沙棘籽油中維生素E含量的CGC法測(cè)定

沈 琪，王 梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

沙棘籽油中維生素E含量的CGC法測(cè)定

沈 琪，王 梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

目的：研究沙棘籽油中脂肪酸成分，定量分析并建立毛細(xì)管氣相色譜法（CGC）測(cè)定沙棘籽油中維生素E（Vit E）含量的方法。方法：采用溶劑回流提取法提取沙棘油中揮發(fā)油成分，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。采用島津GC-2010 plus氣相色譜儀，以正三十二烷為內(nèi)標(biāo)物對(duì)Vit E進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果：從沙棘籽油中分離鑒定出28個(gè)化合物；采用Rtx-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫為程序升溫：150 ℃保持13 min，以10 ℃·min-1的升溫速率升至300 ℃，保持8 min；FID檢測(cè)器溫度為300 ℃；進(jìn)樣口溫度為310 ℃；無(wú)分流進(jìn)樣。在此條件下，Vit E和內(nèi)標(biāo)物分離良好，在0.02 ～ 0.43 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r = 0.999 6。結(jié)論：建立以CGC測(cè)定沙棘籽油中維生素E含量的方法，靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為沙棘籽油中Vit E的含量測(cè)定方法。

沙棘油；維生素E；毛細(xì)管氣相色譜法

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬植物，是蒙藥、藏藥習(xí)用藥材。從沙棘中提取分離得到的沙棘油，富含大量營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，近年來(lái)逐漸引起醫(yī)藥界的重視，并在其資源、藥理、制劑、臨床等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證實(shí)沙棘油是一個(gè)藥理活性強(qiáng)、高效、安全的藥物[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，沙棘油具有防治胃潰瘍、保護(hù)化學(xué)性肝損傷[3]、促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)等作用[4]。維生素E（Vitamin E，Vit E）是沙棘油中天然抗氧化劑，含量越高，油越穩(wěn)定，作為沙棘油中的重要有效成分，具有多種功效[5]。本文以Vit E為沙棘油質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，通過(guò)加熱回流法提取沙棘籽油，用GC-MS對(duì)其進(jìn)行成分分析，并建立以CGC測(cè)定沙棘油中Vit E含量的方法[6]，旨為沙棘油的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 儀器與試藥

Perkin-Elemer Autosystem XL-Turbemass型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國(guó)PE公司）；GC-2010 plus型氣相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S型萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler公司）。

沙棘籽油（實(shí)驗(yàn)室自制，沙棘藥材購(gòu)自阿勒泰地區(qū)，純度99.9%）；Vit E對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度98%，批號(hào)：G3D7-DS8F）；正三十二烷（美國(guó)Sigma公司，純度97%）；正己烷、甲醇（色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氫氧化鉀（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 沙棘籽油提取

通過(guò)溶劑回流提取法，將沙棘籽中的沙棘籽油溶于石油醚，回收石油醚后得到沙棘籽油[7]。得油率為8.9%。

2.2 沙棘籽油中脂肪酸成分分析及結(jié)果

色譜條件：采用PE-5MS柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫為程序升溫：50 ℃保持3 min，以3 ℃·min-1的升溫速率升至200 ℃，5 ℃·min-1升至280 ℃，保持30 min；進(jìn)樣口溫度為300 ℃；分流比為50 : 1；載氣為He（99.99%）；進(jìn)樣量為0.8 μL。通過(guò)GC-MS全分析共鑒定出沙棘籽油中28種化合物。

2.3 沙棘籽油中Vit E含量測(cè)定[8]

2.3.1 色譜條件 采用Rtx-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫為程序升溫：150 ℃保持13 min，以10℃·min-1的升溫速率升至300 ℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度為310 ℃；FID檢測(cè)器溫度為300 ℃；載氣為N2，流速1 mL·min-1；無(wú)分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.3.2 溶液的制備 內(nèi)標(biāo)物溶液：精密稱取正三十二烷適量，加正己烷溶解并稀釋成1 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱取Vit E對(duì)照品適量，加正己烷溶解并稀釋成含1 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液[9-10]：稱取沙棘籽油0.5 g，置25 mL棕色量瓶中，精密加入乙醚-正己烷（2 : 1）2.5 mL，甲醇2.5 mL，靜置2 h，再精密加入2 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，于60 ℃水浴中搖勻，靜置5 min，加蒸餾水至刻度。吸取上層溶液置10 mL試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液3 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 將上述3種溶液各1.0 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣分析，色譜圖結(jié)果顯示，Vit E與正三十二烷色譜峰的分離度大于2.6，Vit E理論塔板數(shù)大于5000，色譜峰形對(duì)稱，見(jiàn)圖1。

2.3.4 線性關(guān)系 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.10、0.50、0.70、0.90、1.10、1.30 mL置25 mL棕色量瓶中，前處理后吸取上層脂肪酸甲酯，置10 mL試管中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液3 mL，搖勻。分別自動(dòng)進(jìn)樣1 μL，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積比值（Y，對(duì)照品/正三十二烷）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y = 0.705 7 X＋0.002，r = 0.999 6。結(jié)果表明：Vit E在0.02 ～ 0.43 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 GC圖譜A – 對(duì)照品，B – 供試品；1 – 正己烷，2 – Vit E，3 – 正三十二烷Fig 1 GC chromatogramsA – reference substance, B – sample; 1 – n-hexane, 2 – Vit E, 3 –n-dotriacontane

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（0.43 mg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算Vit E與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD為0.47%（n = 5），結(jié)果表明儀器的精密度良好。2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取沙棘籽油0.05 g，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算Vit E與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD為0.48%（n = 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取沙棘籽油0.05 g，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備，分別于配制后0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算Vit E與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD為1.40%，結(jié)果表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知準(zhǔn)確Vit E（0.047 mg·mL-1）含量的沙棘籽油共9份，每份0.05 g，置25 mL量瓶中，分別精密加入Vit E對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）0.5 mL、0.7 mL、1.1 mL，每個(gè)濃度制備3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示Vit E的平均回收率為96.83%，RSD為0.54%，詳見(jiàn)表1。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取自提沙棘籽油3批，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，詳見(jiàn)表2。

3 討論

GC-MS測(cè)得沙棘籽油中脂肪酸的總離子流圖，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索核對(duì)，共鑒定出28種化合物，將峰面積進(jìn)行歸一化法處理后，沙棘籽油中亞油酸（44.5%）和油酸（37.52%）的相對(duì)含量高于沙棘油標(biāo)準(zhǔn)（SL 493-2010沙棘籽油）中脂肪酸組成指標(biāo)。亞麻酸成分略低，這可能是干燥恒重時(shí)亞麻酸因氧化損失。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Result of sample recovery rate test. n = 9

表2 沙棘籽油中Vit E的含量. n = 3Tab 2 Determination of contents of Vit E in Hippophae rhamnoides oil. n = 3

《中國(guó)藥典》中采用CGC內(nèi)標(biāo)法測(cè)Vit E的含量，選擇的毛細(xì)管柱為100%二甲基聚硅氧烷固定液填充[11]。參考文獻(xiàn)[12]使用Rtx-5型毛細(xì)管色譜柱，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定檢測(cè)器溫度為300 ℃，進(jìn)樣口溫度為310 ℃，柱溫使用程序升溫：150 ℃保持13 min，以10 ℃·min-1的升溫速率升至300 ℃，保持8 min，沙棘油中指標(biāo)性成分能與內(nèi)標(biāo)物達(dá)到很好的分離并均能被檢測(cè)出。因沙棘油中化學(xué)成分復(fù)雜，參照文獻(xiàn)[9-10]將加入甲醇和氫氧化鉀甲醇溶液后的靜置時(shí)間分別定為2 h和5 min，Vit E與內(nèi)標(biāo)物的分離效果更好?？疾榻Y(jié)果：供試品溶液中沙棘籽油濃度為0.018 g·mL-1，測(cè)得供試品溶液中Vit E濃度為0.054 mg·mL-1，即1 g油中含3 mg Vit E。

[1] 車錫平，關(guān)曉紅，郭峰，等．沙棘籽油的毒性實(shí)驗(yàn)研究[J]．沙棘，2007，20（4）：31-33.

[2] 臧茜茜，鄧乾春，從仁懷，等．沙棘油功效成分及藥理功能研究進(jìn)展[J]．中國(guó)油脂，2015，40（5）：76-81.

[3] Sodergren E, Cederberg J, Vessby B, et al. Vitamin E reduces lipid peroxidation in experimental hepatotoxicity in rats[J]. Eur J Nutr, 2001, 40(1): 10-16.

[4] 范惠玲，白生文，張芬琴，等．河西走廊5種沙棘果主要活性成分及對(duì)ROS清除作用比較分析[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2016，28（1）：107-111，163.

[5] 譚曉琳，彭東紅．維生素E與兒童哮喘關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．國(guó)際兒科學(xué)雜志，2016，43（9）：681-684.

[6] 蔡樂(lè)，姚蘭，白林．維A酸軟膏中維A酸的含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)的檢查[J]．中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2015，12（3）：144-146.

[7] 張逸，黃鳳洪，馬方勵(lì)，等．沙棘油提取工藝研究進(jìn)展[J]．中國(guó)油脂，2016，41（3）：16-20.

[8] 張鳳枰，索有瑞，王洪倫，等．毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘油中的脂肪酸[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23（1）：198-202.

[9] 李娟，周震．超臨界二氧化碳萃取沙棘籽油的化學(xué)成分分析[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，1996，31（1）：19-20.

[10] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S]．二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：1242-1243.

[11] 李奇．大豆油脫臭餾出物中生育酚、甾醇和脂肪酸的提取工藝研究[D]．天津：天津大學(xué)，2008：11-16.

[12] 毛多斌，賈春曉，孫曉麗，等．幾種功能性植物油中角鯊烯和維生素E分析[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22（2）：79-82.

Determination of vitamin E content in the oil from seed of Hippophae rhamnoides by CGC

SHEN Qi, WANG Mei
(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective: To analyze the fatty acids composition in the oil from seed of Hippophae rhamnoides, and establish a capillary gas chromatography (CGC) method to determine the content of vitamin E in the seed oil of Hippophae rhamnoides. Methods: Oil was extracted from Hippophae rhamnoides seed by heated reflux solvent. GC-MS was adopted to determine its chemical constituents. The quantif i cation of the vitamin E (Vit E) content was conducted by GC-2010 plus. Dotriacontane was acted as the internal standard. Results: Totally 28 chemical constituents were extracted. The GC system consisted of a Rtx-5 capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm). Column temperature was temperature programming including 150 ℃ for 13 min, rose to 300 ℃by the rate of 10 ℃·min-1and maintained 300 ℃ for 8 min. The temperature of FID detector and the injection was 300 ℃ and 310 ℃respectively. The splitless injection was adopted, Vitamin E was separated satisfactorily from dotriacontane. The calibration curve for Vitamin E was linear in the range of 0.02 – 0.43 mg·mL-1(r = 0.999 6). Conclusion: The capillary GC method was sensitive and reliable. It could be used to determine the content of vitamin E in the Seed oil of Hippophae rhamnoides.

Hippophae rhamnoides oil; Vitamin E; Capillary gas chromatography (CGC)

R917

A

1672 – 8157(2017)03 – 0154 – 03

2017-02-12

2017-04-11）

新疆維吾爾自治區(qū)優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（qn2015yx018）；沙棘油納米乳的制備研究（CXCY096）

王梅，女，副教授，研究方向：藥物新劑型和藥物傳輸系統(tǒng)。E-mail：wm630@163.com

沈琪，女，碩士研究生，研究方向：藥物新劑型。E-mail：2529110682@qq.com