二代測序與分子克隆測序技術(shù)在HBV X基因準(zhǔn)種變異研究中的應(yīng)用及差異分析

任靜靜鄧偉，2方向肖潺潺吳杭航

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部；2廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所

二代測序與分子克隆測序技術(shù)在HBV X基因準(zhǔn)種變異研究中的應(yīng)用及差異分析

任靜靜1鄧偉1，2方向1肖潺潺1吳杭航1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部；2廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所

目的比較二代測序（next generation sequencing，NGS）和克隆測序（clone-based sequencing，CBS）兩種方法檢測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）X基因準(zhǔn)種變異位點的差異。方法 在廣西肝癌高危人群隊列中選擇發(fā)展成肝癌的病例（A）和無癌的對照（B）各1例為研究對象。自研究對象進(jìn)入隊列起，每半年采集其外周血液5mL分離血清備用，直至病例A肝癌發(fā)病，共收集研究對象血清12份。提取血清HBV DNA并采用巢式PCR法擴(kuò)增HBV X基因區(qū)。PCR產(chǎn)物同時采用NGS和CBS兩種方法檢測HBV X基因區(qū)核苷酸序列，對兩種方法獲得的突變位點進(jìn)行比較分析。結(jié)果NGS共檢測到HBV X基因區(qū)準(zhǔn)種40個變異位點和1段插入突變（nt1649），CBS共檢測到41個變異位點和1段插入突變（nt1672～1673）。兩種方法同時檢測到的變異位點有29個，NGS檢測到而CBS未檢測到的變異位點有11個，NGS未檢測到而CBS檢測到的變異位點有12個。NGS和CBS兩種方法均發(fā)現(xiàn)在肝病的進(jìn)展中突變位點發(fā)生波動。結(jié)論 在研究HBV堿基變異方面，CBS和NGS發(fā)現(xiàn)變異位點的能力相當(dāng)，CBS發(fā)現(xiàn)長片段插入和缺失的能力優(yōu)于NGS，在實際應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)研究目的選擇相應(yīng)的檢測方法。

乙型肝炎病毒；準(zhǔn)種；二代測序；克隆測序；肝細(xì)胞癌

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是導(dǎo)致一系列HBV相關(guān)肝臟疾病包括慢性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要原因。據(jù)估計，全球范圍內(nèi)大約有2.4億HBV慢性感染者，中低收入國家占多數(shù)，其中每年死于CHB引起的HCC和肝硬化有65萬［1］。根據(jù)GLOBOCAN 2012估計，2012年中國新發(fā)肝癌病例和死亡病例占世界范圍內(nèi)的50%［2］，因此HBV感染的防治仍是我國一項重要的課題。眾所周知，HBV是一種嗜肝性DNA病毒，具有極高的復(fù)制率，由于其復(fù)制過程逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對功能，導(dǎo)致較高的錯配率而發(fā)生病毒突變，最終出現(xiàn)DNA序列差異，這種遺傳學(xué)上高度相關(guān)但序列不完全相同的變異體組成的群體，稱為準(zhǔn)種。HBV感染是一個動態(tài)變化過程，變異體在此過程中不斷進(jìn)化和選擇，進(jìn)而適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化。本研究采用二代測序（next generation sequencing，NGS）和克隆測序（clone-based sequencing，CBS）檢測HBV X基因區(qū)準(zhǔn)種變異位點，探討兩種測序方法分析HBV病毒準(zhǔn)種變異的優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 一般資料

在廣西肝癌高危人群隊列（進(jìn)入隊列時年齡為30～65歲、血清HBsAg陽性、無肝硬化病史、隨訪期間無抗病毒治療史）中，選擇最終發(fā)展成肝癌的病例（A）和無癌的對照（B）各1例為本研究對象。肝癌的確診依據(jù)組織病理學(xué)診斷，腹部超聲、血管造影、CT和MRI檢查中至少兩個影像學(xué)檢查為陽性指征，或一個影像學(xué)檢查陽性指征且血清AFP濃度大于400μg/L或AFP濃度增加大于50μg/L。慢性乙型肝炎的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)（2010年版）［3］。排除人類免疫缺陷病毒、其他肝炎病毒合并感染和其他原因?qū)е碌母闻K疾病，如自身免疫性肝病、酒精性肝炎、藥物引起的肝炎。自研究對象進(jìn)入隊列起，每半年采集外周血液5mL，3 000 r/min離心，分離血清置-80℃冰箱備用。直至病例A肝癌發(fā)病，共收集到2例研究對象血清12份，其中研究對象A血清7份（編號A1～7），對照B血清5份（編號B1～5）。本研究經(jīng)廣西腫瘤防治研究所倫理委員會審核批準(zhǔn)，研究對象知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 血清HBV DNA的提取 采用QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑盒（QIAGEN公司）提取血清HBV DNA，實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.2.2 HBV X基因區(qū)巢式PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增HBV X基因區(qū)，第一輪引物：HBV X-F2：5′-CAAGTGTTTGCTGACGCAACC-3′；HBV X-R2：5′-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3′，PCR反應(yīng)混合物組成：10×PCR Buffer 10μL，dNTPs mix 2μL，HBV X-F2 5μL，HBV X-R2 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板10μL，RNase freewater 67.5μL。PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5 min；94°C 1min，44.5°C 1min，72°C 1min，共40個循環(huán)；72°C延伸10min。第二輪引物：HBVX-Fla：5′-TCCTTCCCATGGCTGCTCGGGTGTGCTG-3′；HBV X-Rla：5′-CATGAGATGATTAGGCAGAGGTGAAAAAG-3′，PCR反應(yīng)混合物組成：10×PCR Buffer 10μL，dNTPsmix 2μL，HBV X-Fla 5μL，HBV X-Rla 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板4μL，RNase freewater 73.5μL。PCR循環(huán)條件：95°C預(yù)變性 5 min；94°C 1 min，53°C 1 min，72°C 1 min，共35個循環(huán)；72°C延伸10min。終產(chǎn)物目的片段長度465 bp（nt1365～1847），用瓊脂糖DNA回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化，經(jīng) Nanodrop 2000分光光度計測定DNA濃度后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二代測序 純化后的HBV X基因區(qū)PCR產(chǎn)物送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司采用Illumina Miseq PE250測序平臺進(jìn)行二代測序。

1.2.4 TA克隆和Sanger測序 HBV X基因區(qū)PCR純化回收產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，使用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）并轉(zhuǎn)到DH5a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)（北京天根生化科技有限公司），涂布到含氨芐青霉素的LB平板上，當(dāng)攜帶HBV X基因目的片段的T載體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞后，在LB培養(yǎng)平板上呈白色斑點，為陽性克??；攜帶空載的感受態(tài)細(xì)胞呈藍(lán)色斑點，為陰性克隆。挑選白色菌落搖菌，進(jìn)行陽性重組克隆鑒定，每個樣本挑選2～3個，共挑選30個陽性克隆，菌液送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行Sanger測序（Applied Biosystems 3730XL），測序引物為通用引物M13-F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′；M13-R 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。

1.3 測序數(shù)據(jù)的處理

對NGS獲得的序列，將＞10%無效堿基和＞50%的質(zhì)量評分低于5的堿基序列棄除，采用BWA+GATK流程對HBV X基因區(qū)進(jìn)行變異分析。對CBS獲得的序列，用NCBI在線核酸比對工具（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）與參考序列（NCBI登錄號：NC-003977.1）進(jìn)行比對，收集比對結(jié)果能夠覆蓋目標(biāo)區(qū)域（HBV X基因區(qū)核苷酸nt1374～1838）的序列，用Chromas軟件讀取測序峰圖評估DNA測序質(zhì)量，最后采用mutation surveyor V4.0.8軟件進(jìn)行突變位點分析。

2 結(jié)果

2.1 HBV X基因區(qū)巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果

12份血清樣本的PCR產(chǎn)物中，有10份通過凝膠電泳在465 bp處可見清亮條帶，且與目的片段長度相符；其余2份（A1、B5）因產(chǎn)物濃度較低而未見相應(yīng)的電泳條帶（圖1）。

圖1 HBV X基因區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 NGS基本情況

12份樣本的HBV X基因區(qū)經(jīng)NGS共產(chǎn)生14 494 614條合格序列，平均每份樣本1 207 885條，平均測序深度為800×。

2.3 TA克隆及Sanger測序基本情況

HBV X基因區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆形成的藍(lán)白斑如圖2所示。12個PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的陽性克隆總數(shù)約100個。挑取的30個陽性克隆測序成功并與HBV X基因區(qū)進(jìn)行blast比對相符的共28個。

圖2 HBV X基因TA克隆結(jié)果圖

2.4 NGS和CBS兩種方法獲得的HBV X基因區(qū)準(zhǔn)種變異位點比較

NGS和CBS兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)的HBV X基因區(qū)準(zhǔn)種的全部堿基變異位點見表1。其中NGS檢測到40個變異位點，CBS檢測到41個變異位點。兩種方法同時檢測到的變異位點有29個，NGS檢測到而CBS未檢測到的變異位點有11個，NGS未檢測到而CBS檢測到的變異位點有12個。對不同研究對象，NGS法在肝癌病例血清樣本中檢測到的突變位點為31個，多于對照的21個；CBS法在病例和對照血清樣本中發(fā)現(xiàn)的變異點數(shù)量相同，均為34個。

表1 NGS和CBS檢測HBV X基因區(qū)準(zhǔn)種變異位點比較

（續(xù)表）

2.5 肝癌發(fā)展過程中HBV變異位點的變化

采用NGS方法在肝癌病例A的疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)有21個變異位點隨病情進(jìn)展而發(fā)生變化，在對照病例B的疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)有17個位點隨病情進(jìn)展發(fā)生波動；采用CBS方法在肝癌病例A的疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)有3個位點隨病情進(jìn)展而發(fā)生波動，在對照病例B的疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)全部位點不隨病情的展變化。

2.6 NGS和CBS兩種方法發(fā)現(xiàn)的插入突變比較

CBS法在肝癌病例A的A1～7樣本均檢測到nt1672～1673位置有一段插入。該段插入有24個堿基，核苷酸序列為TTTACATAAGAGGACTCTTGGACT，經(jīng)blast比對后發(fā)現(xiàn)其與HBV X基因（參考序列NC-003977.1）序列同源，一致性達(dá)96%。NGS也發(fā)現(xiàn)插入突變，在A1的nt1649，插入序列為CTTGGACTT，共9個堿基。

3 討論

HBV基因組易發(fā)生變異，并在長期進(jìn)化過程中不斷累積，形成不同的HBV基因型、基因亞型和準(zhǔn)種，與HBV感染的發(fā)生、發(fā)展和治療等密切相關(guān)［4-5］。目前由于NGS讀長的限制，大部分對HBV基因準(zhǔn)種變異的研究，主要集中于HBV基因組的某一特定區(qū)域［6］。由于X基因區(qū)變異頻率較高，且與肝癌發(fā)病關(guān)系密切［7-8］，故本文選擇X區(qū)作為目標(biāo)區(qū)域?qū)BV準(zhǔn)種的變異及其相關(guān)檢測技術(shù)進(jìn)行研究。

傳統(tǒng)的準(zhǔn)種檢測方法采用克隆測序法，由于新一代測序技術(shù)采用“邊合成邊測序”方案，因而也逐漸被用于準(zhǔn)種的研究。從實驗步驟上看，NGS對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后即可上機(jī)進(jìn)行準(zhǔn)種突變位點檢測，一次運行可產(chǎn)生成百上千的序列讀?。欢鳦BS需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆后再進(jìn)行Sanger測序。因此NGS測序結(jié)果包含大量序列信息，而CBS獲得的序列信息因受克隆數(shù)量限制而較少。使用NGS的目的主要是它是目前研究準(zhǔn)種的優(yōu)選方法，本研究采用NGS方法與傳統(tǒng)的準(zhǔn)種研究方法CBS對比研究準(zhǔn)種變異位點的差異。NGS優(yōu)勢主要是可以產(chǎn)生成百上千的序列信息供分析，避免克隆測序結(jié)果由于挑選克隆數(shù)目的限制，導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)偏倚［9］，因此NGS可以更全面地概括HBV準(zhǔn)種變異的特征。

從堿基變異位點的數(shù)量上看，本研究結(jié)果表明NGS和CBS兩種方法檢測到的變異位點總數(shù)相當(dāng)，說明NGS的Illumina Miseq PE250測序平臺與傳統(tǒng)的準(zhǔn)種研究方法CBS相比，發(fā)現(xiàn)突變位點數(shù)量的能力相當(dāng)。而Ramírez等［10］分別采用NGS技術(shù)454平臺的FLX+、FLX、Junior 3種測序儀和CBS對CHB患者的Pre-C/C區(qū)變異進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CBS檢測到的50種變異位點中，F(xiàn)LX+、FLX、Junior 3種NGS平臺只能檢測到其中的20個、20個、18個，且其中8種插入或缺失變異均未檢測到。究其原因，可能是NGS測序數(shù)據(jù)處理過程中采取了嚴(yán)格的數(shù)據(jù)過濾標(biāo)準(zhǔn)，一些被認(rèn)為是低質(zhì)量的序列被丟棄，這些序列里可能含有一些真正的變異。因此在原始數(shù)據(jù)處理過程中，要設(shè)置合理的過濾和篩選參數(shù)，以免對后續(xù)分析造成影響［11］。CBS測序結(jié)果采用Mutation Surveyor軟件進(jìn)行突變點判斷，它可直接識別復(fù)雜的測序峰圖，清楚顯示突變位點和突變的各項參數(shù)，具有極高的敏感度和準(zhǔn)確性，因此結(jié)果較可靠。

從NGS與CBS發(fā)現(xiàn)的HBV X基因準(zhǔn)種突變位點的差異來看，兩種方法檢測到不一致突變位點如下：僅NGS檢測到的突變有A1427A/T、G1467G/A、C1480A或C/A、T1568C、A1574A/C、C1629C/T、A1630A/G或G、 C1653C/T、G1721G/A或A、C1773C/T、A1775A/G；僅CBS檢測到的突變有G1461C、T1464C、T1488C、C1491G、T1494C、T1497C、T1500C、G1503A、C1504T、C1505T、T1508A、T1544A。其中C1653T、C1773T［12-13］目前已被報道與HCC有關(guān)，但本研究發(fā)現(xiàn)C1653C/T和C1773C/T雜合突變，與文獻(xiàn)報道有差異。其余位點尚未見文獻(xiàn)報道和HCC有關(guān)。檢出不同變異位點的原因可能與PCR擴(kuò)增目的片段之后，分別采用兩種不同方法測序而產(chǎn)生了新的不同變異有關(guān)。例如，由于NGS采用“邊合成邊測序”方案，在擴(kuò)增過程中可能會引入變異的重組序列而影響最終的測序結(jié)果［14］；而CBS也有可能在Sanger測序的過程中發(fā)生錯配而出現(xiàn)讀碼錯誤。兩者同時檢測到的突變位點中，存在于肝癌病例A7樣本中的突變有A1383C、C1386G、A1499G、A1605C、C1655T、T1719G、A1762T、G1764A、C1827A，提示這些突變可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。其中目前文獻(xiàn)已報道與肝癌相關(guān)的突變有A1762T/G1764A雙突變［15-16］、G1386M和B1499［12］，其余未見文獻(xiàn)報道。病例A與對照B有差別的突變位點中T1753V［17］、T1768A［18］、C1773T［19-20］已被報道與肝癌相關(guān)。

從變異位點在肝癌病程中的動態(tài)變化來看，NGS和CBS均發(fā)現(xiàn)在研究對象的疾病進(jìn)程中，有變異位點隨疾病的進(jìn)展而發(fā)生變化。NGS法在研究對象A的疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)的變異位點及時間點有C1425C/T、G1512G/A、C1629C/T、C1653C/T和C1773C/T（診斷肝癌前2.5年）、A1752A/T（診斷肝癌前2年）、A1427A/T、1467G/A（診斷肝癌前1.5年）。以上有規(guī)律的突變點動態(tài)變化，表明其可能與肝病的預(yù)后有關(guān)，這些位點對肝癌發(fā)病的早期預(yù)警作用可在大隊列樣本人群中進(jìn)行驗證。

對于插入和缺失突變，NGS與CBS兩種方法都可檢測到序列中的插入變異。本研究CBS發(fā)現(xiàn)的插入突變位于nt1672～1673，NGS發(fā)現(xiàn)的插入突變位于nt1649，相比之下CBS檢出的插入片段比NGS檢出的片段長?？赡苁且驗镹GS測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)處理，過濾了長片段的插入變異。

綜上所述，在實驗方法上NGS具有高通量、省時省力等優(yōu)勢；CBS實驗成本低廉，但實驗步驟繁瑣，費時費力。在研究HBV堿基變異方面，CBS和NGS發(fā)現(xiàn)變異位點的能力相當(dāng)，CBS發(fā)現(xiàn)長片段插入和缺失的能力優(yōu)于NGS。在實際應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)研究目的選擇相應(yīng)的檢測方法。

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［2016-12-22收稿］［2017-02-12修回］［編輯 江德吉］

Comparison of next-generation sequencing and clone-based sequencing for analysis of X genemutation sites in hepatitis B virus quasispecies

Ren Jingjing1，Deng Wei1，2，F(xiàn)ang Xiang1，Xiao Chanchan1，Wu Hanghang1（1Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University；2Guangxi Cancer Prevention and Treatment Research Institute，Nanning 530021，P.R.China）

DengWei.E-mail：9608946@qq.com

Objective To compare the sensitivity and accuracy of Next-Generation Sequencing（NGS）and Clone-based Sequencing（CBS）fordetectionofX genemutation sites in hepatitisB virus（HBV）quasispecies.Methods Two individuals，onewith hepatocellular carcinoma and one without it，were selected from a prospective cohort of high-risk individuals in Guangxi，China.Peripheral blood samples（5mL）were collected every sixmonths before diagnosis of hepatocellular carcinoma，giving a total of 12 samples.HBV DNA was extracted from serum，the HBV X gene was amplified using nested PCR，and PCR products were sequenced using NGS or CBS. Results NGSdetected 40mutation sitesand 1 insertion in the X gene，while CBSdetected 41mutation sitesand 1 insertion；29mutation sites were detected by both NGS and CBS，11 sites only by NGS and 12 sites only by CBS.Mutations identified by either technique varied as hepatocellular carcinoma progressed.Conclusion NGS and CBS showed similar ability to discover mutation sites，though CBSwas better at detecting fragment insertions and deletions.The choice of sequencingmethod will depend on research purposes.

Hepatitis B virus；Quasispecies；Next-generation sequencing；Clone-based sequencing；Hepatocellular carcinoma

R512.62

A

1674-5671（2017）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.10

國家自然科學(xué)基金資助項目（81660561，81260319）；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究資助項目（KY2015ZD025）

鄧偉。E-mail：9608946@qq.com