CXCR4、PI3K和AKT在三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231中的表達

宋艷艷緱文斌張巍

作者單位：832000 石河子1新疆石河子大學醫(yī)學院；830011 烏魯木齊2新疆醫(yī)科大學；830011 烏魯木齊3新疆醫(yī)科學第一附屬醫(yī)院病理科

CXCR4、PI3K和AKT在三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231中的表達

宋艷艷1緱文斌2張巍3

作者單位：832000 石河子1新疆石河子大學醫(yī)學院；830011 烏魯木齊2新疆醫(yī)科大學；830011 烏魯木齊3新疆醫(yī)科學第一附屬醫(yī)院病理科

目的 探討CXCR4、PI3K及AKT在三陰性乳腺癌細胞株中的表達及其相關性。方法 采用過表達CXCR4質粒pcDNA3.1-CXCR4和沉默子siRNA-CXCR4分別轉染三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，分為目的轉染組和無關轉染組，同時設立空白對照組。Western blot和qRT-PCR技術檢測轉染后CXCR4、PI3K、AKT蛋白和mRNA的表達。結果轉染pcDNA3.1-CXCR4后，與空白對照組及無關轉染組比較，目的轉染組CXCR4、PI3K和AKT蛋白及mRNA表達水平升高（P＜0.05）；轉染siRNA-CXCR4后，與空白對照組和無關轉染組相比，目的轉染組CXCR4、PI3K和AKT蛋白及mRNA表達水平下降（P＜0.05）。結論 在三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231中CXCR4可調節(jié)PI3K及AKT的表達。

乳腺腫瘤；三陰性乳腺癌；CXCR4；pI3K激酶；AKT；表達

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤［1-2］，三陰性乳腺癌的生物學行為異于其他類型乳腺癌，具侵襲性強、預后差等特點［3］。研究表明，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4可通過促進腫瘤血管生成、刺激腫瘤細胞遷移和增殖等調控包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的生物學行為［4-8］。PI3K-AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉導通路，與致癌因子及其受體和細胞基本功能相關，是腫瘤中常見的異常激活信號通路［9-10］。Zhao等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12-CXCR4生物軸可通過激活MAPK及PI3K等介導腫瘤細胞遷移。本研究擬探討CXCR4、PI3K及AKT在三陰性乳腺癌細胞中的表達及其相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231由歐易生物有限公司贈與。DMEM、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自Gibco公司，青鏈霉素購自Hyclone，RNA逆轉錄試劑盒及熒光定量MIX購自Thermo公司，凱基全蛋白提取試劑盒及凱基BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。一抗CXCR4、PI3K、AKT和β-actin均購自Abcam公司，稀釋度均為1∶1 000；二抗為堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。蛋白顯色劑和TrizolR購自invitrogen公司，PVDF膜購自Thermo公司。pcDNA3.1-CXCR4由歐易生物有限公司合成，siRNA-CXCR4由吉瑪公司合成。1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，按每空2×106個細胞鋪入6孔板中。細胞鋪板培養(yǎng)12 h后，將含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基換成無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，然后按每孔500μL液體進行配制轉染液。轉染液配置：A液：5μL siRNA/pcDNA3.1+245μLOpti-MEM；B液：5μL Lip2000+245μL Opti-MEM，混勻后靜置5 min，將B液加入A液中，混勻后室溫下靜置20min，加入6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換成含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。本實驗分為3組，即空白轉染組、無關轉染組和目的轉染組。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中CXCR4、PI3K和AKTmRNA的表達

轉染細胞培養(yǎng)48 h后，收獲各組細胞，提取細胞總RNA，參照RNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。引物序列如下：CXCR4-F:5'-GGCCCTAGCTTTCTTCCACT-3'，CXCR4-R:5'-GAGAGGATCTTGAGGCTGGA-3'，產(chǎn)物大小為126 kb；PI3K-F：5'-AAATGAAAGCTCACTCTG GATTCC-3'，PI3K-R：5'-TGTGCAATTCCTATGCAATC-3'，產(chǎn)物大小為100 kb；AKT-F:5'-CGAGCTGTTCTTCCAC CTGT-3'，AKT-R:5'-CCGGTACACCACGTTCTTCT-3'，產(chǎn)物大小為121 kb。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性10 s（40 X），50℃退火30 s（40 X），72℃延伸45 s（40 X），72℃最后延伸5min。以2-△△Ct代表各基因的相對表達量。

1.4 Western blot檢測細胞中CXCR4、PI3K和AKT蛋白的表達

培養(yǎng)72 h后，收集各組細胞提取總蛋白，蛋白濃度定量后，按3∶1混勻蛋白提取液和4×蛋白上樣緩沖液，置于PCR儀中100℃變性10min。每孔蛋白上樣量為100μg。制備8%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離。分離的蛋白條帶電轉至PVDF膜上，時間為90min。室溫封閉1 h后，分別加入一抗（CXCR4、PI3K和AKT稀釋度均為1∶1 000）、內(nèi)參抗體β-actin（稀釋度1∶1 000），4℃孵育過夜。一抗孵育后，加入二抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育90min。顯色，待出現(xiàn)目的條帶時在凝膠成像儀上成像。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測轉染后CXCR4mRNA的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組CXCR4 mRNA表達較空白轉染組及無關轉染組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=173.427，P＜0.05），見圖1A；轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組CXCR4mRNA表達量較空白轉染組及無關轉染組明顯下降，差異亦有統(tǒng)計學意義（F=96.314，P＜0.05），見圖1B。

2.2 Western blot檢測轉染后CXCR4蛋白的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組CXCR4蛋白表達較空白轉染組及無關轉染組明顯升高（F=7.402，P=0.024），見圖2A；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組蛋白帶灰度值分別為（171.6±74.2）、（161.5±69.9）和（41.6±18.2）。轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組CXCR4蛋白表達較空白轉染組及無關轉染組明顯下降（F=57.682，P＜0.001），見圖2B；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組蛋白帶灰度值分別為（263.8± 23.7）、（224.5±25.3）和（421.5±25.3）。

應當說，對于輕罪范圍的劃定，采用法定最低刑或法定最高刑標準，抑或以某種刑罰方法為標準，都并非完全不可以。但是，由于我國《刑法》對罪名的設置具有概括性，犯罪危害程度的伸縮空間比較大，故法定最低刑的配置也較為多樣，以此為標準并不太適宜。而單純以某種刑罰方法為標準，則有可能出現(xiàn)輕罪范圍過寬(如以有期徒刑為標準)或者過窄(如以拘役為標準)的情況。所以，我國對輕罪范圍的劃定，采取法定最高刑標準較為適宜，這也是學界具有普遍性的認識。

圖1 轉染后CXCR4 mRNA的表達

圖2 轉染后CXCR4蛋白的表達

2.3 qRT-PCR檢測轉染后PI3KmRNA的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組PI3K mRNA表達與空白轉染組及無關轉染組相比明顯升高（F=24.765，P=0.001），見圖3A；轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組PI3K mRNA表達與空白轉染組及無關轉染組相比明顯下降（F=97.155，P＜0.001），見圖3B。

2.4 Western blot檢測轉染后PI3K蛋白的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組PI3K蛋白的表達較空白轉染組及無關轉染組升高（F=8.711，P=0.017），見圖4A；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組的蛋白帶灰度值分別為（363.9±72.9）、（353.8±75.2）、（129.7±65.6）。轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組PI3K蛋白表達較空白轉染組及無關轉染組下降（F=17.16，P=0.003），見圖4B；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組的蛋白帶灰度值分別為（327.6±30.9）、（337.9± 16.7）和（508.2±47.9）。

圖3 轉染后PI3K mRNA的表達

圖4 轉染后PI3K蛋白的表達

2.5 qRT-PCR檢測轉染后AKTmRNA的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組AKTmRNA表達較空白轉染組及無關轉染組升高（F=12.313，P=0.008），見圖 5A；轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組AKT mRNA表達較空白轉染組及無關轉染組下降（F=33.956，P=0.001），見圖5B。

圖5 轉染后AKTm RNA的表達

2.6 Western blot檢測轉染后AKT蛋白的表達

轉染pcDNA3.1-CXCR4后，目的轉染組AKT蛋白表達較空白轉染組及無關轉染組升高（F=9.033，P=0.015），見圖6A；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組的蛋白帶灰度值分別為（379.3±72.4）、（355.9±40.5）和（127.1±33.4）。轉染siRNA-CXCR4后，目的轉染組AKT蛋白表達較空白轉染組及無關轉染組下降（F=39.503，P＜0.001），見圖6B；空白轉染組、無關轉染組及目的轉染組的蛋白帶灰度值分別為（331.2±37.2）、（348.5±32.6）和（536.2±32.3）。

圖6 轉染后AKT蛋白的表達

3 討論

趨化因子是細胞因子超家族中具有趨化作用的分泌型小分子單鏈蛋白質，分子量為8～10 kDa，能激活和誘導免疫細胞，調控細胞浸潤、歸巢及血管形成，在炎癥反應和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CXCR4是趨化因子CXCL12的受體，是一個由352個氨基酸組成的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，與胞內(nèi)異源三聚體G蛋白相偶聯(lián)，基因定位于染色體2q21。CXCR4表達于淋巴組織、脾臟、小腸、胸腺、肝、神經(jīng)元等多種正常組織，也在包括乳腺干細胞在內(nèi)的多種正常組織干細胞中表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達與乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤的生長、血管生成和遠處轉移有關，是腫瘤細胞浸潤及轉移的重要因子和預后不良的重要指標［12-13］。三陰性乳腺癌是乳腺癌一種特殊的臨床病理類型，具有侵襲性強、預后差等特點［14］。本研究通過沉默或過表達CXCR4后，觀察CXCR4在三陰性乳腺癌細胞株中的表達，結果發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4表達于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株中。

Rhodes等［15］研究發(fā)現(xiàn)，表達趨化因子受體CXCR4的腫瘤患者生存期較短，且預后不良。研究［16-17］表明，阻斷CXCR4表達后，乳腺癌細胞株侵襲和轉移能力顯著下降、生長速度亦較慢。本研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA沉默CXCR4基因后，三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的趨化因子受體CXCR4mRNA和蛋白表達水平均下降（P＜0.05），與厲元紅等［18］研究結果相一致，提示siRNA-CXCR4可能抑制三陰性乳腺癌細胞株MDAMB-231中CXCR4mRNA及蛋白的表達。

PI3K可特異性催化磷脂酰肌-3位羥基磷酸化，產(chǎn)生具有第二信使作用的激酶。上游的多種刺激均可誘導PI3K活化，進而激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶。研究［19-20］表明，乳腺癌的各種亞型均有不同程度的PI3K信號通路激活，且該通路的激活預示著不良預后。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K直接下游信號分子，可被PI3K激活，活化后的AKT可通過誘導下游多種信號因子發(fā)揮作用，如調節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡、促進血管生成等［21-23］。近年研究［24-26］發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路過表達于多種腫瘤組織，如卵巢癌、結直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌等。Shen等［27］研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12與CXCR4結合后，可引起G蛋白構想發(fā)生改變，從而激活PI3K/AKT信號通路而影響細胞生物學行為?；谝陨嫌^點，推測CXCR4、PI3K和AKT在三陰性乳腺癌中存在關聯(lián)。為此，本研究采用siRAN和pcDNA3.1沉默或過表達CXCR4后觀察三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231中PI3K和AKT的表達，結果發(fā)現(xiàn)有效沉默CXCR4后，PI3K和AKT蛋白及mRNA的表達均下降；而有效提高CXCR4的表達后，PI3K和AKT蛋白及mRNA的表達均升高，推測在三陰性乳腺癌細胞株中CXCR4可能調節(jié)PI3K及AKT的表達，有關方面值得進一步深入研究。

［1］Shulman LN，WillettW，Sievers A，et al.Breast cancer in developing countries:opportunities for improved survival［J］.JOncol，2010，2010: 595167.

［2］ Mao XY，F(xiàn)an CF，Zheng HC，et al.p53 nuclear accumulation and ERalpha expression in ductal hyperplasia of breast in a cohort of 215 Chinesewomen［J］.JExp Clin Cancer Res，2010，29:112.

［3］ Rakha EA，EL-Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple negative breast cancer［J］.Cancer，2007，109（1）:25-32.

［4］ Fischer L，Korfel A，Pfeiffer S，etal.CXCL13 and CXCL12 in central nervous system lymphoma patients［J］.Clin Cancer Res，2009，15（19）:5968-5973.

［5］ SauvéK，Lepage J，Sanchez M，et al.Positive feedback activation of estrogen receptors by the CXCL12-CXCR4 pathway［J］.Cancer Res，2009,69（14）:5793-5800.

［6］ Singh S，Bond VC，Powell M，et al.CXCR4-gp 120-ⅢB interactions induce caspase-mediated apoptosisofprostate cancer cellsand inhibit tumor growth［J］.Mol Cancer Ther，2009，8（1）:178-184.

［7］ Gassmann P，Haier J，Schlüter K，et al.CXCR4 regulates the early extravasation ofmetastatic tumor cells in vivo［J］.Neoplasia，2009，11（7）:651-661.

［8］ Kwong J，Kulbe H，Wong D，et al.An antagonist of the chemokine receptorCXCR4 inducesmitoticcatastropheinovarian cancercells［J］. Mol Cancer Ther，2009,8（7）:1893-1905.

［9］ Liu P，Cheng H，Roberts TM，et al.Targeting the phosphoinositide 3-kinase pathway in cancer［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8（8）: 627-644.

［10］Engelman JA.Targeting PI3K signaling in cancer:opportunities challengesand limitations［J］.Nat Rev Cancer，2009，9（8）:550-562.

［11］Zhao M，Mueller BM，Discipio RG，et al.Akt plays an important role in breast cancer cell chemotaxis to CXCL12［J］.Breast Cancer Res Treat,2008,110（2）:211-222.

［12］Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancermetastasis［J］.Nature,2001,410（6824）:50-56.

［13］Jankowski K，Kucia M，Wysoczynski M，et al.Both hepatocyte growth factor（HGF）and stromal-de rived factor-1 regulate the metastatic behavior of human rhabdomyosarcoma cells，but only HGF enhances their resistance to radiochemotheraphy［J］.Cancer Res，2003，63（22）:7962-7935.

［14］Rakha EA，EL-Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple negative breast cancer［J］.Cancer，2007，109（1）:25-32.

［15］Rhodes LV，Short SP，Neel NF，et al.Cytokine receptor CXCR4 mediatesestrogen independenttumorigenesis，metastasisand resistance to endocrine therapy in human breast cancer［J］.Cancer Res，2011， 71（2）:603-613.

［16］Liang Z,Yoon Y,Votaw J，et al.Silencing of CXCR4 blocks breast cancermetastasis［J］.Cancer Res，2005，65（3）:967-971.

［17］Kang H，Mansel RE，JiangWG.Geneticmanipulation of stromal cell deprived factor-1 attests the piotal roleof theautocrine SDF-1-CXCR4 pathway in the aggressiveness of breast cancer［J］.Int Oncol，2005，26（5）：1429-1434.

［18］厲元紅，任國勝，譚金祥.siRNA沉默人乳腺癌細胞株CXCR4基因的實驗研究［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29（8）:728-730.

［19］Lopez KE，Mcneil CM，Millar EK，et al.PI3K pathway activation in breast cancer isassociated with the basal-like phenotype and cancerspecificmortality［J］.Int JCancer，2010，126（5）:1121-1131.

［20］Capodanno A，Camerini A，Orlandini C，et al.Dysregulated PI3K/ AKT/PTEN pathway is a marker of a short disease-free survival in node-negative breast cancer carcinoma［J］.Hum Pathol，2009，40（10）:1408-1417.

［21］GatzaML，Lucas JE，BarryWT，etal.A pathway-based classification of human breast cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107:6994-6999.

［22］Jin CY，Kin GY，Choi YH.Induction ofapoptosisby aqueousextract of Cordycepsmilitaris through activation of caspases and inactivation of AKT in human breast cancer MDA-MB-231 cells［J］.JMicrobiol Biotechnol，2008，18（12）:1997-2003.

［23］She QB，Chandarlapaty S，Ye Q，et al.Breast tumor cells with PI3K mutation or HER2 amplification are selectively addicted to AKT signaling［J］.PLos One，2008，3（8）:3065.

［24］Yousif NG.Fibronectin promotesmigration and invasion of ovarian cancer cells through up-regulation of FAK-PI3K/AKT pathway［J］. Cell Biol Int，2014，38（1）:85-91.

［25］Cumberbatch M，Tang X，Beran G，et al.Identification of a subject of human non-small cell lung cancer patients with high PI3Kbeta and low PTEN ex pression，more prevalent in squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2013，20（3）:595-603.

［26］Xie X，Tang B，Zhou J，et al.Inhibition of the PI3K/AKT pathway increase the chemosensitivity of gastric cancer to vincristine［J］. Oncol Rep，2013，30（2）:773-782.

［27］Shen X,Artinyan A，Jackson D，et al.Chemokine receptor CXCR4 enhances proliferation in pancreatic cancer cells through AKT and ERK dependent pathways［J］.Pancreas,2010,39（1）:81-87.

［2017-01-22收稿］［2017-02-21修回］［編輯 羅惠予］

Expression of CXCR4，PI3K and AKT in MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells

Song Yanyan1，Gou Wenbin2，Zhang Wei3（1Medical College of Shihezi University，Shihezi，832000，P.R.China；2Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，P.R.China；3Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830011，P.R.China）

ZhangWei.E-mail：zwyhr100@163.com

Objective To explore the expression of CXC chemokine receptor-4（CXCR4），phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）and AKT in the triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Method MDA-MB-231 cells were transfected with pcDNA3.1 encodingCXCR4 or treatedwith siRNA againstCXCR4.qRT-PCR andWestern blottingwereused todetectmRNA and protein expression of CXCR4，PI3K and AKT.Result Transfecting cells with pcDNA3.1-CXCR4 increased mRNA and protein levels of CXCR4，PI3K and AKT（P＜0.05）；siRNA-mediated silencing of CXCR4 reduced mRNA and protein levels of CXCR4，PI3K and AKT（P＜0.05）. Conclusion CXCR4 expressionmay regulate the expression of PI3K and AKT in triple-negative breast cancer.

Breast neoplasms；Triple-negative breast cancer；CXC chemokine receptor-4；Phosphatidylinositol 3-kinase；AKT；Expression

R737.9

A

1674-5671（2017）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.07

張巍。E-mail：zwyhr100@163.com