外源性硫化氫對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響

劉愛東，王 箐，田 琳，劉曉紅，曾俊偉

(1.遵義醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 機能學實驗室，貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學研究

外源性硫化氫對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響

劉愛東1，王 箐2，田 琳2，劉曉紅1，曾俊偉1

(1.遵義醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 機能學實驗室，貴州 遵義 563099)

目的 觀察硫氫化鈉(NaHS,外源性的H2S供體)對低糖和高糖環(huán)境下的人腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡的影響。方法 傳代培養(yǎng)人近曲腎小管上皮細胞，細胞用無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，將細胞分為8組：低糖對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖、低糖+不同劑量NaHS組(50、100、200 μmol/L)、高糖組(40 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+不同劑量NaHS組(50、100、200 μmol/L)。將細胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)24、48 h，收集細胞。用流式細胞儀測定細胞凋亡率。結(jié)果 ①刺激培養(yǎng)24、48 h，低糖+不同劑量NaHS組HK-2細胞凋亡率明顯低于低糖對照組(P<0.05)，以NaHS中劑量組降低明顯。②高糖刺激培養(yǎng)24、48 h，高糖組細胞HK-2細胞凋亡率明顯高于低糖對照組(P<0.01)。③高糖+不同劑量NaHS組HK-2細胞凋亡率明顯低于高糖組(P<0.05)，以NaHS中劑量組降低明顯。結(jié)論 NaHS能抑制低糖條件下腎小管上皮細胞的凋亡以及高糖誘導的腎小管上皮細胞的凋亡，有助于糖尿病腎病的治療。

硫化氫；腎小管上皮細胞；細胞凋亡；高劑量葡萄糖；糖尿病腎病

糖尿病患者中約30%以上會出現(xiàn)糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)，DN是導致終末期腎病的重要原因。其發(fā)病機制復雜，至今仍未完全明確，有研究表明細胞凋亡參與DN發(fā)生機制[1]。細胞凋亡是機體內(nèi)細胞死亡的重要途徑，當細胞凋亡調(diào)控失衡時，可促進糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[2]。H2S作為一種新型的氣體信號分子，具有較強的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡等生理功能[3]。研究表明，外源性NaHS給予糖尿病大鼠能夠改善腎功能指標和病理結(jié)構(gòu)損傷及細胞凋亡[4-5]。因此，我們在體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞，觀察NaHS在低糖條件下和高糖誘導下對腎小管上皮細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人近曲腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海生命科學院；NaHS購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和FBS購于Hyclone公司；青鏈雙抗購于上海生工生物工程有限公司；D-葡萄糖購于阿拉丁試劑(上海)有限公司，DMSO(二甲基亞砜)購于Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于上海貝博生物公司。

細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo，型號:Labserv CO-150)；超凈工作臺(蘇州安泰科技有限公司)；離心機(1.德國Eppendorf公司，型號:5418)；流式細胞儀(美國BD Biosciences，型號:BD FACSVerseTM)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取凍存的HK-2細胞，37 ℃快速解凍后，161.0g離心5 min，用DMEM培養(yǎng)基清洗2次后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后再離心；加入完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天換1次培養(yǎng)基；待細胞長滿后調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 實驗分組與處理 待同步化培養(yǎng)24 h后，將細胞分為8 組：①低糖對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)；②低糖+NaHS低劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+50 μmol/L NaHS)；③低糖+NaHS中劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L NaHS)；④低糖+NaHS高劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L NaHS)；⑤高糖組(40mmol/L D-葡萄糖)；⑥高糖+NaHS低劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+50 μmol/L NaHS)；⑦高糖+NaHS中劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L NaHS)；⑧高糖+NaHS高劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L NaHS)；每組設(shè)3個復孔。放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 流式細胞術(shù)測定HK-2細胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化收集后，室溫下251.6g離心5 min，收集細胞；用4 ℃預冷1×PBS溶液重懸細胞1次，251.6g離心5 min，洗滌細胞。加入300 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞。在重懸液中加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；再加入10 μL PI染色，輕輕混勻細胞，于避光條件下室溫孵育10 min。上流式細胞儀進行檢測，CELL Quest軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對低糖條件下HK-2細胞凋亡的影響 細胞培養(yǎng)24和48 h均表現(xiàn)為低糖+NaHS低、中、高劑量組HK-2細胞凋亡率明顯低于低糖對照組(P<0.05)，以低糖+NaHS中劑量組凋亡率降低明顯(P<0.01和P<0.05，見表1、圖1～2)。

組別細胞培養(yǎng)時間(h)2448低糖對照22.19±0.3522.31±0.56低糖+NaHS低劑量15.91±0.85*18.19±0.63*低糖+NaHS中劑量7.98±0.64#12.74±0.49*低糖+NaHS高劑量10.35±0.71*15.74±0.84*

與低糖對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

A：低糖對照組；B：低糖+NaHS低劑量組；C：低糖+NaHS中劑量組；D：低糖+NaHS高劑量組。圖1 在低糖培養(yǎng)下24 h各組HK-2細胞凋亡情況

A：低糖對照組；B：低糖+NaHS低劑量組；C：低糖+NaHS中劑量組；D：低糖+NaHS高劑量組。圖2 在低糖培養(yǎng)下48 h各組HK-2細胞凋亡情況

2.2 NaHS對高糖誘導下HK-2細胞凋亡的影響 細胞培養(yǎng)24和48 h均表現(xiàn)為高糖組HK-2細胞凋亡率明顯高于低糖對照組(P<0.01)，高糖+NaHS低、中、高劑量組HK-2細胞凋亡率明顯低于高糖組(P<0.05)，以高糖+NaHS中劑量組凋亡率降低明顯(P<0.01，見表2、圖3～4)。

組別細胞培養(yǎng)時間(h)2448低糖對照22.19±0.3522.31±0.56高糖50.26±0.83**57.59±0.68**高糖+NaHS低劑量40.57±0.65#45.72±0.75#高糖+NaHS中劑量23.12±0.79##35.08±0.47##高糖+NaHS高劑量36.19±0.56#39.41±0.48#

與低糖對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01。

A：低糖對照組；B：高糖組；C：高糖+NaHS低劑量組；D：高糖+NaH中劑量組；E：高糖+NaHS高劑量組。圖3 高糖誘導下24 h各組HK-2細胞凋亡情況

A：低糖對照組；B：高糖組；C：高糖+NaHS低劑量組；D：高糖+NaH中劑量組；E：高糖+NaHS高劑量組。圖4 高糖誘導下48 h各組HK-2細胞凋亡情況

3 討論

H2S作為一種新型的氣體信號分子，具有較強的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡等生理功能[3]。NaHS是外源性H2S供體硫化鹽的一種，在溶液中可分離出Na+和HS-，隨后HS-和H+生成H2S。NaHS作為H2S供體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于H2S的研究當中。

DN是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥，也是導致慢性腎功能衰竭的主要原因。高血糖是公認的在DN中起關(guān)鍵作用的因子，在DN發(fā)展過程中，既往研究表明，腎小球損傷是DN的主要發(fā)病機制。近來的研究表明，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的損傷在早期糖尿病腎病的形成中具有重要作用[6]，腎小管損傷可能早于腎小球損傷[7]。有研究表明，內(nèi)源性H2S產(chǎn)生過少與糖尿病的發(fā)生有關(guān)[8-9]，在糖尿病患者以及糖尿病大鼠血液中，H2S的含量顯著降低[10-11]，高糖導致糖尿病大鼠和HK-2細胞凋亡，給予外源性H2S能夠減輕糖尿病大鼠腎臟的損傷和抑制細胞的凋亡[4-5]，換言之，高糖環(huán)境可引起內(nèi)源性H2S產(chǎn)生減少，導致細胞發(fā)生病理改變，補充外源性H2S或(和)內(nèi)源性H2S的增多有效抑制了DN的病理改變，抑制細胞凋亡。

本研究顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)24、48 h，HK-2細胞的細胞凋亡率明顯高于低糖對照組，提示細胞凋亡參與了高糖對腎小管上皮細胞的病理過程，這與以往的研究相一致，而給予NaHS干預高糖下HK-2 24、48 h，通過流式細胞術(shù)再次證明H2S可以減輕高糖誘導下的細胞凋亡。在本實驗研究中，還發(fā)現(xiàn)外源性H2S可抑制低糖環(huán)境中的HK-2凋亡，此結(jié)果，進一步說明H2S具有抗細胞凋亡的功能。至于高糖環(huán)境如何引起內(nèi)源性H2S的減少，H2S在病理條件下的生物學功能，以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的影響有待深入探究。

[1] 李敏,林俊.細胞凋亡途徑及其機制[J].國際婦產(chǎn)科學雜志,2014,41(2):103-107.

[2] Park K S,Kim J H,Kim M S,et al .Effects of insulin and antioxidant on plasma8-hydroxyguanine and tissue 8- hydroxydeoxyguanosine in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Diabetes,2001,50(12):2837-2841.

[3] Predmore B L,Lefer D J,Gojon G.Hydrogen sulfide in biochemistry and medicine[J].Antioxid Redox Signal,2012,17(1):119-140.

[4] Zhou X,Feng Y,Zhan Z,et al.Hydrogen sulfide alleviates diabetic nephropathy in a streptozotocin-induced diabetic rat model[J].Journal of Biological Chemistry,2014,289(42):28827-28834.

[5] 楊銳,劉小粉,馬善峰,等.硫化氫對1型糖尿病大鼠腎臟的保護作用[J].中國應(yīng)用生理學雜志,2016,32(2):181-184.

[6] Habib,Samy L.Alterations in tubular epithelial cells in diabetic nephropathy[J].J Nephrol,2013,26(5):865-869.

[7] Yamamoto J,Sato W,Kosugi T,et al.Distribution of hydrogen sulfide(H2S)-producing enzymes and the roles of the H2S donor sodium hydrosuifide in diabetic nephropathy[J].Clin Exp Nephrol,2013,17(1):32-40.

[8] Riyaz M,Calpurnia J,Punithavathi V,et al.Kidney proximal tubular epithelial-specific overexpression of netrin-1 suppresses inflammation and albuminuria through suppression of COX-2-mediated PGE2 production in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Am J Pathol,2012,181(6):1991-2002.

[9] Zhang J N,Chen S,Liu H B,et al.Hydren sulfide prevents hydrogen peroxide-induced activation of epithelial sodium channel through aPTEN/PI(3,4,5)dependent pathway[J].Plos One,2013,8(5):e64304.

[10] Liu Y H,Lu M,Hu L F,et al.Hydrogen sulfide in the mammalian cardiovascular system[J].Antioxid Redox Signal,2012,17(1):141-185．

[11] Jain S K,Bull R,Rains J L,et al.Low levels of hydrogen sulfide in the blood of diabetes patients and streptozotocintreated rats causes vascular inflammation[J].Antioxid Redox Signal,2010,12(11):1333-1337.

[收稿2017-03-21;修回2017-04-24]

(編輯：王靜)

Influence of exogenous hydrogen sulfide on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells

LiuAidong1,WangQing2,TianLin2,LiuXiaohong1,ZengJunwei1

(1.Department of Physiology, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Function Laboratory of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the influence of sodium hydrosulfide(NaHS,was taken as a donor of H2S)on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells(HK-2).Methods Human renal proximal tubular cells were cultured and divided into eight groups:low glucose as control group(5.5 mmol/L D-Glucose),low glucose + NaHS pretreatment group with dose of 50,100 and 200 μmol/L,high glucose group(40 mmol/L D-Glucose),high glucose + NaHS pretreatment group with dose of 50,100 and 200 μmol/L.Each group has three samples,cultured in 37 ℃ and 5%CO2incubator for 24 and 48 h,collected cells and cell supernatant fluid.Apoptosis rate was measured by flow cytometry.Results When cells were cultured 24 and 48 h,the apoptosis rate of low glucose + NaHS pretreatment groups were significantly lower than low glucose group (P<0.05),and decreased significantly in low glucose + NaHS (100μmol/L) dose group.The apoptosis rate of high glucose group was significantly higher than low glucose group(P<0.05),high glucose + NaHS pretreatment groups were significantly lower than high glucose group(P<0.05),and decreased significantly in high glucose + NaHS(100 μmol/L)dose group.Conclusion NaHS can suppress cell apoptosis induced by low glucose and high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells,which could be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

hydrogen sulfide;renal tubular epithelial cell;cell apoptosis;high glucose;diabetic nephropathy

貴州省科學技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合J字[2011]2259)；遵義醫(yī)學院重點學科建設(shè)項目(NO：XZXK-20120702)。

R334.1

A

1000-2715(2017)03-0264-04