miR-142-3p通過靶向CD133抑制鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽癌干細(xì)胞生長的效果研究

湯國輝，張志偉，黃衛(wèi)國，謝運杰，刑佼濤，賀修勝*

·論著·

miR-142-3p通過靶向CD133抑制鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽癌干細(xì)胞生長的效果研究

湯國輝1，張志偉2，黃衛(wèi)國2，謝運杰2，刑佼濤1，賀修勝2*

目的 明確miR-142-3p能否通過靶向CD133的表達(dá)進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，探討miR-142-3p在抑制腫瘤生長中的分子機(jī)制。方法 于2015年7月—2016年9月，構(gòu)建CD133mRNA 3′-UTR熒光素酶報告載體，通過熒光素酶報告系統(tǒng)觀察miR-142-3p對CD133mRNA 3′-UTR熒光素酶活性的影響。將對照control、CD133siRNA及miR-142-3p模擬物各40 μmol/L分別轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞，采用Western blotting法檢測其對CD133表達(dá)水平的影響；設(shè)立陰性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染對照control(40 μmol/L)〕、陽性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染CD133siRNA(40 μmol/L)〕、miR-142-3p組〔瞬時轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)〕、聯(lián)合組〔瞬時共轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕，MTS法檢測4組對CNE2細(xì)胞增殖活性的影響，Transwell法檢測4組對CNE2細(xì)胞侵襲能力的影響，干細(xì)胞成球?qū)嶒灆z測陰性對照組和miR-142-3p組對CNE2干細(xì)胞成球能力的影響。結(jié)果 單光子熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，無miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Wt型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.924±0.107)，miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Wt型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.535±0.035)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.924，P=0.022)。Western blotting法檢測結(jié)果顯示，陰性對照組、陽性對照組、miR-142-3p組CD133表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.44，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組CD133表達(dá)水平低于陰性對照組(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、miR-142-3p組、聯(lián)合組CNE2細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.78，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組CNE2細(xì)胞數(shù)量低于陰性對照組(P<0.05)。Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，陰性對照組、陽性對照組、miR-142-3p組、聯(lián)合組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.19，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量低于陰性對照組(P<0.05)。陰性對照組和miR-142-3p組干細(xì)胞成球數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.92，P<0.05)。結(jié)論 miR-142-3p通過靶向調(diào)控CD133的表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及干細(xì)胞球的形成。

鼻咽腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

湯國輝，張志偉，黃衛(wèi)國.miR-142-3p通過靶向CD133抑制鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽癌干細(xì)胞生長的效果研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(17)：2085-2088，2094.[www.chinagp.net]

TANG G H,ZHANG Z W,HUANG W G,et al.miR-142-3p suppresses the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells and stem cells by targeting CD133[J].Chinese General Practice，2017，20(17)：2085-2088，2094.

microRNAs(miRNAs)參與調(diào)控生物的生長發(fā)育等過程，在細(xì)胞的分化、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和衰老等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，miR-142-3p在多種腫瘤的組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)[2-3]，其可通過調(diào)控ABCG2、Lgr5等基因抑制腸癌細(xì)胞的增殖能力[4]。為探討miR-142-3p在鼻咽癌中的作用及機(jī)制，本研究擬通過熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blotting法、MTS增殖實驗、Transwell侵襲實驗等分子生物學(xué)技術(shù)證實miR-142-3p在鼻咽癌中是否通過靶向調(diào)控CD133的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)一步揭示miR-142-3p抑制鼻咽癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實驗于2015年7月—2016年9月進(jìn)行。鼻咽癌CNE2細(xì)胞為人惡性鼻咽癌細(xì)胞，來自南華大學(xué)腫瘤研究所。miR-142-3p模擬物和陰性對照control為美國Ambion公司產(chǎn)品。CD133小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)由美國Invitorgen公司合成。鼠抗人CD133抗體和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，MTS細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒購自Promega公司。鋪有基質(zhì)膠的Transwell侵襲小室購自BD Biosciences公司。CD133過表達(dá)載體〔pcDNA3.1(+)-CD133〕購自GeneCopeia公司。

1.2 PROM1-3′-UTR(PROM1編碼CD133蛋白)熒光素酶報告載體的構(gòu)建 通過TargetScan軟件6.2版本和miRanda軟件檢索miR-142-3p的靶基因，預(yù)測結(jié)果顯示miR-142-3p可能與CD133mRNA 3′-UTR(第287～294位堿基)結(jié)合。根據(jù)CD133mRNA 3′-UTR序列，設(shè)計末端帶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的特異性引物：以CNE2細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增CD133mRNA 3′-UTR。通過純化、連接等步驟進(jìn)行構(gòu)建，挑取陽性克隆并測序鑒定。構(gòu)建獲得的野生型CD133mRNA 3′-UTR-熒光素酶報告載體命名為pCD133-Wt；突變型CD133mRNA 3′-UTR-熒光素酶報告載體命名為pCD133-Mut。

1.3 熒光素酶活性的檢測 采用脂質(zhì)體法將熒光素酶報告載體(pCD133-Wt和pCD133-Mut)分別與miR-142-3p模擬物或?qū)φ誧ontrol共轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞。同時轉(zhuǎn)染pRL-TK載體作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞，并用熒光素酶活性試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性分析。置入單光子檢測儀測定，計算并統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1.4 Western blotting法檢測CD133表達(dá)情況 將對照control(陰性對照組)、CD133siRNA(陽性對照組)及miR-142-3p模擬物(miR-142-3p組)各40 μmol/L分別轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，用含1%牛血清清蛋白封閉后，加入鼠抗人CD133單克隆抗體和β-actin單克隆抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜10 min，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜10 min，然后化學(xué)發(fā)光、X線曝光、顯影、定影。

1.5 MTS法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期CNE2細(xì)胞(1×105個)，實驗共分4組：(1)陰性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染對照control(40 μmol/L)〕；(2)陽性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染CD133siRNA(40 μmol/L)〕；(3)miR-142-3p組〔瞬時轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)〕；(4)聯(lián)合組〔瞬時共轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕。轉(zhuǎn)染后，接種細(xì)胞于96孔板中，每孔接種3×103個細(xì)胞，每孔體積200 μl，重復(fù)6孔。37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每孔加MTS液20 μl呈色。繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育4 h，終止并去除培養(yǎng)液。每孔再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。選擇490 nm波長，MTS比色，測定各孔吸光度值并記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3次，繪制MTS曲線。

1.6 Transwell侵襲實驗 取對數(shù)生長期CNE2細(xì)胞(1×105個)，實驗共分4組：(1)陰性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染對照control(40 μmol/L)〕；(2)陽性對照組〔瞬時轉(zhuǎn)染CD133siRNA(40 μmol/L)〕；(3)miR-142-3p組〔瞬時轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)〕；(4)聯(lián)合組〔瞬時共轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕。轉(zhuǎn)染后將Transwell放入24孔板中，過夜干燥。在Transwell的上室內(nèi)加入50 μl基質(zhì)膠，加入無酶水200 μl/孔，直至干燥。待細(xì)胞生長至80%，加入DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)。在上室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液，在過濾器上均勻布滿后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～38 h。10%甲醛溶液中固定Transwell 10 min，自來水清洗2次。將Transwell加入結(jié)晶紫5 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察、照相，隨機(jī)選取4個低倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并計算平均值。實驗重復(fù)3次。

1.7 干細(xì)胞成球?qū)嶒?將CNE2細(xì)胞消化后計數(shù)，以1×103個細(xì)胞數(shù)接種至6孔板中，然后用干細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，分別轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物以及對照control，培養(yǎng)96 h后，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察干細(xì)胞成球的大小、數(shù)量(×200)并拍照。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p對CD133mRNA 3′-UTR表達(dá)的影響 單光子熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，無miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Wt型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.924±0.107)，miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Wt型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.535±0.035)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.924，P=0.022)。無miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Mut型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.904±0.121)，miR-142-3p轉(zhuǎn)染的pCD133-Mut型細(xì)胞熒光素酶活性為(0.897±0.115)，兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.526，P=0.277)。

2.2 miR-142-3p對CD133表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，陰性對照組CD133表達(dá)水平為(1.197±0.170)，陽性對照組CD133表達(dá)水平為(0.490±0.053)，miR-142-3p組CD133表達(dá)水平為(0.547±0.032)。3組CD133表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.44，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組CD133表達(dá)水平低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 CD133對鼻咽癌細(xì)胞增殖及侵襲力的影響 陰性對照組CNE2細(xì)胞數(shù)量為(0.812±0.024)，陽性對照組CNE2細(xì)胞數(shù)量為(0.440±0.051)，miR-142-3p組CNE2細(xì)胞數(shù)量為(0.481±0.013)，聯(lián)合組CNE2細(xì)胞數(shù)量為(0.779±0.029)。4組CNE2細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.78，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組CNE2細(xì)胞數(shù)量低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，陰性對照組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量為(40.000±3.000)，陽性對照組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量為(14.333±2.517)，miR-142-3p組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量為(16.000±2.000)，聯(lián)合組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量為(38.667±2.517)，4組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.19，P<0.05)；其中陽性對照組和miR-142-3p組穿過基質(zhì)膠的CNE2細(xì)胞數(shù)量低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

注：A為陰性對照組，B為陽性對照組，C為miR-142-3p組，D為聯(lián)合組

圖1 Transwell法檢測miR-142-3p對CNE2細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

Figure 1 Invasion ability of CNE2 cells in negative control group,positive control group,miR-142-3p group and combined group detected by Transwell migration assay

2.4 miR-142-3p抑制CNE2干細(xì)胞的成球能力 陰性對照組干細(xì)胞成球數(shù)量為(15.667±1.528)，miR-142-3p組干細(xì)胞成球數(shù)量為(8.667±1.527)，兩組干細(xì)胞成球能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.92，P<0.05，見圖2)。

注：A為陰性對照組，B為miR-142-3p組

圖2 兩組抑制CNE2干細(xì)胞的成球能力(×200)

Figure 2 Inhibition status of sphere-forming abilities of CNE2 stem cells in negative control group and miR-142-3p group

3 討論

鼻咽癌是鼻咽黏膜上產(chǎn)生的惡性腫瘤，多發(fā)于中國華南地區(qū)，具有區(qū)域性，其中每10萬人中約有50人發(fā)病，目前鼻咽癌的治療手段雖然比較多，但其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也是治療失敗、患者死亡的主要原因[5]。因此鼻咽癌診斷與治療的關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)新的早期診斷標(biāo)志物以及治療靶點。

研究表明，腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，腫瘤干細(xì)胞是一小類具有自我更新、無限增殖、多向分化能力的細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞為腫瘤的快速生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥提供了堅實的基礎(chǔ)[6]。腫瘤干細(xì)胞可較長時間地處于休眠狀態(tài)，通過多種耐藥分子降低對放療和化療的敏感性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)[7]。CD133是多種實體瘤和血液腫瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，研究表明胃癌、黑色素瘤、肝癌等多種腫瘤中存在CD133表型的腫瘤干細(xì)胞，CD133為廣譜腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[8-10]。因此尋找腫瘤干細(xì)胞的作用靶點，并針對靶點對鼻咽癌進(jìn)行干預(yù)是治療腫瘤、防止耐藥及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵策略。

研究表明，miR-142-3p在多種腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象[2-3]，靶向調(diào)控CD133可抑制肝癌、腸癌細(xì)胞的生長、增殖和侵襲能力[11-12]。推測miR-142-3p在鼻咽癌中也可通過靶向調(diào)控CD133的表達(dá)抑制其腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此，本研究首先通過TargetScan和miRanda軟件預(yù)測miR-142-3p的靶基因為CD133。隨后通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blotting實驗驗證CD133是miR-142-3p直接調(diào)控的靶基因，并且miR-142-3p可抑制CD133的表達(dá)。然后通過轉(zhuǎn)染CD133siRNA陽性對照、miR-142-3p模擬物和陰性對照control，采用MTS和Transwell侵襲實驗檢測，證實干擾CD133的表達(dá)能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。最后證實miR-142-3p能抑制鼻咽癌CNE2干細(xì)胞的成球能力。即miR-142-3p可通過直接靶向抑制CD133從而抑制鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽癌干細(xì)胞增殖和侵襲，miR-142-3p通過調(diào)控靶基因抑制腫瘤，起到抑瘤分子作用。

綜上所述，miR-142-3p和CD133可作為鼻咽癌診斷和預(yù)后判斷的新腫瘤標(biāo)志物及治療靶點。下一步擬繼續(xù)深入研究miR-142-3p在鼻咽癌中的作用，闡明miR-142-3p參與鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為提高鼻咽癌的平均生存期及存活率奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：湯國輝、賀修勝進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計、論文的修訂、對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；湯國輝、謝運杰、刑佼濤進(jìn)行研究的實施與可行性分析；湯國輝、刑佼濤進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；謝運杰、刑佼濤進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)處理；湯國輝、張志偉、黃衛(wèi)國進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；湯國輝、張志偉撰寫論文；湯國輝、張志偉、賀修勝負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

miR-142-3p Suppresses the Proliferation of Nasopharyngeal Carcinoma Cells and Stem Cells by Targeting CD133

TANGGuo-hui1,ZHANGZhi-wei2,HUANGWei-guo2,XIEYun-jie2,XINGJiao-tao1,HEXiu-sheng2*

1.DepartmentofAnusandBowels,AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421002,China2.CancerResearchInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China*Correspondingauthor:HEXiu-sheng,Professor;E-mail：hexiusheng@hotmail.com

Objective To investigate whether miR-142-3p can suppress the proliferation and invasion abilities of nasopharyngeal carcinoma cells by targeting CD133,in order to reveal the molecular mechanism that miR-142-3p functions as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma.Methods This study was conducted between July 2015 and September 2016.CD133mRNA 3′-UTR-luciferase vector was constructed and dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-142-3p on luciferase activity of CD133mRNA 3′-UTR.Nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells were transfected with negative contrast control agent 40 μmol/L,CD133siRNA 40 μmol/L,and miR-142-3p mimics 40 μmol/L,respectively.Western blotting was performed to detect the expressions of CD133protein.CNE2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups,negative control group(transient transfection of negative contrast control agent 40 μmol/L),positive control group(transient transfection of CD133siRNA 40 μmol/L),miR-142-3p group(transient transfection of miR-142-3p mimics 40 μmol/L),and combined group〔transient transfection of miR-142-3p mimics 40 μmol/L and pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕.MTS assay and Transwell migration assay were used to detect the proliferation and invasion abilities of CNE2 cells,respectively.Tumorsphere formation assay was employed to detect the sphere-forming ability of CNE2 stem cells.Results Results of luciferase assay with single-photon detector showed that,the luciferase activity of pCD133-Wt cells with transfection of miR-142-3p was much lower than that of those without〔(0.535±0.035) vs.(0.924±0.107),t=7.924，P=0.022〕.Western blotting identified that,the expression of CD133differed significantly between negative control group,positive control group,and miR-142-3p group(F=12.44，P<0.05),concretely,the negative control group had higher expression of CD133than both positive control group,and miR-142-3p group(allP<0.05);obvious differences in the number of CNE2 cells were found among the 4 groups(F=16.78，P<0.05),specifically,negative control group had more CNE2 cells than positive control group,and miR-142-3p group(allP<0.05).Transwell migration assay revealed that,the number of CNE2 cells passing through the matrigel differed significantly among the 4 groups(F=13.19,P<0.05);negative control group had more CNE2 cells passing through the matrigel than positive control group and miR-142-3p group(allP<0.05).Tumorsphere formation assay demonstrated the number of sphere-forming CNE2 stem cells were more in negative control group than those in miR-142-3p group(t=14.92，P<0.05).Conclusion miR-142-3p suppresses cell proliferation and invasion,and sphere-formation of stem cells by targeting CD133in nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal neoplasms;Neoplastic stem cells;Cell proliferation;Cell invasion

國家自然科學(xué)基金資助項目(81172210)；湖南省衛(wèi)計委課題(B2013-048)

R 739.63

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.17.009

2016-12-20；

2017-04-15)

1.421002湖南省衡陽市，南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院肛腸科

2.421001湖南省衡陽市，南華大學(xué)腫瘤研究所

*通信作者：賀修勝，教授；E-mail：hexiusheng@hotmail.com