青海地區(qū)不同海拔藏漢民族子癇前期患者人類白細胞抗原G表達研究

謝瑩鶯，趙海寧，裴青青，曲新霞，張振平，趙得雄

·論著·

青海地區(qū)不同海拔藏漢民族子癇前期患者人類白細胞抗原G表達研究

謝瑩鶯1*，趙海寧1，裴青青1，曲新霞1，張振平1，趙得雄2

目的 探討青海地區(qū)不同海拔藏漢民族子癇前期患者的人類白細胞抗原G(HLA-G)表達情況。方法 選取2015年1月—2016年1月在青海大學附屬醫(yī)院分娩的漢族產婦30例(海拔2 200 m)，其中子癇前期16例，正常妊娠14例；另選取同期在玉樹藏族自治州人民醫(yī)院分娩的藏族產婦21例(海拔3 700 m)，其中子癇前期10例，正常妊娠11例。采用實時定量聚合酶鏈式反應法和蛋白質印跡法檢測不同情況產婦胎盤組織中的HLA-G mRNA和蛋白表達。結果 不同情況產婦HLA-G mRNA和蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低海拔漢族子癇前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子癇前期產婦HLA-G mRNA和蛋白表達低于低海拔漢族正常妊娠產婦，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高海拔藏族子癇前期產婦HLA-G mRNA和蛋白表達低于高海拔藏族正常妊娠產婦，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高海拔藏族子癇前期產婦HLA-G蛋白表達低于低海拔漢族子癇前期產婦，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而低海拔漢族子癇前期產婦與高海拔藏族正常妊娠產婦HLA-G mRNA和蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低海拔漢族子癇前期產婦與高海拔藏族子癇前期產婦HLA-G mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 高原慢性低氧環(huán)境可能影響HLA-G基因的表達，不同海拔藏漢民族HLA-G的差異性表達可能在青海高原地區(qū)子癇前期的發(fā)病過程中起重要作用，是導致高原地區(qū)子癇前期發(fā)病率高的原因之一。

先兆子癇；HLA抗原；高海拔；藏族；漢族

謝瑩鶯，趙海寧，裴青青，等.青海地區(qū)不同海拔藏漢民族子癇前期患者人類白細胞抗原G表達研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(16)：1978-1982.[www.chinagp.net]

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子癇前期是妊娠期特有疾病，嚴重影響母嬰健康。在我國，妊娠期高血壓的發(fā)病率為5%～12%[1]133，青海地區(qū)的子癇前期發(fā)病率為12%～15%，高原地區(qū)子癇前期發(fā)病率高于平原地區(qū)，且子癇前期發(fā)病率隨海拔的升高呈明顯上升趨勢[2]。人類白細胞抗原G(HLA-G)是一種可受應激誘導的蛋白質分子，高原慢性低氧環(huán)境可能會影響HLA-G基因的表達，是導致高海拔地區(qū)子癇前期發(fā)病率較高的原因之一[3]。本研究采用實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白質印跡(western blotting)法檢測HLA-G mRNA和蛋白的表達，并探討不同海拔藏漢民族的HLA-G表達差異及其與子癇前期發(fā)病的關系，從而為高原低氧條件下導致HLA-G表達降低的假說提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2016年1月在青海大學附屬醫(yī)院分娩的漢族產婦30例(海拔2 200 m)，其中子癇前期16例，正常妊娠14例；另選取同期在玉樹藏族自治州人民醫(yī)院分娩的藏族產婦21例(海拔3 700 m)，其中子癇前期10例，正常妊娠11例。子癇前期的診斷標準參照《婦產科學》(8版)[1]114-116。納入標準：(1)世居西寧市/玉樹藏族自治州的原著居民；(2)分娩方式為剖宮產；(3)正常妊娠婦女，無高血壓、蛋白尿癥狀，無急、慢性傳染性疾病，無不良孕產史；(4)子癇前期患者妊娠20周后，出現收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mm Hg，伴蛋白尿≥0.3 g/h或隨機尿蛋白(+)。排除標準：(1)伴原發(fā)和繼發(fā)性高血壓者；(2)合并內、外科疾病者；(3)多胎妊娠者。本研究通過了青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，納入產婦均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 由經過統(tǒng)一培訓的研究生通過醫(yī)院醫(yī)療護理系統(tǒng)記錄納入產婦的一般資料，包括年齡、孕周、體質量、收縮壓、舒張壓、孕產史等。

1.2.2 HLA-G表達檢測

1.2.2.1 標本采集 剖宮產術中取新鮮胎盤組織，于胎盤母體面中央剪取約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織數塊，經0.9%氯化鈉溶液處理后置于無菌離心(EP)管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法，以人β-肌動蛋白(β-actin)為內參照基因。胎盤總RNA提取按RnaExTM Total RNA Isolation Solution (GENEray，GK3006)說明書進行，總RNA采用Rayscript cDNA Synthesis KIT(GENEray，GK8030)進行反轉錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。cDNA序列和β-actin序列由Invitrogen公司設計并合成，引物序列見表1。SYBR Green Mix和引物混合物配置為Mix 10.0 μl+引物1.0 μl，采用SYBR Green 10 μl體系(cDNA模板5.0 μl、Mix+引物5.0 μl)，在ABI 7500 Real Time PCR儀上進行聚合酶鏈式反應(PCR)反應。條件為95 ℃預變性：10 min，1個循環(huán)；變性：95 ℃ 10 s，退火延伸：60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；溶解曲線采集：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，1個循環(huán)。反應結束后，生成熒光反應曲線，以PCR循環(huán)數閾值(cycle threshold，Ct)表示HLA-G的mRNA表達水平，基因的相對表達水平為2-ΔΔCt。

表1 RT-PCR引物序列

注：RT-PCR=實時定量聚合酶鏈式反應，HLA-G=人類白細胞抗原G，β-actin=β-肌動蛋白

1.2.2.3 蛋白表達檢測 采用western blotting法。取胎盤組織約100 mg，加入1 ml TPEB9〔使用前需加入苯甲基磺酰氟(PMSF)〕提取組織蛋白，采用BCA蛋白定量試劑對蛋白質進行定量，蛋白質變性后上樣30 g，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，膠濃度為12.5%，電泳條件為200 V、45 min，轉膜條件為200 mA，2 h，采用5%脫脂奶粉(TBST配制)于室溫下封閉2 h。加入一抗(MEM-G/1小鼠抗人單克隆抗體，美國abcam公司)1∶200稀釋，室溫下孵育2 h；1∶2 000稀釋的二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG抗體，中杉金橋〕，室溫孵育1 h。以β-actin為內參照(Mouse β-actin抗體稀釋比例為1∶5 000)，使用EasySee Western Blot Kit發(fā)光液孵育1 min，柯達醫(yī)用膠片曝光顯影。

2 結果

2.1 不同情況產婦一般資料比較 不同情況產婦年齡、孕周、體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；收縮壓、舒張壓比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.2 不同情況產婦HLA-G mRNA和蛋白表達比較 不同情況產婦HLA-G mRNA和蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

(1)mRNA：低海拔漢族子癇前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子癇前期產婦與低海拔漢族正常妊娠產婦HLA-G mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高海拔藏族子癇前期產婦與高海拔藏族正常妊娠產婦HLA-G mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而低海拔漢族子癇前期產婦與高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子癇前期產婦HLA-G mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

(2)蛋白：低海拔漢族子癇前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子癇前期產婦與低海拔漢族正常妊娠產婦HLA-G蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高海拔藏族子癇前期產婦與低海拔漢族子癇前期、高海拔藏族正常妊娠產婦HLA-G蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而低海拔漢族子癇前期產婦與高海拔藏族正常妊娠產婦HLA-G蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3、圖1)。

表2 不同情況產婦一般資料比較

注：與低海拔漢族正常妊娠比較，aP<0.05；與低海拔漢族子癇前期比較，bP<0.05；與高海拔藏族正常妊娠比較，cP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

表3 不同情況產婦HLA-G mRNA和蛋白表達比較〔M(QR)〕

Table 3 Comparison of the expression of HLA-G mRNA and protein among subjects in different conditions

一般情況例數mRNA蛋白低海拔漢族正常妊娠141.01(0.41)96.28(9.76)低海拔漢族子癇前期160.47(0.17)a70.84(29.81)a高海拔藏族正常妊娠110.72(0.19)a82.41(4.67)a高海拔藏族子癇前期100.30(0.16)ac10.91(3.41)abcF值17.6048.59P值<0.001<0.001

注：與低海拔漢族正常妊娠比較，aP<0.05；與低海拔漢族子癇前期比較，bP<0.05；與高海拔藏族正常妊娠比較，cP<0.05

注：HLA-G=人類白細胞抗原G，β-actin=β-肌動蛋白

圖1 不同情況產婦胎盤組織中HLA-G蛋白表達

Figure 1 Expression of HLA-G protein in placenta among subjects in different conditions

3 討論

3.1 高原地區(qū)子癇前期的發(fā)病情況 青海地處青藏高原，其中玉樹藏族自治州等廣大牧區(qū)位于青南青藏高原腹地的三江源頭，自然條件嚴酷。自2010年“玉樹 4.14 地震”后，本科醫(yī)生輪流常年駐守玉樹藏族自治州醫(yī)院婦產科，發(fā)現當地育齡期婦女飽受妊娠期高血壓的困擾，嚴重影響了母嬰健康。低氧是導致妊娠期高血壓高發(fā)的原因之一，現有研究結果表明高原地區(qū)妊娠期高血壓較平原地區(qū)高發(fā)[2]。青海高原地區(qū)的發(fā)病率為12%～15%，與國外報道的高海拔地區(qū)孕婦發(fā)展為妊娠期高血壓風險升高3～4倍的結果基本吻合[4]。吳翠群[5]對迪慶高原地區(qū)妊娠期高血壓的發(fā)病情況進行了調查，發(fā)現隨著海拔的升高，子癇前期發(fā)病趨勢明顯上升，尤其是3 000 m以上的高海拔地區(qū)發(fā)病率明顯高于3 000 m以下地區(qū)。張軍等[6]對西藏不同海拔地區(qū)妊娠期高血壓的調查發(fā)現，漢族孕產婦妊娠期高血壓的發(fā)病率高于世居藏族孕產婦，但隨著居住地區(qū)海拔的升高，無論藏族還是漢族孕產婦的妊娠期高血壓發(fā)病率均升高。BROWNE等[7]的研究發(fā)現，在高海拔地區(qū)妊娠時低體質量兒、小于孕齡兒及子癇前期的發(fā)病率均增加，可能歸因于胎盤組織低氧和子宮胎盤供血量降低，高海拔低氧環(huán)境影響胎盤鄰近子宮動脈和末梢子宮小動脈的循環(huán)。目前為止，子癇前期的發(fā)病原因不詳，尤其在高海拔地區(qū)子癇前期發(fā)病率高的原因有待進一步研究。

3.2 HLA-G與子癇前期的關系 近年來關于子癇前期易感基因的研究頗多，而HLA-G是一種人類主要組織相容性復合物(MHC)抗原，與妊娠關系密切[8]，具有有限的基因多態(tài)性、限制性組織分布、特殊的選擇性剪切模式等特征[9]。同時，HLA-G參與了胎盤細胞滋養(yǎng)細胞侵入子宮螺旋動脈的過程，使胎兒免受母體免疫細胞的攻擊[10]。以上特點和功能決定了其在維持母胎免疫耐受方面的作用以及和生殖免疫功能的密切相關性。趙三存等[11]在孕婦外周血、胎盤組織及臍血中的研究發(fā)現，HLA-G在子癇前期呈明顯低表達，HLA-G水平降低可能與子癇前期的發(fā)病機制有關。ZHU等[12]通過對正常妊娠和重度子癇前期產婦的胎盤組織中 HLA-G mRNA和蛋白進行定量檢測，發(fā)現子癇前期產婦胎盤組織中HLA-G mRNA和蛋白表達明顯降低，HLA-G 的表達異?？赡芘c子癇前期發(fā)病有關。本課題組在青海高原地區(qū)的前期研究結果表示，子癇前期患者血清和胎盤組織中的HLA-G表達均低于正常產婦，HLA-G可能參與了高原地區(qū)子癇前期的發(fā)生，且與病情嚴重程度有關；但因試劑、實驗方法等因素的影響，與平原地區(qū)的差異無法做出精確對比[3]。關于高海拔地區(qū)子癇前期發(fā)病率的臨床研究較多，但關于高度低氧環(huán)境下發(fā)病機制的研究較少，故研究高原低氧環(huán)境下妊娠期高血壓發(fā)病率高的原因顯得尤為緊迫和重要。

3.3 本研究意義及進一步計劃 HLA-G與子癇前期的相關性是近年國內外較為關注的課題，本課題組在前期研究的基礎上，采用RT-PCR法和western-blotting法首次檢測了青海地區(qū)子癇前期患者在不同海拔高度下胎盤組織及血清中HLA-G mRNA和蛋白的表達差異，試圖從分子和免疫水平論證隨著海拔的升高和低氧環(huán)境的不斷擴大，子癇前期的發(fā)病率增加的原因。結果表明，在海拔3 700 m的玉樹地區(qū)藏族子癇前期產婦HLA-G mRNA和蛋白表達低于同地區(qū)藏族正常妊娠產婦；在海拔2 200 m的西寧地區(qū)漢族子癇前期產婦HLA-G蛋白表達低于同地區(qū)漢族正常妊娠產婦；同時海拔3 700 m藏族正常妊娠產婦HLA-G mRNA和蛋白表達也低于海拔2 200 m漢族正常妊娠產婦；海拔3 700 m藏族子癇前期產婦HLA-G蛋白表達亦低于海拔2 200 m漢族子癇前期產婦；但海拔2 200 m漢族子癇前期產婦與海拔3 700 m藏族正常妊娠產婦的HLA-G mRNA和蛋白表達間無差異，可能由低氧環(huán)境對HLA-G的影響所致。綜上所述，高原慢性低氧環(huán)境可能影響HLA-G基因的表達，是導致高海拔地區(qū)子癇前期發(fā)病高的原因之一，并且隨著海拔高度的增加HLA-G的表達水平呈下降趨勢。本課題組下一步計劃研究在青海地區(qū)，藏漢民族間HLA-G基因型的差異性與子癇前期易感性和疾病發(fā)展間的相關性。從而從民族基因多態(tài)性角度，闡述青海地區(qū)子癇前期患病率高的可能原因，并為疾病的預測和基因治療提供重要線索。

作者貢獻：謝瑩鶯進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析、結果的分析與解釋，撰寫論文，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理；趙海寧、趙得雄進行數據收集；裴青青進行數據整理；曲新霞進行論文的中英文修訂；張振平進行統(tǒng)計學處理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：王鳳微)

Expression of Human Leucocyte Antigen G in Tibetan and Han Patients with Preeclampsia at Different Altitudes of Qinghai Area

XIEYing-ying1*,ZHAOHai-ning1,PEIQing-qing1,QUXin-xia1,ZHANGZhen-ping1,ZHAODe-xiong2

1.DepartmentofObstetrics,AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China2.DepartmentofObstetrics,QinghaiRedCrossHospital,Xining810000,China*Correspondingauthor:XIEYing-ying,Chiefphysician,Mastersupervisor;E-mail:xyy09001@163.com

Objective To investigate the expression of human leucocyte antigen G(HLA-G) in Tibetan and Han patients with preeclampsia at different altitudes of Qinghai Area.Methods 30 Han puerperas delivered in Affiliated Hospital of Qinghai University(an altitude of 2 200 m) from January 2015 to January 2016 were selected,and among them 16 with preeclampsia,14 of normal pregnancy;another 21 Tibetan puerperas delivered in Yushu Tibetan Autonomous Prefecture Hospital(an altitude of 3 700 m) during the same period were also selected,and among them 10 with preeclampsia,11 of normal pregnancy.The expression of HLA-G mRNA and protein in maternal placenta was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blotting.Results There were significant differences in expression of HLA-G mRNA and protein among puerperas in different situations(P<0.05).The expression of HLA-G mRNA and protein among Han puerperas with preeclampsia at low altitudes,Tibetan puerperas of normal pregnancy at high altitudes and Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Han puerperas of normal pregnancy at low altitudes(P<0.05).The expression of HLA-G mRNA and protein of Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Tibetan puerperas of normal pregnancy at high altitudes(P<0.05).The expression of HLA-G protein of Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Han puerperas with preeclampsia at low altitudes(P<0.05),while there was no significant difference in the expression of HLA-G mRNA and protein between Han low-altitude puerperas with preeclampsia and Tibetan high-altitude puerperas of normal pregnancy(P>0.05).There was no significant difference in the expression of HLA-G mRNA between Han low-altitude puerperas with preeclampsia and Tibetan high-altitude puerperas with preeclampsia(P>0.05).Conclusion The chronic hypoxia environment in plateau may affect the expression of HLA-G gene.The differential expression of HLA-G in Tibetan and Han nationalities at different altitudes may play an important role in the pathogenetic process of preeclampsia in Qinghai plateau area,and is one of the causes of high incidence of preeclampsia in the plateau region.

Pre-eclampsia;HLA antigens;Altitude;Zang nationality;Han nationality

青海省(應用)基礎研究計劃項目(2013-Z-736)

R 714.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.16.015

2016-12-03；

2017-03-20)

1.810001 青海省西寧市，青海大學附屬醫(yī)院產科

2.810000 青海省西寧市，青海紅十字醫(yī)院產科

*通信作者：謝瑩鶯，主任醫(yī)師，碩士生導師；E-mail：xyy09001@163.com