mTOR 信號通路在17-DMAG 克服EML-4ALK 陽性肺癌細胞株H3122對alectinib 耐藥中的作用機制研究

梁柳丹李婭妮宋向群周韶璋

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內(nèi)科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

基礎(chǔ)研究

mTOR 信號通路在17-DMAG 克服EML-4ALK 陽性肺癌細胞株H3122對alectinib 耐藥中的作用機制研究

梁柳丹1，2李婭妮1，2宋向群1周韶璋1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內(nèi)科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的觀察mTOR信號通路在17-DMAG克服旁路信號通路激活誘導(dǎo)棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4與間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated Protein like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因陽性肺癌細胞株H3122（以下簡稱“H3122細胞”）對alectinib耐藥中的變化，并探討其內(nèi)在的調(diào)控機制。方法 加入100 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）和100 ng/mL表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）誘導(dǎo)H3122細胞對alectinib耐藥，觀察加入17-DMAG后上述耐藥能否被克服。采用CCK-8法檢測不同處理方式下H3122細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測不同處理方式下細胞中ALK、EGFR及其磷酸化蛋白的表達，觀察其下游mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白及活化水平的表達情況。結(jié)果 alectinib作用72 h后H3122細胞增殖率隨藥物濃度升高而下降，IC50為0.042μmol/L；聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細胞對alectinib耐藥，IC50遠大于10μmol/L；單藥17-DMAG處理后H3122細胞增殖率隨藥物濃度升高而下降，IC50為 0.245μmol/L；聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細胞增殖率亦被17-DMAG抑制，且呈劑量依賴性，IC50分別為0.251μmol/L和0.301μmol/L。經(jīng)0.05μmol/L alectinib作用72 h后H3122細胞凋亡率為（30.01±0.92）%，alectinib聯(lián)合TGF-α或EGF后細胞凋亡率分別為（6.36±0.14）%和（6.13±0.21）%，顯著低于alectinib單藥處理（P＜0.001）；經(jīng)0.3μmol/L 17-DMAG單藥或聯(lián)合TGF-α、EGF作用72 h后H3122細胞凋亡率分別為（28.37±1.75）%、（26.69±1.2）%和（26.62±0.72）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。alectinib可抑制H3122細胞中p-ALK、p-mTOR的表達，也可抑制mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白的活化狀態(tài)；EGF可明顯增加細胞中p-EGFR、p-mTOR及mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白的活化水平表達；alectinib可抑制p-ALK表達，但聯(lián)合EGF后不能抑制mTOR及mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白活化水平的表達；即使聯(lián)合EGF后，17-DMAG亦能抑制H3122細胞中ALK、EGFR、mTOR信號通路蛋白及其活化狀態(tài)蛋白的表達。結(jié)論 旁路信號通路激活介導(dǎo)EML4-ALK融合基因陽性肺癌細胞株H3122對alectinib耐藥的方式具有可行性，mTOR信號通路在17-DMAG克服旁路信號通路激活引起alectinib的獲得性耐藥過程中有一定作用。

肺腫瘤；EML4-ALK融合基因；H3122細胞株；alectinib；17-DMAG；mTOR信號通路

棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4與間變性淋巴瘤激酶（echinodermmicrotubule-associated protein like4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因是2007年Soda等［1］發(fā)現(xiàn)的另一個非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）驅(qū)動突變癌基因。有報道該異常融合基因的下游信號mTOR通路可活化誘導(dǎo)腫瘤細胞生存、分化和血管生成，在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥方面發(fā)揮重要作用［2］。mTOR信號通路在ALK重排的NSCLC細胞存活及ALK抑制劑的獲得性耐藥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［3］。

alectinib是第二代高度選擇性針對ALK靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）［4］，該靶向藥物對ALK基因重排的NSCLC患者具有高效活性，對第一代ALK-TKI克唑替尼耐藥的患者及中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的患者有顯著的抗腫瘤活性［5］，但最終不可避免地對alectinib產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因陽性肺癌中EGFR作為旁路信號通路激活與alectinib耐藥相關(guān)［6］。亦有研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（eppidermalgrowth factor，EGF）、HB-EGF及轉(zhuǎn)化生長因子α（transforhing growth factor-α，TGF-α）激活EGFR可作為旁路信號通路誘導(dǎo)EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC對克唑替尼產(chǎn)生耐藥［7］。然而，EGFR配體如EGF、TGF-α等在alectinib耐藥中的作用國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。

熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）是一種分子伴侶，在調(diào)節(jié)多種顧客蛋白正確折疊、維持穩(wěn)定性和功能方面發(fā)揮重要作用［8］。EGFR、EML4-ALK融合蛋白、AKT均是HSP90顧客蛋白［9-11］。抑制NSCLC中的HSP90可導(dǎo)致EML4-ALK、EGFR表達缺失及消耗多種致癌信號蛋白［12］。17-DMAG是一種水溶性HSP90抑制劑，比其他HSP90抑制劑如17-AAG更有效和具有更優(yōu)良的口服生物利用度，能克服由EGFR配體介導(dǎo)的alectinib耐藥性［13］。目前認為對ALK抑制劑耐藥的患者可能受益于HSP90抑制劑。

目前國內(nèi)外對旁路信號通路激活致alectinib繼發(fā)耐藥及克服耐藥機制的研究較少，有關(guān)mTOR信號通路對ALK靶向耐藥及其克服耐藥的調(diào)控機制研究報道亦較少。本研究采用外源加入EGF、TGF-α激活EGFR旁路信號通路誘導(dǎo)H3122耐藥細胞株，并分析EML4-ALK融合基因陽性肺癌細胞株H3122（以下簡稱“H3122細胞”）對alectinib耐藥前后及17-DMAG克服耐藥后mTOR信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達，探討H3122細胞對alectinib出現(xiàn)獲得性耐藥的機制，以期為臨床選擇克服耐藥策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

EML4-ALK融合基因陽性人肺腺癌H3122細胞株含EML4-ALK融合基因變體1，購自科佰（南京）生物科技有限公司（美國Dana-Farber來源）。

1.2 主要試劑與儀器

alectinib、17-DMAG粉末制劑購于 Selleckchem公司，重組生長因子EGF、TGF-α購于PeproTech公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于BI公司，胰酶替代物購自Gibco公司，CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自Dojindo公司，Annexin V-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，電泳儀購自北京六一儀器廠（型號：JY-ECPT3000），凝膠成像儀（型號：170-8170）和Western blot儀器設(shè)備購于Bio-Rad公司，EGFR玉抗、p-EGFR玉抗、ALK玉抗、p-ALK玉抗、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）玉抗、p-PI3K玉抗、AKT玉抗、p-AKT玉抗、mTOR玉抗、p-mTOR玉抗、70 kD核糖體蛋白 S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）玉抗、p-p70S6K玉抗和鼠、兔熒光Ⅱ抗均購自 Cell Signaling公司，BCA試劑盒購自 Merck公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

將H3122細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，每3～4 d傳代1次。alectinib原料用DMSO溶解制成106nmol/L母液儲存于-80℃冰箱，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，并使DMSO終濃度小于0.1%。重組生長因子EGF、TGF-α用無菌雙離子水稀釋成20μg/mL，分裝儲存于-20℃冰箱。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

培養(yǎng)H3122細胞至對數(shù)生長期，按每孔5×103個細胞密度接種于96孔板，alectinib預(yù)設(shè)置8個濃度（0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μmol/L），17-DMAG設(shè)置8個濃度（0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、10μmol/L），每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按上述alectinib和17-DMAG藥物濃度梯度分別同時加入100 ng/mL EGF或100 ng/mL TGF-α，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h后，加入10μL CCK-8繼續(xù)培養(yǎng) 1～2 h，然后在492 nm波長下測量吸光度，分別計算出上述不同藥物處理方式下 H3122細胞的半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50），實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期H3122細胞，以每孔5×105個細胞分別接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。以0.05μmol/Lalectinib或0.3μmol/L 17-DMAG分別作用H3122細胞，再分別加入100 ng/mLTGF-α或100 ng/mL EGF培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，同時設(shè)置單純因子100 ng/mL TGF-α組、100 ng/mL EGF組和空白對照組。按細胞凋亡試劑盒說明書收集細胞，染色后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot法檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)信號蛋白的表達

實驗分為6組：空白對照組、alectinib組、17-DMAG組、EGF組、alectinib+EGF組、17-DMAG+EGF組，先以0.05μmol/L alectinib或0.3μmol/L 17-DMAG處理細胞24 h，然后加入100 ng/mLEGF刺激15min，收集經(jīng)不同處理方式的H3122細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)6%或10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。EGFR玉抗、p-EGFR玉抗、p-ALK玉抗、PI3K玉抗、p-PI3K玉抗、mTOR玉抗、p-mTOR玉抗、p70S6K玉抗、p-p70S6K玉抗稀釋度均為1∶1 000，ALK玉抗、AKT玉抗、p-AKT玉抗以及兔、鼠Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000，以GAPDH為內(nèi)參照。ECL發(fā)光底物顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗和LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測H3122細胞增殖情況

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，作用72 h后，H3122細胞增殖率隨alectinib藥物濃度升高而逐漸下降，alectinib對 H31222細胞的 IC50為 0.042μmol/L；alectinib聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細胞均對alectinib耐藥，EGF組更明顯，IC50均遠大于10μmol/L（圖1A）。17-DMAG聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細胞增殖率均隨17-DMAG藥物濃度升高而逐漸下降，17-DMAG對H3122細胞的IC50為0.245μmol/L，17-DMAG聯(lián)合TGF-α或EGF對H3122細胞的IC50分別為0.251μmol/L和0.301μmol/L（圖1B）。

圖1 H 3122細胞經(jīng)不同處理方式作用后的細胞存活曲線圖

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果所得H3122細胞的IC50，以0.05μmol/L alectinib和0.3μmol/L 17-DMAG作為實驗的藥物濃度作用72 h后，空白對照組、單純生長因子TGF-α組或EGF組的細胞凋亡率分別為（5.23±0.67）%、（4.94±0.33）%和（4.91±0.37）%，3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。H3122細胞經(jīng)alectinib單藥及聯(lián)合TGF-α或EGF作用后的細胞凋亡率分別為（30.01± 0.92）%、（6.36±0.14）%和（6.13±0.21）%，alectinib組細胞凋亡率較alectinib聯(lián)合TGF-α或EGF組明顯提高（P＜0.001），但alectinib聯(lián)合TGF-α與alectinib聯(lián)合EGF組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。H3122細胞經(jīng)17-DMAG單藥及聯(lián)合TGF-α或EGF作用的細胞凋亡率分別為（28.37±1.75）%、（26.69±1.2）%和（26.62±0.72）%，3組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 H 3122細胞經(jīng)不同處理方式作用72 h后的細胞凋亡

2.3 Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)信號蛋白的表達

空白對照組H3122細胞可表達ALK和下游信號通路PI3K、AKT、mTOR、p70S6K蛋白及其磷酸化狀態(tài)蛋白，同時也表達EGFR蛋白，但不表達p-EGFR蛋白。單藥alectinib作用后H3122細胞中p-ALK蛋白表達受抑制，下游信號通路p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達亦受抑制。單純EGF作用后H3122細胞可表達EGFR、ALK和下游信號通路PI3K、AKT、mTOR、p70S6K蛋白及其磷酸化狀態(tài)蛋白。alectinib聯(lián)合EGF作用后H3122細胞可抑制p-ALK蛋白表達，但不能抑制EGFR、p-EGFR和下游信號通路p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表達。17-DMAG單獨作用或聯(lián)合EGF作用H3122細胞，均能抑制H3122細胞表達ALK、EGFR和下游信號通路PI3K、AKT、mTOR、p70S6K蛋白及其磷酸化狀態(tài)蛋白。見圖3。

圖3 H3122細胞經(jīng)不同處理方式作用后PI3K/AKT/m TOR信號通路相關(guān)信號蛋白的表達

3 討論

非小細胞肺癌中ALK、EGFR等酪氨酸激酶已被確定為致癌因素［1，14］，針對這些驅(qū)動突變酪氨酸激酶，多種小分子酪氨酸激酶抑制劑已被開發(fā)。針對EML4-ALK融合基因為靶點的第一代ALK-TKIs如克唑替尼可較好地改善EML4-ALK融合基因陽性肺癌患者的預(yù)后［15］。雖然克唑替尼對ALK陽性NSCLC患者療效較好，但幾乎所有曾對克唑替尼緩解的患者治療約1年后產(chǎn)生獲得性耐藥［16］。因此，新一代ALK-TKIs應(yīng)運而生。alectinib是針對ALK為靶點的第二代ALK-TKI，在效能及選擇性上均高于第一代ALK-TKI克唑替尼。alectinib作用于表達EML4-ALK的NSCLC H2228細胞和H3122細胞，可抑制ALK自磷酸化和抑制下游信號通路PI3K/AKT/mTOR、MEK/ERK和STAT3/Survivin信號蛋白磷酸化，具有較強大的抑制效果。在臨床研究phase1/2期中，alectinib對未經(jīng)治療的ALK重排陽性NSCLC患者的客觀反應(yīng)率高達94%，無進展生存時間為27.7個月，且具有良好的安全性［4］。對克唑替尼耐藥的ALK陽性肺癌患者緩解率約為56%［5］。alectinib對ALK“gatekeeper”L1196M突變的肺癌患者亦有較強的抗腫瘤活性［3］。2016年ASCO年會上公布一項比較alectinib與克唑替尼治療晚期ALK陽性NSCLC患者的Ⅲ期臨床J-ALEX試驗［17］，該研究結(jié)果表明alectinib較克唑替尼具有更好的療效，且安全性良好。基于此，alectinib和克唑替尼已成為大多數(shù)ALK陽性NSCLC患者的一線治療方案。然而不管是alectinib還是克唑替尼，患者最終不可避免地出現(xiàn)耐藥，且經(jīng)alectinib治療失敗后的患者耐藥機制趨向多樣化，耐藥已成為限制靶向藥物治療發(fā)展的一個重要因素。

NSCLC對ALK-TKI的耐藥機制涉及多基因水平異常突變和信號傳導(dǎo)通路異常激活。目前臨床研究發(fā)現(xiàn)alectinib耐藥機制包括ALK激酶區(qū)域二次突變［18-19］、低氧誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［20］、小細胞肺癌的轉(zhuǎn)變［21］等，且已有相應(yīng)的耐藥解決方案。旁路信號通路的激活也已在alectinib耐藥的腫瘤和細胞模型［6，22-23］中有報道，但尚無確切的克服耐藥策略。本實驗CCK-8細胞活性檢測結(jié)果顯示，alectinib可顯著抑制H3122細胞增殖，其IC50值為0.042μmol/L；加入EGF或TGF-α后H3122細胞對alectinib耐藥，IC50值遠大于10μmol/L，耐藥指數(shù)大于238。Tanimoto等［13］研究顯示alectinib誘導(dǎo)H3122細胞凋亡的IC50值為0.03μmol/L，加入EGF、TGF-α后H3122細胞對alectinib產(chǎn)生耐藥，對細胞的IC50值大于10μmol/L，耐藥指數(shù)大于300，這與本研究結(jié)果大致相符。而另有研究［24］表明100 ng/mL EGF作用濃度不能誘導(dǎo)H3122細胞對alectinib產(chǎn)生耐藥，這與本研究結(jié)果不符。本研究流式細胞術(shù)結(jié)果顯示EGF或TGF-α聯(lián)合alectinib H3122細胞凋亡率明顯低于alectinib單藥處理，與Tanimoto等［13］研究結(jié)果一致。體外研究［23-24］發(fā)現(xiàn)在ALK陽性的NSCLC細胞H3122中，alectinib的獲得性耐藥由NRG1或TGF-α介導(dǎo)EGFR信號通路激活所致?？梢?，EGFR配體是旁路信號通路激活誘導(dǎo)耐藥的常見觸發(fā)因子，EGFR旁路信號通路的激活在alectinib繼發(fā)耐藥中發(fā)揮一定作用。據(jù)此本研究采用外源加入EGF、TGF-α方式誘導(dǎo)H3122細胞對alectinib耐藥，并初步探討mTOR信號通路在alectinib耐藥機制及17-DMAG克服耐藥機制的調(diào)控作用。

mTOR信號通路由細胞內(nèi)外4個主要信號包括生長因子、氧氣、能量狀態(tài)和氨基酸刺激，調(diào)節(jié)細胞生長、存活、蛋白質(zhì)翻譯和抑制細胞凋亡［25-26］。該信號通路與多條信號通路相互關(guān)聯(lián)形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，生長因子如EGF、HGF、IGF等分別刺激相應(yīng)的受體酪氨酸激酶如EGFR、MET、IGF-1R，導(dǎo)致酪氨酸殘基自身磷酸化進而調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路活化。已有研究表明PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化與肺癌發(fā)生密切相關(guān)，該信號通路可加速腫瘤細胞復(fù)制周期、抑制自噬及促進腫瘤細胞遷移［27］。在EML4-ALK融合基因陽性肺癌中，該融合基因持續(xù)異常激活下游信號通路PI3K/AKT/mTOR可導(dǎo)致腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移［1-2］。本研究結(jié)果顯示，alectinib處理H3122細胞后細胞凋亡率明顯增加且活化形式p-ALK明顯受到抑制，同時mTOR信號通路的活化形式p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達水平均受到抑制，由此推測mTOR在調(diào)控腫瘤細胞生長方面有重要作用。同時下游蛋白p70S6K的活化形式p-p70S6K蛋白表達水平亦降低，提示mTOR可能通過下游蛋白p70S6K對細胞生長進行調(diào)控。這與Kodama等［28］實驗結(jié)果提示p-AKT不受alectinib抑制不相符，而與Kogita等［20］的研究結(jié)果一致。EGF激活細胞中p-EGFR及其下游mTOR信號通路活化狀態(tài)表達，alectinib及EGF同時作用于H3122細胞時雖能抑制p-ALK，但不能抑制由EGF誘導(dǎo)后的p-mTOR及mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白活化水平的表達，推測EGF可激活EGFR磷酸化，而PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活與EGFR的磷酸化密切相關(guān)，旁路信號通路激活可繞過藥物作用的ALK靶點而激活下游信號通路PI3K/AKT/mTOR調(diào)節(jié)癌細胞持續(xù)生長及對ALK抑制劑產(chǎn)生耐藥。

HSP90抑制劑被認為是一種具有前景的可控制NSCLC生長的治療藥物，它通過阻斷HSP90導(dǎo)致“顧戶蛋白”通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解而影響多種驅(qū)動致癌蛋白表達，抑制多條信號通路活化而克服藥物的獲得性耐藥，為解決NSCLC對TKI耐藥提供了新的策略。有研究報道HSP90抑制劑可逆轉(zhuǎn)因多條旁路信號通路激活所致的繼發(fā)性耐藥［13，29］。本研究CCK-8法檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使存在EGF、TGF-α誘導(dǎo)作用，17-DMAG均能抑制H3122細胞增殖，且三者的IC50大致相近；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示加入EGF、TGF-α后，17-DMAG亦能誘導(dǎo)H3122細胞凋亡，且凋亡率大致相同，與Tani等［23］研究結(jié)果一致。Western blot檢測結(jié)果顯示，即使存在EGF誘導(dǎo)作用，17-DMAG亦能抑制H 3122細胞ALK、EGFR、mTOR信號通路蛋白及其活化狀態(tài)蛋白的表達，因此，推測在EGF介導(dǎo)EGFR旁路信號通路激活引起alectinib出現(xiàn)獲得性耐藥過程中，PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化有一定作用，而HSP90抑制劑17-DMAG可能同時抑制EGFR、EML4-ALK、mTOR等信號通路而抑制細胞增殖從而克服耐藥。

綜上所述，旁路信號通路激活介導(dǎo)EML4-ALK融合基因陽性肺癌細胞株H3122對alectinib耐藥的方式具有可行性；PI3K/AKT/mTOR信號通路可能是EML4-ALK陽性人肺腺癌細胞株H3122耐藥前后及克服耐藥過程中EML4-ALK融合基因活性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵通路，這一結(jié)果可為今后深入研究針對EML4-ALK靶點的靶向耐藥和克服耐藥機制提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。然而，本研究僅是體外細胞實驗，與人體細胞生存環(huán)境存在一定差異，且僅采用含有EML4-ALK融合變體1的細胞株，不能反映該融合基因所有變體的情況。此外，耐藥機制及克服耐藥機制復(fù)雜多變，可能涉及多條信號通路交聯(lián)及受多種綜合因素調(diào)控，難以通過單一通路或單一機制對耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥狀態(tài)下的分子變化進行全面合理地闡明。今后將進一步研究EML4-ALK信號下游通路MEK/ERK和STAT3/Survivin中各關(guān)鍵蛋白的表達水平和活化水平，明確通路上各蛋白之間的交互關(guān)系，為進一步研究耐藥機制及克服耐藥機制提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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［2016-11-28收稿］［2017-2-02修回］［編輯 羅惠予］

Role of them TOR signaling pathway in the ability of 17-DMAG to overcome acquired resistance to alectinib in the H3122 lung cancer cell line positive for the EM L4-ALK fusion gene

Objective To explore how mTOR signalingmay help 17-DMAG overcome acquired resistance to alectinib in H3122 lung cancer cells positive for the EML4-ALK fusion gene.Methods H3122 cells were induced to become resistant to alectinib byadding transforming growth factor alpha（TGF-α）or epidermal growth factor（EGF）at 100 ng/ml，then the ability of 17-DMAG to overcome this resistancewas checked after 72 h using the CCK-8 assay and AnnexinⅤ-PE apoptosis assay.Western blotting was used to detect expression of ALK，EGFR and phosphorylated protein，as well as determine the expression and activation levels of key proteins in the mTOR signaling pathway.Results Alectinib inhibited the viability of H3122 cells over 72 h in a dose-dependent manner（IC50=0.042μmol/L）.After treatmentwith TGF-αor EGF，the cells were resistant to alectinib（IC50＞10μmol/L），and 17-DMAG reduced their viability in a dose-dependentmanner（IC50=0.245μmol/L），even in the presence of TGF-α（IC50=0.251μmol/L）or EGF（IC50=0.301μmol/L）.The apoptosis rate of H3122 cellswas 30.01±0.92%after treatmentwith 0.05μmol/L alectinib for 72 h，which was significantly higher than the rate of 6.36±0.14%after the combination of alectinib and TGF-α，and 6.13±0.21%after the combination of alectinib and EGF（both P＜0.001）.Apoptosis ratewas similar after 72-h treatmentwith 0.03μmol/L 17-DMAG alone（28.37±1.75%）orwith 17-DMAG combined with TGF-α（26.69±1.2%）or EGF（26.62±0.72%）（P＞0.05）.Alectinib inhibited p-ALK and p-mTOR，aswell as activation of key proteins up-and downstream of themTOR pathway.EGF significantly increased expression of p-EGFR，p-mTOR and activationofkey proteinsup-and downstream of themTOR pathway in cells.Although alectinib inhibited p-ALK，it did not inhibit EGF-induced up-regulation of p-mTOR or activation of key proteins up-and downstream in themTOR pathway.17-DMAG inhibited expression of ALK，EGFR，mTOR and their activated forms，regardless ofwhether EGF was present or absent.Conclusions It is possible to activate signaling pathways that bypass acquired resistance to alectinib in H3122 lung cancer cells positive for the EML4-ALK fusion gene.In the case of 17-DMAG，this bypass involves the mTOR signaling pathway.

Lung neoplasms；EML4-ALK fusion gene；H3122 cell line；Alectinib；17-DMAG；mTOR signaling pathway

R734.2

A

1674-5671（2017）02-08

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.06

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260357；81060188）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（2015GXNSFAA139162）

周韶璋。E-mail:zhoushaozhang@qq.com