14-16]，雖然這些融合蛋白能在大腸桿菌和家蠶系統(tǒng)中有效表達，但仍需研究者探討新的表達方法提高其活性.

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)因其具有原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點而廣泛應用于蛋白表達[17].目前少見豬IFNα與胸腺肽融合后在酵母表達系統(tǒng)中表達的研究報道，鑒于酵母系統(tǒng)的易操作、低成本的優(yōu)點，我們擬將豬IFNα與胸腺肽α1融合蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中表達.主要通過在豬IFNα的N端融合胸腺肽α1，以G-G-G-G-S為單位的2個重復作為連接肽，選擇在畢赤酵母中表達該融合蛋白，并比較融合胸腺肽α1的豬IFNα與未融合胸腺肽α1的豬IFNα的效價差異，以期為獲得高效抗病毒藥物奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細胞和病毒 大腸桿菌菌株XL10-Gold購自Stratagen 公司，畢赤酵母GS115菌株、含有胸腺肽的干擾素基因的菌株ABV25019購自Novagen 公司，細胞MDBK、病毒VSV購自于武漢大學菌種典藏中心，質(zhì)粒pHBM905A由本實驗室保存，質(zhì)粒PHBM-Tα1-IFNα、PHBM-IFNα由本實驗室構建.

1.2 主要試劑 培養(yǎng)基LB、NZY、YPD、MD、BMGY、BMMY按常規(guī)方法配制，細胞培養(yǎng)及牛血清均購自GIBCO公司，各種限制性核酸內(nèi)切酶、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、SolutionI購自TaKaRa公司，DNA純化試劑盒購自Vitagene公司，引物(表1) 均在上海桑尼生物科技有限公司合成，其他化學試劑均為分析純.

1.3 方法

1.3.1 IFNα密碼子優(yōu)化及基因合成 IFNα(GenBankTM accession number AY687280)的原始序列為570 bp，其前69個堿基序列為該基因在Sus scrofa中的信號肽序列.本研究中，該信號肽序列被畢赤酵母表達載體中的信號肽序列α-MF代替.在蛋白質(zhì)序列不改變的前提下，對去掉信號肽序列的IFNα序列利用DNAWORKS工具進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列IFNα全部由畢赤酵母偏愛密碼子組成，依照此序列合成獲得IFNα基因的引物，通過overlapping PCR方法獲得IFNα全長基因，送上海英俊生物公司測序.1.3.2 IFNα畢赤酵母表達載體的構建及重組酵母菌株的獲得 將酶切處理的pHBM905A載體和IFNα片段混合，在16 ℃條件下，用SolutionⅠ處理3 h后，轉化大腸桿菌XL10-Gold， PCR鑒定為陽性的重組子隨機挑選3個送上海捷瑞生物工程有限公司測序，陽性重組質(zhì)粒命名為pHBM-IFNα.然后按常規(guī)方法轉化至酵母菌株中，PCR鑒定轉入與否.

1.3.3 重組IFNα在畢赤酵母中表達SDS-PAGE分析 挑取待表達的重組畢赤酵母單菌落于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基中(按≤10%裝瓶)，28 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=20.收集菌體，去上清，細胞沉淀全部轉移至50 mL BMMY液體培養(yǎng)基中，250 r/min，每隔24 h加入甲醇誘導一次，甲醇加入量為培養(yǎng)基總體積的1%.收集誘導表達上清按常規(guī)方法進行SDS-PAGE檢測外源基因是否表達.

表1 引物序列

1.3.4 Tα1和Tα1-IFNα片段克隆 按照GenBank TM accession number ABV25019的表達菌株含有的Tα1的序列合成引物，然后通過同源臂的PCR方式獲得Tα1基因，再以PCR方式獲得全長Tα1-IFNα片段，PCR鑒定片段大小正確與否.

1.3.5 Tα1-IFNα畢赤酵母表達載體的構建、轉化及鑒定 參照方法1.3.2，獲得Tα1-IFNα的畢赤酵母表達載體，然后按照常規(guī)的方法轉化酵母菌株，PCR檢測鑒定，經(jīng)甲醇誘導后SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達情況.

2 結果

2.1 IFNα基因的合成和畢赤酵母表達載體的構建 按照表1中的引物序列合成引物，利用overlapping PCR方法，以IFNα的18條引物互為模板退火、延伸，30循環(huán)反應后以瓊脂凝膠回收PCR產(chǎn)物，用該回收產(chǎn)物為模板，以IFNα-1、IFNα-18為引物進行第二次PCR擴增.PCR結果如圖1所示，在約500 bp處有明顯的條帶.回收該片后序列測定證實，獲得片段的基因序列與預期的IFNα的完全一致.

2.2 重組質(zhì)粒pHBM-IFNα的構建及重組酵母菌株獲得 用CopⅠ和NotⅠ酶切pHBM905A載體，產(chǎn)物均為含有粘性末端的線性片段，瓊脂糖凝膠回收酶切產(chǎn)物.用T4 DNA聚合酶和dTTPs消化瓊脂糖凝膠回收的全長IFNα基因片段，這時IFNα會產(chǎn)生成與pHBM905A載體經(jīng)酶切后互補的粘性末端.將全長IFNα基因與載體連接后轉化至大腸桿菌XL10-Gold，抽提質(zhì)粒PCR和序列測定鑒定，并將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pHBM-IFNα(見圖2).

圖1 IFNα PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析M: λEco T14 DNA Marker; 1,2: IFNα PCR product.

圖2 IFNα畢赤酵母重組子鑒定18: pHBM-IFNα recombinants plasmids isolated from E.coli XL10-Gold strain.9: pHBM905A control vector isolated from E.coli XL10-Gold strain.

2.3 重組 IFNα在畢赤酵母中表達鑒定 將方法1.3.2中挑取待表達的重組畢赤酵母單菌落于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基中(按≤10%裝瓶)，28 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=20.收集菌體，去上清，細胞沉淀全部轉移至50 mL BMMY液體培養(yǎng)基中，250 r/min，每隔24 h加入甲醇誘導一次，甲醇加入量為培養(yǎng)基總體積的1%.誘導一周后，收集的表達上清，加入樣品處理液，進行SDS-PAGE電泳檢測，考馬斯亮藍染色.檢測結果如圖4所示，在約21 kD處出現(xiàn)特異性條帶，蛋白大小與IFNα預期一致，同時，在大于21 kD處也出現(xiàn)了一條糖基化的IFNα條帶，該結果證實IFNα在畢赤酵母菌株中成功表達.

2.4 Tα1和Tα1-IFNα片段克隆 以原有融合胸腺肽的干擾素基因(GenBankTM accession number ABV25019)的表達菌株為模板，用905A-ifn-F、905A-ifn-R兩條引物擴出融合胸腺肽Tα1的IFN片段.回收處理后以IFN片段為模板，用Tα1-F、Tα1-R兩條引物擴出胸腺肽Tα1片段，PCR結果如圖5所示，獲得片段大小與預期相符.

圖3 IFNα畢赤酵母轉化子PCR鑒定M: λEco T14 DNA Marker.13: pHBM-IFNα transformed Pichia pastoris colonies. 4: pHBM905A transformed Pichia pastoris colonies.

圖4 IFNα在畢赤酵母中表達SDS-PAGE鑒定M: Protein Marker. 1: IFNα protein.

圖5 胸腺肽Tα1的PCR鑒定12: Tα1PCR product.

以IFN片段為模板，用Tα1-IFNα、IFNα-18兩條引物擴出IFNα+(與胸腺肽Tα1帶17個bp的同源臂).然后再以胸腺肽Tα1和IFNα+ 為模板，用Tα1-F和IFNα-18兩條引物擬擴出Tα1-IFNα，PCR結果如圖6所示，片段大小與預期相符，同時將PCR產(chǎn)物回收后送上海生工進行序列測定，結果表明片段序列與預期完全一致.

2.5 Tα1-IFNα畢赤酵母表達載體的構建 按照2.2中用CopⅠ和NotⅠ酶切pHBM905A載體，產(chǎn)物為含有粘性末端的線性片段，然后瓊脂糖凝膠回收酶切產(chǎn)物.然后，在T4 DNA聚合酶處理2.3中回收的Tα1-IFNα體系中加入dTTPs，Tα1-IFNα會產(chǎn)生成與pHBM905A載體經(jīng)酶切后互補的粘性末端.最后，將酶切好的pHBM905A載體和Tα1-IFNα片段混合，在16 ℃條件下，用SolutionⅠ處理3 h后，轉化大腸桿菌XL10-Gold，重組子經(jīng)PCR鑒定(圖7) 有一個樣品的條帶大小與預期相符.將與預期大小相符的重組子抽提質(zhì)粒后送上海測序，測序結果顯示序列與預期完全一致，將質(zhì)粒命名為pHBM-Tα1-IFNα.

圖6 Tα1-IFNα PCR鑒定13: Tα1-IFNα PCR product.

圖7 畢赤酵母Tα1-IFNα重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定16, 8: PCR product from pHBM905A E.coli XL10-Gold strain. 7: PCR product from pHBM-Tα1-IFNα E.coli XL10-Gold strain.Tα1-IFNα PCR product. M: λEco T14 DNA Marker.

圖8 pHBM-Tα1-IFNα畢赤酵母轉化子PCR鑒定M: λEco T14 DNA Marker.12: pHBM-IFNα transformed Pichia pastoris colonies.

圖9 Tα1-IFNα 融合蛋白的SDS-PAGE鑒定1: Control. 2: Tα1-IFNα protein. M： protein marker.

3 討論

豬IFNα是一種具有廣譜的抗病毒活性的細胞因子，具有高效、無藥物殘留、無副作用等優(yōu)點，Tα1也是一種具有免疫活性的生態(tài)制劑，與多種藥物聯(lián)合使用有促進作用，其中包括與IFNα同時使用具有互促和疊加效應，能明顯提高抗病毒效果[18-21].臨床上使用的Tα1主要是靠人工合成，利用低成本研制出高效的胸腺肽以及胸腺肽與干擾素的融合蛋白一直是研究者探討的方向.有研究者探討了利用大腸桿菌表達Tα1-IFNα，旨在降低生產(chǎn)成本并提高兩者抗病毒功效.盡管張鵬等[22]成功表達了Tα1-IFNα融合蛋白，但可能由于大腸桿菌系統(tǒng)表達的蛋白結構簡單，沒有復雜的修飾，因此也少見該產(chǎn)品在生產(chǎn)實際中的應用.也有研究者在畢赤酵母中單獨表達了人Tα1-IFNα融合蛋白，其效價高、類天然結構、毒素含量低以及安全，為人類研究新的抗病毒制劑提供了一種模式[23-24]，但目前仍少見在畢赤酵母中表達Tα1-IFNα的相關研究報道.

本研究分別將單獨豬IFNα及豬IFNα與胸腺素α1(Tα1)的融合蛋白Tα1-IFNα在畢赤酵母中進行表達，并且比較了這兩種蛋白在抗病毒效價上的差異.與傳統(tǒng)的克隆表達方法相比，本研究具有的優(yōu)勢是：利用基因合成的方法合成了豬IFNα，可根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性進行優(yōu)化后合成，該方法獲得的基因既不受基因資源的限制，又可高效獲得突變體；利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達豬IFNα、Tα1-IFNα，易于純化，表達的蛋白經(jīng)過酵母系統(tǒng)的修飾，具有類似于天然狀態(tài)的活性；干擾素和胸腺肽具有相似和相輔相成的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)，這種融合方式表達可將它們的優(yōu)勢進行疊加.我們將在畢赤酵母中單獨或融合表達的蛋白經(jīng)用細胞病變抑制法測定了其效價，結果表明這兩種重組蛋白都具顯著的生物學活性，都能有效抑制VSV對MDCK細胞的病變效應，其中IFNα的效價為2.916×106U/mL；Tα1-IFNα的效價為2.86×107U/mL，從該結果可以看出，與Tα1融合的豬干擾素的抗病毒效價明顯高于單獨表達的豬IFNα的抗病毒效價，這與以前研究的Tα1能促進與其融合藥物的效價結果相符[20-21].

豬IFNα與Tα1融合表達后雖然在抗病毒方面出現(xiàn)了一些疊加效應，但并未達到我們預期的效果，分析原因可能是產(chǎn)生了復雜的糖基化，封閉了干擾素的活性位點，進而影響其效價.因此可對該研究中表達融合蛋白Tα1-IFNα的菌株誘導表達條件進行探討，提高表達量同時降低蛋白的糖基化；同時我們也可以通過Bio-brick的方法將目的片段的表達單元串聯(lián)起來，增加拷貝數(shù)量，從而在一定程度上提高表達量.該研究在畢赤酵母中所表達的融合豬干擾素Tα1-IFNα對VSV具有較強的抗病毒活性，較之單獨在畢赤酵母表達的豬干擾素IFNα，表現(xiàn)出一定程度的疊加效應，因此，用畢赤酵母系統(tǒng)表達與Tα1融合豬干擾素Tα1-IFNα的方法，可望為養(yǎng)豬業(yè)提供一種新的抗病毒藥物制備模式.

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(責任編輯 游俊)

Expression,characterization of the porcine interferon α-thymosin α1 fusion protein a inPichiapastoris

LIU Min, ZHANG Chenyao, WANG Fei, ZHAI Yansheng, XIAO Ying, MA Lixin, YU Xiaolan

(Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio-resources, College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062,China)

Porcine interferon α(IFNα) is a broad-spectrum, highly efficient antiviral glycoprotein which is produced by cells in the specific conditions. Thymosin alpha 1(Tα1) is a kind of immune regulation peptide. Here, we constructed the fusion protein vector pHBM-Tα1-IFNα, putting Tα1 gene on the N terminal of porcine IFNα gene with the yeast expression vector pHBM respectively. The recombinant plasmids were electroporated intoPichiapastorisstrain and induced to express by formaldehyde. The fusion proteins were detected by SDS-PAGE method. We tested the potency of fusion interferon by cytopathic inhibition method. Results showed that the titer in the supernatant of yeast expression of IFNα was 2.916×106U/mL, and the Tα1-IFNα titer was 2.860×107U/mL. These results confirmed that the Tα1 could increase the activity of fusion porcine interferon. Therefore, the higher activity of porcine interferon by fusing Tα1 inPichiapastorisyeast expression system may provide a new model for developing high efficiency and low cost antiviral drugs.

interferon; thymosin alpha 1;Pichiapastorisexpression system; CPE reduction assay

2016-11-14

國家自然科學基金(31172320、31672561)資助

劉敏(1994-)，女，碩士生；余曉嵐，通信作者，副教授，E-mail: yxiaolan@163.com

1000-2375(2017)04-0347-07

Q939.91；Q782

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.04.004