優(yōu)化石菖蒲組份配伍對(duì)谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

鐘言 曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕 陳云波 魏剛 程淑意 周瑩

優(yōu)化石菖蒲組份配伍對(duì)谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

鐘言 曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕 陳云波 魏剛 程淑意 周瑩

目的 探討優(yōu)化石菖蒲組份配伍對(duì)谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法 對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),使用的模型是谷氨酸促使PC12細(xì)胞出現(xiàn)損傷,將其分成β-細(xì)辛醚、丁香酚不同濃度配伍組及β-細(xì)辛醚單體組、丁香酚單體組、谷氨酸損傷模型組、正常對(duì)照組進(jìn)行篩選試驗(yàn),對(duì)損傷PC12細(xì)胞活力(OD值)變化情況進(jìn)行測(cè)算,使谷氨酸促使PC12細(xì)胞出現(xiàn)損傷保護(hù)作用的丁香酚配伍與β-細(xì)辛醚的最佳配比進(jìn)行有效的篩選。結(jié)果 取最低濃度考慮β-細(xì)辛醚單體和丁香酚單體的起效濃度分別為49 μmol/L和14 μmol/L。本次結(jié)果顯示細(xì)胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶2 μmol/L組>49 μmol/L∶0.5 μmol/L組>49 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>1.9 μmol/L∶14 μmol/L組>49 μmol/L∶2 μmol/L組>正常對(duì)照組>β-細(xì)辛醚單體組>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L組>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>丁香酚單體組>谷氨酸損傷模型組,OD值分別為(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚單體組,其余各組OD值與谷氨酸損傷模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 β-細(xì)辛醚與丁香酚配伍對(duì)谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的較佳的濃度配比可能在9 μmol/L∶0.5 μmol/L～9 μmol/L∶2 μmol/L之間。

β-細(xì)辛醚；丁香酚；谷氨酸；PC12細(xì)胞；優(yōu)化

β-細(xì)辛醚和丁香酚是從中藥石菖蒲中提取的兩種主要有效成份,阿爾茨海默病(AD)是與谷氨酸密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,且呈緩慢進(jìn)行性發(fā)展［1-3］,神經(jīng)細(xì)胞突觸中的谷氨酸可急劇增多,一般出現(xiàn)在缺氧、缺血、創(chuàng)傷和昏厥,嚴(yán)重可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡,有研究表明,石菖蒲中的β-細(xì)辛醚和丁香酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的退變可起到保護(hù)的作用。為了研究通過(guò)中藥組份配伍而達(dá)到減毒、增效的目的,本研究通過(guò)優(yōu)化β-細(xì)辛醚和丁香酚的濃度配比,從而篩選出對(duì)谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的較佳的濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試劑及其配制、細(xì)胞株、儀器 上海同仁試劑公司提供的CCK8試劑盒；HyClone公司提供的馬血清,GIBCO公司提供的特級(jí)胎牛血清,GIBCO公司提供的高糖DMEM培養(yǎng)基,GIBCO公司提供的胰蛋白酶,其濃度為0.25%,GIBCO公司提供的DPBS緩沖液,廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心提供的β-細(xì)辛醚、丁香酚單體(各1 mmol/L,保存于4℃的冰箱中),北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心提供的L-谷氨酸、低分化PC12細(xì)胞。TECAN DNA Expert提供的酶標(biāo)儀,德國(guó)Binder CB150提供的CO2培養(yǎng)箱。采用高糖DMEM培養(yǎng)基分別配制2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的L-谷氨酸,并保存于4℃的冰箱中備用。PC12細(xì)胞的傳代培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行,而其需生長(zhǎng)在83%高糖DMEM培養(yǎng)基、8%特級(jí)胎牛血清和8%馬血清中,體積分?jǐn)?shù)為5,培養(yǎng)溫度控制在37℃。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液,直到細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng),稀釋細(xì)胞至1×105/ml并加入到96孔板中,每孔為100 μl。

1.2 研究方法

1.2.1 對(duì)PC12細(xì)胞谷氨酸損傷模型進(jìn)行創(chuàng)建 PC12細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)貼壁時(shí),且交叉成網(wǎng)時(shí),采用DPBS進(jìn)行蕩洗,然后棄培養(yǎng)基,隨機(jī)分成五組,每組10孔,谷氨酸組加入含有不同濃度谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基,正常對(duì)照組則向每孔加入高糖DMEM培養(yǎng)基100 μl,在培養(yǎng)16、24、32、48 h時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,然后再加入CCK8稀釋液,每孔為20 μl。于90 min后測(cè)定其450 nm處的OD值,其中較好的造模濃度和時(shí)間分別為10 mmol/L和16 h。

1.2.2 篩選單體、配伍濃度 江湧等［4］研究結(jié)果顯示,β-細(xì)辛醚單體的起效濃度為50 μmol/L,而丁香酚單體的起效濃度為15 μmol/L。參照上述研究的單體起效濃度,設(shè)置β-細(xì)辛醚單體4個(gè)組,其濃度分別為200、100、50、25 μmol/L；設(shè)置丁香酚單體4個(gè)組,其濃度分別為60、30、15、7.5 μmol/L。兩單體的起效濃度以5倍的比例進(jìn)行減小,配伍組按照兩兩配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)β-細(xì)辛醚進(jìn)行單獨(dú)設(shè)置：丁香酚包括9個(gè)配伍組,即1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L、1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L、1.9 μmol/L∶14 μmol/L、9 μmol/L∶0.5 μmol/L、9 μmol/L∶2 μmol/L、9 μmol/L∶14 μmol/L、49 μmol/L∶0.5 μmol/L、49 μmol/L∶2 μmol/L和49 μmol/L∶14 μmol/L。每組都進(jìn)行預(yù)給藥,將時(shí)間記錄好,4 h后將谷氨酸加入其中,谷氨酸濃度為9 mmol/L,接著再培養(yǎng)16 h,最后采用CCK8法檢測(cè)OD值。對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化情況進(jìn)行認(rèn)真觀察,篩選誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的谷氨酸最佳濃度配伍比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,CCK8法測(cè)OD值均采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

取最低濃度考慮β-細(xì)辛醚單體和丁香酚單體的起效濃度分別為49 μmol/L和14 μmol/L。本次結(jié)果顯示細(xì)胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶2 μmol/L組>49 μmol/L∶0.5 μmol/L組>49 μmol/L∶14 μmol/L組>9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>1.9 μmol/L∶14 μmol/L組>49 μmol/L∶2 μmol/L組>正常對(duì)照組>β-細(xì)辛醚單體組>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L組>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L組>丁香酚單體組>谷氨酸損傷模型組,OD值分別為(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚單體組,其余各組OD值與谷氨酸損傷模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度配伍比例及β-細(xì)辛醚單體、丁香酚單體對(duì)PC12細(xì)胞OD值的影響(±s)

表1 不同濃度配伍比例及β-細(xì)辛醚單體、丁香酚單體對(duì)PC12細(xì)胞OD值的影響(±s)

注：與谷氨酸損傷模型組比較,aP<0.05

組別 比例數(shù) OD值1.9 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.71±0.03a1.9 μmol/L:2.9 μmol/L組 7 1.72±0.04a1.9 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.78±0.03a9 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.79±0.02a9 μmol/L:2 μmol/L組 7 1.80±0.05a9 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.88±0.04a49 μmol/L:0.5 μmol/L組 7 1.80±0.03a49 μmol/L:2 μmol/L組 7 1.76±0.05a49 μmol/L:14 μmol/L組 7 1.79±0.07aβ-細(xì)辛醚單體組 9 1.72±0.06a丁香酚單體組 9 1.68±0.08谷氨酸損傷模型組 9 1.65±0.05正常對(duì)照組 9 1.72±0.07a

3 小結(jié)

具有神經(jīng)元特性的PC12細(xì)胞為國(guó)際公認(rèn)的可模擬神經(jīng)細(xì)胞功能的細(xì)胞,主要來(lái)源大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤,而過(guò)量的谷氨酸會(huì)對(duì)其造成損傷［5-8］。已有研究者［9］建立Aβ1-40誘導(dǎo)PC12細(xì)胞死亡這一模型,并證實(shí)了起到保護(hù)作用的為丁香酚和β-細(xì)辛醚這兩種成分,其皆取自中藥石菖蒲,鈣拮抗作用及穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位可能為其作用機(jī)制。本研究結(jié)果表明β-細(xì)辛醚與丁香酚的配比濃度為9 μmol/L∶2 μmol/L的配伍組合,能在1/5的單體劑量下發(fā)揮保護(hù)作用,作用顯著。多成份的綜合作用體現(xiàn)中藥的療效,與單體進(jìn)行配伍組合以及篩選會(huì)發(fā)揮較好的減毒作用。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.06.098

2017-01-19］

國(guó)家科技重大專項(xiàng)(重大新藥創(chuàng)制)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2009ZX09103-429),2010年廣州中醫(yī)藥大學(xué)本科生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

510405 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(鐘言曾志杰 龔玉瀅 陳曉燕)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所DME中心(陳云波 程淑意 周瑩)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)研究中心(魏剛)

陳云波