龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)的影響

馬鵬飛++潘鑫鑫++萬(wàn)瑩++陳素

摘要：為研究龍血竭的有效成分龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌的影響，采用不同濃度的龍血素B作用于牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，觀察和分析了給藥前后坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值。研究結(jié)果表明：不同濃度的龍血素B單體均能抑制坐骨神經(jīng)-腓腸肌的最大收縮幅值，抑制率隨著藥物濃度增加而加強(qiáng)，到0.25 mg/mL濃度時(shí)達(dá)到最大抑制效果。龍血素B可能是通過影響坐骨神經(jīng)干上的電壓門控鈉離子通道，進(jìn)而影響坐骨神經(jīng)干上動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳遞，抑制腓腸肌的收縮。

關(guān)鍵詞：龍血素B；坐骨神經(jīng)；電壓門控鈉離子通道；動(dòng)作電位

中圖分類號(hào)：R337.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2017）10021503

1 引言

龍血竭是百合科植物劍葉龍血樹的紅色樹脂，作為傳統(tǒng)名貴民族藥物，具有活血化瘀、定痛止血、斂創(chuàng)生肌等功效[1]，普遍認(rèn)為龍血竭的有效成分為一類黃酮類化合物，其中龍血素B是鑒別龍血竭的指標(biāo)性成分[2]。以往的電生理實(shí)驗(yàn)指出龍血竭是通過調(diào)制背根神經(jīng)節(jié)上的電壓門控鈉離子通道影響痛覺信號(hào)的傳入起到鎮(zhèn)痛的作用，并且龍血素B等黃酮類物質(zhì)是調(diào)制電壓門控鈉離子通道的主要作用因子[3]，而并不清楚龍血素B在組織中的鎮(zhèn)痛效果和作用方式。酰胺類局麻藥通過可逆結(jié)合電壓門控鈉離子通道阻滯鈉離子內(nèi)流從而抑制動(dòng)作電位產(chǎn)生引起局部肌肉麻醉的機(jī)制[4]提供了一個(gè)可行的研究方案。本研究采用不同濃度的龍血素B溶液作用牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，利用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采集坐骨神經(jīng)-腓腸肌不同時(shí)間點(diǎn)的最大收縮幅值并進(jìn)行分析，間接證明龍血素B對(duì)牛蛙外周神經(jīng)興奮傳導(dǎo)的調(diào)制效果以驗(yàn)證其在組織中的作用效果是否與在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有一致性。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牛蛙，不限雌雄，體重270±10 g，購(gòu)買于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

四川泰盟科技BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，肌張力換能器，刺激電極，神經(jīng)標(biāo)本屏蔽盒。

2.3 實(shí)驗(yàn)藥品

實(shí)驗(yàn)中使用的龍血素B由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所提供，盧文杰教授鑒定。實(shí)驗(yàn)中按照一般實(shí)驗(yàn)溶液配制方法，將龍血素B加入任氏液中配制成不同濃度的溶液備用。溶液質(zhì)量濃度分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)驗(yàn)用牛蛙按照常規(guī)方法制備成坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，室溫浸泡在任氏液中15min穩(wěn)定后使用，神經(jīng)肌肉標(biāo)本隨機(jī)分成6組，每組5條，神經(jīng)干放置于肌槽上屏蔽盒中，坐骨神經(jīng)端接入露絲刺激電極，每組神經(jīng)干分別將坐骨神經(jīng)端浸于任氏液中（空白對(duì)照）以及5種不同濃度溶液中，腓腸肌跟腱用扎線與肌張力換能器連接，連接后刺激測(cè)試初始肌張力，調(diào)整扎線松緊，確保每組初始肌張力值無(wú)明顯差異。選擇實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為刺激強(qiáng)度與反應(yīng)的關(guān)系，將初始刺激強(qiáng)度設(shè)置為0 mV，增幅設(shè)置為5 mV，僅用任氏液浸泡坐骨神經(jīng)干，進(jìn)行刺激，記錄0時(shí)刻和給藥后5 min腓腸肌收縮曲線隨后每2 min進(jìn)行一次記錄，直至33min共記錄15個(gè)時(shí)間點(diǎn)收縮曲線，共記錄5個(gè)標(biāo)本，以觀察時(shí)間對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的影響；后將浸泡液換為質(zhì)量濃度分別0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL龍血素B溶液進(jìn)行同樣的刺激，觀察給藥前后各時(shí)間點(diǎn)最大收縮幅值，記錄龍血素B溶液浸泡牛蛙坐骨神經(jīng)干前后的坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值，以觀察30 min以上仍收縮良好的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本記錄為有效記錄。每種濃度的龍血素B溶液浸泡后藥理效應(yīng)的有效記錄為5個(gè)標(biāo)本。

2.5 數(shù)據(jù)分析和曲線擬合

2.5.1 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中自帶的測(cè)量功能在得到的收縮曲線上采集數(shù)據(jù)，獲得每條曲線收縮最大幅值、最大刺激強(qiáng)度（產(chǎn)生收縮最大幅值時(shí)的刺激電壓強(qiáng)度）以及閾刺激強(qiáng)度（肌肉開始收縮時(shí)的電壓強(qiáng)度）。由于空白對(duì)照組收縮最大幅值、最大刺激強(qiáng)度、閾刺激強(qiáng)度在各時(shí)間點(diǎn)所得數(shù)據(jù)與0時(shí)刻三種數(shù)據(jù)值比較無(wú)顯著性差異，將各時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)以0時(shí)刻數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理，使用歸一化處理后的數(shù)值進(jìn)行分析。同一濃度不同時(shí)刻數(shù)據(jù)用mean±sd表示，使用配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05作為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，所有數(shù)據(jù)使用SPSS分析，igor pro作圖。

2.5.2 曲線擬合

（1）藥物坐骨神經(jīng)藥物濃度依耐性。藥物對(duì)腓腸肌最大收縮幅值肌張力的百分比抑制率（Inhibition%）用式（1）表示：

（2）藥物對(duì)坐骨神經(jīng)組織中作用方式分析。在本實(shí)驗(yàn)室之前的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，龍血素B對(duì)DRG細(xì)胞膜上的電壓門控鈉離子通道作用方式符合受體學(xué)說，因?yàn)閯?dòng)作電位的產(chǎn)生主要由鈉離子內(nèi)流形成，因此猜測(cè)龍血素B影響牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳遞也應(yīng)該具有相同的藥物作用方式，在此以藥物對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率來描述藥物的藥理效應(yīng)，因此藥物在某一時(shí)刻t對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率Et為：

式（3）中，藥物分子的量用L表示，t為時(shí)間，k1和k2分別為藥物的結(jié)合與解離常數(shù)。用式（3）對(duì)藥物作用牛蛙坐骨神經(jīng)干的時(shí)效曲線進(jìn)行擬合。

曲線擬合的卡方擬合優(yōu)度檢驗(yàn)以P<0.05作為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果分析

3.1 龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的抑制效應(yīng)

對(duì)未加入藥物的腓腸肌最大收縮幅值進(jìn)行歸一化處理，并以各時(shí)刻值與初始時(shí)刻值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各時(shí)刻P>0.05，最大收縮幅值隨時(shí)間變化的曲線見圖1。0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL的龍血素B溶液對(duì)骨骼肌的最大收縮幅值均具有抑制作用，最大抑制率分別為43±12.25%、58±2.82%、74±9.49%、73±3.39%。龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)最大收縮幅值的半效抑制濃度（IC50）為0.034 mg/mL（圖2，3）。

3.2 龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值時(shí)效

將0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL這3個(gè)濃度龍血素B浸泡后各時(shí)間點(diǎn)的最大收縮幅值以加藥前最大收縮幅值為1進(jìn)行歸一化處理，并計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示0.05 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥19 min時(shí)間點(diǎn)開始每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均具有顯著性差異，P<0.05；0.1 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥5 min開始每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均具有顯著性差異，P<0.01；0.25 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥7 min開始各時(shí)間點(diǎn)均具有顯著性差異，P<0.01。這說明3種濃度的龍血素B溶液對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率隨時(shí)間而變化。

為了驗(yàn)證龍血素B作用于神經(jīng)組織是否與作用于細(xì)胞一樣，符合受體學(xué)說，以加藥時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，加藥后11 min各時(shí)間點(diǎn)龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率為縱坐標(biāo)，作0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL三種濃度龍血素B抑制作用隨時(shí)間變化的散點(diǎn)圖，用式（3）對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合，作卡方擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，結(jié)果顯示三個(gè)濃度擬合結(jié)果P>0.05，3種濃度龍血素B的時(shí)效曲線擬合見圖4。

4 結(jié)論

以往在大鼠，DRG細(xì)胞上的電生理實(shí)驗(yàn)表明，龍血竭及其藥效物質(zhì)龍血素B對(duì)初級(jí)感覺神經(jīng)元上的電壓門控的鈉離子通道具有調(diào)制作用[3]，DRG細(xì)胞上的電壓門控鈉電流也被認(rèn)為是引起其膜電位去極化的最初離子流[5]對(duì)其產(chǎn)生動(dòng)作電位具有重要意義。在解剖學(xué)上，牛蛙的坐骨神經(jīng)干連接外周神經(jīng)，可將中樞神經(jīng)產(chǎn)生的動(dòng)作電位傳遞至外周神經(jīng)進(jìn)而通過神經(jīng)肌肉接頭，引起骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放最終引起骨骼肌收縮[6]。也有很多研究表明坐骨神經(jīng)結(jié)扎的病理性痛覺模型會(huì)引起DRG神經(jīng)元上電壓門控鈉離子通道的改變[7]，可見初級(jí)感覺神經(jīng)元細(xì)胞上的電壓門控鈉離子通道是影響外周神經(jīng)傳導(dǎo)的重要因素。本實(shí)驗(yàn)正是通過測(cè)量和分析龍血素B嚴(yán)格作用坐骨神經(jīng)干后坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅值的變化，從而間接地獲取龍血素B作用神經(jīng)干后對(duì)神經(jīng)干中動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳導(dǎo)的影響的信息，以探明龍血素B作用于神經(jīng)組織后是否與龍血素B作用于DRG細(xì)胞細(xì)胞膜上的電壓門控鈉離子通道具有一致的作用效果和作用方式。

研究結(jié)果表明：龍血素B對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)最大幅值的抑制與以往在DRG細(xì)胞上進(jìn)行的電生理實(shí)驗(yàn)中龍血素B所表現(xiàn)的對(duì)電壓門控鈉離子通道電流峰值抑制的濃度依耐性關(guān)系基本一致[3，8]，但是龍血素B作用于DRG細(xì)胞對(duì)TTX-s型鈉離子通道電流的半效抑制濃度約為0.01 mmol/L[8]，而龍血素B溶液作用于神經(jīng)干引起坐骨神經(jīng)-腓腸肌最大收縮幅度抑制的半效抑制濃度為0.034 mg/mL，這一濃度遠(yuǎn)大于龍血素B作用于DRG細(xì)胞時(shí)對(duì)鈉電流峰值的半效抑制摩爾濃度。并且有趣的是龍血素B作用于組織時(shí)，不同濃度溶液浸泡坐骨神經(jīng)干所表現(xiàn)的藥物作用方式與推測(cè)并不一致，龍血素B的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)在高濃度（0.25 mg/mL）溶液作用時(shí)相較于中等濃度（0.1 mg/mL）和低濃度（0.05 mg/mL）均表現(xiàn)出了明顯的升高，這說明龍血素B在高濃度作用神經(jīng)組織時(shí)能更有效地結(jié)合組織中神經(jīng)細(xì)胞上的電壓門控鈉離子通道同時(shí)也更容易從神經(jīng)細(xì)胞上解離。這可能是由于坐骨神經(jīng)干是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的組織，由膠質(zhì)細(xì)胞、組織液和多種具有不同生理特性的神經(jīng)纖維構(gòu)成，構(gòu)成神經(jīng)纖維的神經(jīng)細(xì)胞也各不相同，藥物作用于坐骨神經(jīng)干時(shí)要經(jīng)過一個(gè)浸潤(rùn)的過程才能到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)而調(diào)制細(xì)胞膜上的電壓門控鈉離子通道，龍血素B在組織中的具體作用機(jī)制并不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

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