高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗生理代謝的影響

劉福輝

(福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，福建 福州 350003)

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)受到各種非生物因子的脅迫，其中溫度是影響植物生長的主要因子之一。高溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)部酶促反應(yīng)會(huì)發(fā)生劇烈變化，酶活性變化會(huì)引發(fā)系列植物細(xì)胞代謝失衡，使光合作用和呼吸過程受到影響[1]。植物通過調(diào)節(jié)新陳代謝進(jìn)行熱脅迫響應(yīng)，如產(chǎn)生能促進(jìn)蛋白和細(xì)胞重建的物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透來保持細(xì)胞膨脹、改變體內(nèi)氧化系統(tǒng)來重建細(xì)胞平衡和穩(wěn)態(tài)等。當(dāng)高溫脅迫不斷加強(qiáng)，將導(dǎo)致植物細(xì)胞膜損傷、光合作用受到抑制、細(xì)胞老化死亡，甚至植物表現(xiàn)出外觀形態(tài)的熱害癥狀[2]。圓齒野鴉椿(Euscapiskonishii)為省沽油科(Staphyleaceae)野鴉椿屬(Euscapis)的常綠小喬木，分布福建、廣東、廣西、江西等省區(qū)[3]。其樹形婆娑優(yōu)美，春夏之際，新枝鮮紅，老枝暗紅，黃綠花序多而密；秋季，蓇葖果由綠轉(zhuǎn)紅，紅果期跨越秋、冬和翌年春三季。成熟果實(shí)沿內(nèi)腹縫線開裂，鮮紅色內(nèi)果皮外翻呈兩瓣蝴蝶翅狀，觀果期長達(dá)8個(gè)月，是一極具潛力的園林綠化樹種[4，5]。作為傳統(tǒng)民間藥用植物，其根、果性溫，味微苦，有祛風(fēng)除濕，止血止痛，發(fā)表散寒等功效[6]。目前，對(duì)圓齒野鴉椿的研究集中于生物學(xué)特性、種苗繁育技術(shù)、生理生化特性以及開發(fā)利用等方面[5，7～8]，未見有關(guān)高溫脅迫下圓齒野鴉椿幼苗的光合特性、抗氧化酶和碳水化合物代謝方面的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2016年3月，將經(jīng)過1年沙藏處理的裂口5%左右的圓齒野鴉椿種子播種于上口徑15 cm、下口徑10 cm、高10 cm的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為炭化谷殼、黃心土和泥炭土，按體積比2∶1∶1混合均勻，每盆均勻撒播30～40粒種子。放入福建農(nóng)林大學(xué)田間試驗(yàn)溫室中育苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

每盆留苗25～30株，待苗高約15 cm時(shí)，選健康、無病蟲害、長勢(shì)好的作為試驗(yàn)苗，共計(jì)20盆。轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)。生長條件為晝夜溫度25℃/20℃，相對(duì)濕度65%～75%，光周期為10h.d-1。預(yù)培養(yǎng)7d后進(jìn)行溫度處理，其中一個(gè)生長箱晝夜溫度為25℃/20℃(對(duì)照)，另一個(gè)生長箱晝夜溫度為35℃/25℃(高溫處理)，每個(gè)處理10次重復(fù)，相對(duì)濕度仍為65%～75%，光周期為10h.d-1。各處理盆栽土壤含水量保持30%～35%。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 葉綠素含量測(cè)定

溫度處理后，分別于第1天、第2天、第3天和第4天，取正常生長的新鮮幼苗葉片各0.2 g，剪碎后研磨成勻漿，徹底離心后選用分光光度法對(duì)類胡蘿卜素的含量加以測(cè)定，而葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量的測(cè)定則采用Arnon的方法[9]。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

分別于高溫處理20 min、25 min、30 min、35 min后，隨機(jī)選取各組幼苗10片葉，采用FMS-2型熒光儀進(jìn)行測(cè)定。葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定過程中，提前將試驗(yàn)材料暗處理30 min，之后再利用12 000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖光照射，試驗(yàn)完畢后測(cè)定PSII最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm、光化學(xué)猝滅系數(shù)qP、PSII系數(shù)和1- qP[9]。

1.3.3 碳水化合物的提取

待培養(yǎng)1個(gè)月后，取若干葉片樣本，各試驗(yàn)組中摘取0.1 g葉片研磨后置于試管中，15 min后向其中倒入8 ml濃度為75%的乙醇進(jìn)行80℃水浴30 min，后全部離心再反復(fù)進(jìn)行提純，用活性炭對(duì)提取液中的色素進(jìn)行吸附。將試管烘干，加入3 ml蒸餾水后搖勻放置于沸水中加熱片刻，待徹底冷卻后向其中滴入3 ml濃度9 mol·L-1高氯酸反復(fù)進(jìn)行提取后將上清液取出待用[9]。

1.3.4 酶液的提取

待培養(yǎng)1個(gè)月后，各試驗(yàn)組中分別摘取0.2 g新鮮葉片，研磨后向其中注入2 mL 25 mM的HEPES和2.5%的非溶性PVP，研磨后離心15 min取其上清液待檢測(cè)酶液[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCELL 2003和SPSS.19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)碳水化合物代謝的影響

高溫脅迫下圓齒野鴉椿葉片中蔗糖、可溶性糖、還原性糖比對(duì)照組分別提高47.8%、9.8%、18.6%；但淀粉含量?jī)H為非高溫脅迫下淀粉含量的68.5%。淀粉含量的下降可能是由于溫度升高導(dǎo)致圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)淀粉發(fā)生降解，直接導(dǎo)致了蔗糖、還原性糖等可溶性糖含量直接升高，其作用在于使植物細(xì)胞膜的成分更加固定，一定程度上能夠降低高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗的危害。碳水化合物含量的變化能一定程度上體現(xiàn)當(dāng)前時(shí)間段圓齒野鴉椿幼苗光合作用效率的高低。一般情況下，光合作用效率的提升能夠使得植物體內(nèi)碳水化合物含量得到提高，而本試驗(yàn)中碳水化合物含量的變化也證明了試驗(yàn)過程中圓齒野鴉椿幼苗的光合作用效率發(fā)生了變化。

圖1 高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿碳水化合物含量的影響

2.2 對(duì)葉綠素含量的影響

高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)葉綠素a含量、葉綠素b含量、總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量比對(duì)照組降低了20.5～31.5%、20～30%、22.5～30.5%和18.5～29.5%，降幅依次為26%、25%、26.5%和24%。隨著高溫脅迫的不斷持續(xù)，圓齒野鴉椿幼苗體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素的含量均呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，但總體是明顯下降。

圖2 高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響

圖3 高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

Fv/Fm代表PSII最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量，qP代表光化學(xué)猝滅系數(shù)，反映PSII中心電化學(xué)反應(yīng)的能力強(qiáng)弱，系數(shù)越大，則表明電子傳遞活性的強(qiáng)度也就越高。高溫脅迫導(dǎo)致了Fv/Fm呈下降趨勢(shì)，PSII系數(shù)也呈下降趨勢(shì)，但是在25～30 min的過程中對(duì)照組和高溫脅迫之后的圓齒野鴉椿都有些許波動(dòng)，表明高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗同化力(NADPH、ATP)的形成受阻，影響了植物對(duì)碳的固定和同化。隨著脅迫時(shí)間的延長，qP逐漸降低，而1-qP逐漸升高，表明PSII的還原狀態(tài)在高溫脅迫下相對(duì)較高。

2.4 對(duì)抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶是動(dòng)植物體內(nèi)抵抗細(xì)胞衰老的重要物質(zhì)，其機(jī)理在于組織細(xì)胞與氧氣的直接接觸，從而減緩細(xì)胞氧化速度。高溫脅迫下圓齒野鴉椿葉片、根莖中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性均大于對(duì)照組；葉片中愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)的活性大于對(duì)照組，但根莖中GPX的活性比對(duì)照組小。

圖4 高溫脅迫對(duì)圓齒野鴉椿葉片和根莖抗氧化酶活性的影響

3 討論

3.1 高溫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗碳水化合物代謝的影響

高溫脅迫可引起植物細(xì)胞膜滲透性增大而導(dǎo)致電解質(zhì)滲透。為防止電解質(zhì)過多外滲，植物通過調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和含量以適應(yīng)逆境，其中可溶性糖是植物組織中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[10]。本研究結(jié)果表明，高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗中可溶性糖含量比對(duì)照組高。當(dāng)可溶性糖含量較高時(shí)，可以降低細(xì)胞的滲透勢(shì)從而維持細(xì)胞的膨壓，防止細(xì)胞內(nèi)大量的被動(dòng)脫水。淀粉是植物主要的能量?jī)?chǔ)藏物質(zhì)，是在葉綠體或淀粉體中通過一系列酶促反應(yīng)合成的，在高溫脅迫下，植物呼吸作用加強(qiáng)從而加快淀粉分解[11]。本研究結(jié)果中，高溫脅迫下淀粉的含量明顯比對(duì)照組低，說明淀粉在圓齒野鴉椿幼苗的耐熱性中起了重要作用。蔗糖是植物糖分的重要組成部分，它是植物光合作用的主要產(chǎn)物，是碳運(yùn)輸?shù)闹饕问剑彩羌?xì)胞代謝的調(diào)控因子[12]。高溫脅迫下，蔗糖含量高于對(duì)照組，可能是因?yàn)橛酌鐬榱诉m應(yīng)逆境，加快光合作用。

一般而言，溫度對(duì)于植物生長具有十分重要的影響，過高或過低都無法滿足植物生長。圓齒野鴉椿幼苗生長過程中，其新陳代謝的發(fā)生與體內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)息息相關(guān)，當(dāng)溫度未達(dá)到抑制酶促反應(yīng)發(fā)生所需的最高溫度，則當(dāng)溫度升高時(shí)，幼苗體內(nèi)的酶活性提升，所引發(fā)的酶促反應(yīng)相對(duì)更加劇烈。在此情況下，圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)蔗糖、還原性糖、可溶性糖含量分別提升，而隨著溫度的不斷升高，淀粉開始分解，進(jìn)而提升蔗糖、還原性糖、可溶性糖的整體含量，而在此過程中淀粉含量逐漸降低。

3.2 高溫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗葉片光合作用的影響

光合作用是一切生物直接或間接的能量來源，是植物進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量代謝的關(guān)鍵。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)通過對(duì)植物光合過程中熒光特性的探測(cè)可了解植物的生長、病害及受脅迫等生理狀態(tài)[13]。研究表明正常生長植物葉片中光能轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.85。當(dāng)對(duì)正常生長的植物進(jìn)行高溫脅迫時(shí)，光能轉(zhuǎn)化效率會(huì)降低，反映在高溫脅迫過程中植物葉片細(xì)胞的光合作用受到抑制[14]。PSII指標(biāo)反映光合作用過程中線性電子傳遞電子流的能力強(qiáng)弱，在正常的光合作用過程中線性電子傳遞電子流的能量對(duì)于植物的正常生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究中，在高溫脅迫下，PSII、Fv/Fm和qP明顯降低，而1-qP增大，這與Abdul K等人的研究結(jié)果一致[15]。表明光合電子傳遞以分子態(tài)氧為受體的支路反應(yīng)增強(qiáng)和PSII的部分失活，抑制光合碳代謝電子供應(yīng)，導(dǎo)致光合作用受阻[16]，同時(shí)葉片細(xì)胞的有機(jī)物合成能力也受到抑制。

葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量在一定程度上反映了葉片光合作用能力的大小[17]。本研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致圓齒野鴉椿幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯降低，原因可能有3點(diǎn)：一是高溫脅迫降低葉綠素合成速率。大多數(shù)植物即使在短時(shí)間(15～60 min)的高溫(35～40℃)脅迫下，其光合作用就會(huì)受到明顯的抑制[18]。二是高溫脅迫導(dǎo)致活性氧的積累，加速葉綠素的降解[19]。三是本研究中葉綠素a、b下降的不平衡性，導(dǎo)致葉片光合作用的降低，這與張桂蓮[20]等人的研究結(jié)果相同。類胡蘿卜素既是光合色素，又是細(xì)胞內(nèi)源抗氧化劑，一方面吸收光能并傳遞給反應(yīng)中心，另一方面可以吸收剩余能量，淬滅活性氧，防止膜質(zhì)過氧化，因此類胡蘿卜素的減少，也可導(dǎo)致葉綠素含量的降低[21]。

3.3 高溫對(duì)圓齒野鴉椿幼苗抗氧化酶活性的影響

植物正常生長的細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會(huì)傷害細(xì)胞。當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧含量增加，若不及時(shí)清除，必導(dǎo)致氧化脅迫，膜系統(tǒng)受到破壞，打破自由基的平衡，導(dǎo)致植物體內(nèi)的自由基清除機(jī)制遭到破壞[22]。為避免這種傷害，植物在長期的進(jìn)化過程中，形成一套活性氧的清除體系，主要包括酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)[23]。酶促防御系統(tǒng)主要由SOD、AXP、GPX和CAT構(gòu)成，其中，CAT通過催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，防止膜質(zhì)過氧化[24]；APX利用抗壞血酸為電子供體的H2O2清除劑，大量研究表明葉綠體中的H2O2由APX清除[25]；GPX是動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要H2O2清除劑，但是現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)在植物中GPX也具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害的作用[26]。在本研究中，高溫脅迫下，圓齒野鴉椿葉片中SOD、AXP、GPX和CAT的活性提高，表明葉片對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生的適應(yīng)反應(yīng)；根莖SOD、AXP和CAT的活性也提高了，但GPX活性卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是根莖還不適應(yīng)高溫環(huán)境。

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