六神丸含服對炎性和神經(jīng)病理性疼痛的治療作用

陶珊珊++李玉桑

摘要：為探究六神丸含服對炎性和神經(jīng)病理性疼痛的治療作用，將90只昆明小鼠，按時間點（1/3 h， 1 h， 6 h）隨機分成3組每組分別設(shè)模型組、嗎啡治療組（10 mg/kg/d，腹腔注射）、雙氯酚酸鈉治療組（15 mg/kg/d；灌胃）、六神丸低高劑量組（2.812 mg/kg/d、14.06 mg/kg/d；含服），于給藥1/3 h、1 h、6 h后腹腔注射0.6%醋酸溶液，觀察了各組小鼠30 min內(nèi)的扭體次數(shù).另將15只雄性SD大鼠，給予紫杉醇（8 mg/kg/3d）建立神經(jīng)病理性疼痛模型并隨機均分為模型組、六神丸治療組，分別在0、2、4、6、12 d后檢測了1.875 mg/kg/d六神丸治療后大鼠的熱、冷和機械痛閾值和肝組織H&E染色。結(jié)果表明：2.812 mg/kg/d的六神丸能抑制醋酸引起的炎性疼痛，在體內(nèi)的作用時間持久；1.875 mg/kg/d六神丸含服給藥能明顯降低紫杉醇導(dǎo)致大鼠的熱、冷和機械痛閾值，明顯改善紫杉醇導(dǎo)致的大鼠肝臟損傷，減少肝臟炎癥。因此少量的六神丸含服有助于緩解炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛。

關(guān)鍵詞：鎮(zhèn)痛；六神丸；神經(jīng)性病理性疼痛

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：16749944（2017）10021104

1 引言

六神丸是由牛黃、蟾酥、雄黃、麝香、珍珠和冰片六味中藥配制而成的百年傳承神藥。其具有清熱解毒、消腫止痛和斂瘡生肌之功效，主要用于爛喉丹痧，喉風(fēng)乳蛾，咽喉腫癰及癰疽疔瘡等癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)灌服大于50 mg/kg的六神丸對二甲苯致小鼠耳廓腫脹有抑制作用，能減輕甲醛致大鼠足跖腫脹；減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)，延長扭體潛伏期[2]，對炎性疼痛有很好的治療作用。藥理研究實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)低劑量（10 μg/ml）的六神丸有較好的抗癌活性[3]，能有效抑制癌細(xì)胞的生存。因此，在綜合了大量文獻(xiàn)和實驗室前期的研究基礎(chǔ)上，采用含服給藥方式，降低了六神丸的給藥劑量，研究了不同給藥時間對醋酸引起的炎性疼痛和化療藥物導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛的改善效果，為其臨床抗癌鎮(zhèn)痛的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

六神丸（上海雷允上公司），雙氯芬酸鈉、伊紅、冰醋酸（Sigma），鹽酸嗎啡注射液（批號H21022436，東北制藥集團沈陽第一制藥廠），紫杉醇注射液（批號H10980170，?？谑兄扑帍S有限公司），蘇木精（南京建成）；。足底測痛儀（美國Ugo Basile），手持式測痛儀（北京碩林苑科技有限公司），鐵架臺。

SPF級昆明小鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，體重20～25 g，雄性；SPF級SD大鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，體重200～250 g，雄性，許可證號SCXK（鄂）2008-0005。

2.2 方法

2.2.1 動物分組

動物的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～25℃，濕度30%～40%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，將90只小鼠按時間點隨機分成3大組，每組30只：①1/3 h組；②1 h組；③6 h組；每大組再均分成5個小組，每組6只：①模型組；②嗎啡治療組；③雙氯芬酸鈉治療組；④六神丸低劑量治療組；⑤六神丸高劑量治療組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，將15只大鼠隨機分成3組，每組5只：①對照組；②模型組；③六神丸治療組。所有動物實驗和處理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals：實驗動物的護理和使用指南”[4]。

2.2.2 動物模型的建立

（1）扭體模型的建立：小鼠進行醋酸致扭體模型的建立，給藥后1/3 h、1 h、6 h，動物逐一腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察并記錄各組小鼠30 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

（2）神經(jīng)性病理性疼痛的建立：造模開始前分別檢測各組大鼠的熱痛閾值、機械痛閾值和冷痛閾值，各組大鼠（對照組注射等劑量的生理鹽水）注射8 mg/（kg·3d）紫杉醇溶液，誘導(dǎo)神經(jīng)性病理性疼痛[5]。六神丸治療組經(jīng)口含服（將藥物放入口腔中，待其在口腔中完全吸收后再放入籠中，并禁食禁水5 h）給予六神丸1.875 mg/（kg·d），其余各組不進行治療。在造模后2、4、6、12 d檢測各組大鼠足趾熱痛閾值、冷痛閾值和機械痛閾值。12 d后取各組大鼠的肝臟進行HE染色；

2.2.3 六神丸醇提上清的制備

取六神丸顆粒240粒，置于研缽研成細(xì)粉末。將粉末全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入42 mL無水乙醇進行溶解，放置1 d后得到醇提上清。將醇提上清凍干，保存于干燥器中備用，用時用麻油進行溶解。

2.2.4 醋酸小鼠扭體測試方法

陽性對照組灌胃給予15 mg/kg/d的雙氯酚酸鈉和腹腔注射10 mg/kg嗎啡，六神丸低、高劑量治療組分別含服給予2.812 mg/（kg·d）、14.06 mg/（kg·d）六神丸，模型組不給藥。分別在給藥1/3 h、1 h和6 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察并記錄各組小鼠30 min內(nèi)的扭體次數(shù)[9]。抑制率=（對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/對照組平均扭體次數(shù)× 100%。

2.2.5 熱痛閾值的測定

將大鼠置于足底測痛儀相應(yīng)的格子里，待其安靜后，將紅外輻射燈移至其足底，開啟紅外輻射燈，當(dāng)大鼠感覺到疼痛收縮爪子，此時紅外輻射燈熄滅，記錄計時器上所顯示的時間即為大鼠足底熱痛閾值。每只大鼠重復(fù)3次，每次至少間隔5 min，取3次實驗結(jié)果的平均值[6]。

2.2.6 機械痛閾值的測定

用手持式機械測痛儀測量大鼠的機械痛閾值。大鼠固定后，用測痛儀前端的針刺大鼠足底，刺到一定的力度后大鼠縮足，記錄此時在測痛儀上顯示的值，即為大鼠的機械痛閾值。每只大鼠重復(fù)3次，每次至少間隔5 min，取3次實驗結(jié)果的平均值[7]。

2.2.7 冷痛閾值的測定

采用冷板法測量大鼠的冷痛閾值。將大鼠置于（4±0.5）℃的冷板上，觀察并記錄大鼠從放上至縮足的時間，即為大鼠的冷痛閾值[8]。

2.2.8 大鼠肝臟H&E染色

大鼠脫頸椎處死后，取其肝臟的最大葉和次大葉置于福爾馬林溶液中固定，進行石蠟包埋。切片后進行H&E染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化，并進行肝臟炎性評分[10]。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0.1科學(xué)統(tǒng)計繪圖軟件分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間和組內(nèi)比較均采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），以p< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛

六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛結(jié)果見圖1。如圖1所示，陽性組灌服雙氯酚酸鈉或腹腔注射嗎啡1/3 h后，均可見小鼠的扭體次數(shù)明顯減少，雙氯芬酸鈉組為（84±6）次，嗎啡組為（21±3）次；與模型組進行雙氯酚酸鈉組（p<0.001）和嗎啡組（p<0.001）扭體次數(shù)顯著降低。低或高劑量的六神丸含服給藥也減少了小鼠扭體次數(shù)，低劑量六神丸組為（66±6）次，高劑量六神丸組為（69±5）次，低劑量六神丸的扭體抑制率為21.6%。給藥1 h后，低劑量的六神丸顯現(xiàn)出較有效的鎮(zhèn)痛效果（p<0.05）隨著給藥6 h后，嗎啡和雙氯酚酸鈉的治療效果減弱，嗎啡組為（72±17）次，雙氯芬酸鈉組為（44±11）次，而低、高劑量六神丸組的效果逐漸增強，低劑量六神丸組的小鼠扭體次數(shù)較模型組減少最為明顯（p<0.01），為（27±6）次，其扭體抑制率為35.2%。說明六神丸在體內(nèi)作用時間較持久，低劑量的六神丸含服給藥疼痛具有明顯的改善作用。

3.2 六神丸抑制紫杉醇引起的神經(jīng)病理性疼痛

六神丸對紫杉醇引起的神經(jīng)病理性疼痛的抑制作用結(jié)果見圖2。腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，與空白對照組（熱痛：29.0±1.3 s；機械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型組大鼠的足底熱痛閾值（11.5 s±1.8 s， p<0.001）、機械痛閾值（68.2%±19.4%， p<0.05）降低最為明顯，有顯著性的差異；同時六神丸治療組，大鼠的足底熱痛閾值（17.4 s±1.8 s，p< 0.01）明顯下降。在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，與空白對照組相比，模型組的熱痛閾值仍然相對較低（熱痛：19.3 s±1.7 s，p< 0.05），六神丸治療對大鼠的熱痛閾值（22.1 s±2.6 s）、機械痛閾值（102.5%±5.2%）以及冷痛閾值（19.2 s±6.1 s）與空白對照組相近，改善作用明顯。這說明六神丸含服給藥亦能夠有效改善化療紫杉醇引起的神經(jīng)病理性疼痛反應(yīng)。如圖2所示，腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，與空白對照組（熱痛：29.0±1.3 s；機械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型組大鼠的足底熱痛閾值（11.5 s±1.8 s）、機械痛閾值（68.2%±19.4%）以及冷痛閾值（10.6 s±1.4 s）均下降到最低；而六神丸治療后，大鼠的足底熱痛閾值（17.4 s±1.8 s）、機械痛閾值（74.3%±5.6%）和冷痛閾值（12.6 s±2.2 s）均有不同程度恢復(fù).在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，相對于模型組（熱痛：19.3 s±1.7 s；機械痛：73.3%±9.5%；冷痛：15.0 s±1.3 s），六神丸治療對大鼠的熱痛閾值（22.1 s±2.6 s）、機械痛閾值（102.5%±5.2%）以及冷痛閾值（19.2 s±6.1 s）改善更為明顯。這說明六神丸含服給藥亦能夠有效改善化療紫杉醇引起的神經(jīng)病理性疼痛反應(yīng)。

3.3 六神丸緩解紫杉醇引起的肝損傷

將大鼠的肝組織石蠟包埋后進行切片，行H&E染色，染色結(jié)果如圖3所示，圖3a中大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯的肝炎癥；而在模型組肝臟中，圖3b中可見明顯的炎癥，在血管周圍有大量的炎癥浸潤，且肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整；圖3c中在血管周圍的炎性細(xì)胞減少，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整。說明六神丸能夠明顯的降低肝臟炎癥的產(chǎn)生。

各組大鼠的肝組織的炎癥評分，即在20倍視野下數(shù)炎性灶的個數(shù)：0個計0分；1個計1分；2～4個計2分；4個以上計3分，結(jié)果見圖4。如圖4所示，六神丸含服給藥能夠有效地減少肝臟損傷，緩解化療藥物所引起的炎癥（對照組：0.75±0.25；紫杉醇組：2.67±0.33；六神丸治療組：1.33±0.33），說明六神丸治療后大鼠的肝組織炎癥得到緩解，炎癥浸潤有明顯改善。

4 結(jié)論

冰片、雄黃、珍珠六味中藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，能治療流行性感冒、急性腮腺炎和冠心病心絞痛等各類炎癥疼痛相關(guān)疾病[11]。

該實驗采用化學(xué)刺激造模，腹腔注入醋酸引起前列腺素的釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性疼痛，評價六神丸外周鎮(zhèn)痛藥的效果。馬宏躍等[12]灌胃給予六神丸大劑量112 mg/kg，15 min、45 min、1 h后腹腔注射醋酸觀察小鼠的扭體抑制率為27.6%， 1 h后藥物作用基本減弱至消失，六神丸中抗炎鎮(zhèn)痛的主藥是蟾酥和牛黃。該實驗中小鼠含服給予六神丸2.812，14.06 mg/kg，給藥20 min、1 h、6 h后腹腔注射醋酸，低劑量20 min、6 h后的扭體抑制率分別為21.6%和35.2%，鎮(zhèn)痛時間更長，劑量更低其六神丸的鎮(zhèn)痛主要成分是華蟾毒素[13]。且采取含服給藥的方式，避免了肝首過效應(yīng)，在大大降低給藥劑量的同時，獲得更好的鎮(zhèn)痛效果和延時鎮(zhèn)痛的優(yōu)勢。而低劑量的六神丸在體內(nèi)的作用時間較雙氯酚酸鈉和嗎啡更持久，說明六神丸能有效抑制炎性疼痛，比傳統(tǒng)的高劑量多次給藥的效果好，為進一步研究抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分提供了依據(jù)。

化療后疼痛是癌癥患者最常發(fā)生的后遺癥之一，其重要原因是其誘發(fā)的外周神經(jīng)性疾病，臨床上常用化療藥如長春堿類、紫杉堿類等均可誘發(fā)周圍神經(jīng)病變，發(fā)生率從30%～100%[14]，這類疼痛屬于神經(jīng)病理性疼痛的范疇。目前臨床上對于這類疼痛的治療鮮有確切有效的方法。臨床研究表明：六神丸配合三階梯止痛法能治療癌性疼痛[15]，給予病人一次10粒，每日3次的劑量。在本實驗中對大鼠給予六神丸含服一次1粒、每日1次（相當(dāng)于成人的劑量），發(fā)現(xiàn)六神丸能有效的抑制紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛，為進一步研究六神丸治療癌痛機制提供了依據(jù)。苗萬等[16]總結(jié)六神丸能降低毛細(xì)血管通透性，減少炎癥滲出，減輕竇道口的充血及腫脹，使巨噬細(xì)胞激活，增強其吞噬能力，直接抑制細(xì)菌生長并殺傷細(xì)胞，產(chǎn)生抗炎、消腫止痛的作用。實驗發(fā)現(xiàn)六神丸能明顯改善肝臟炎癥，減少化療藥物引起的肝損傷，說明少量的六神丸可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛，降低化療藥物對肝組織的損傷。

可見少量的六神丸含服給藥具有較好抗炎鎮(zhèn)痛的作用，能夠同時緩解神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛，有助于臨床化療藥物的配合使用，其詳細(xì)鎮(zhèn)痛的機制仍有待進一步的研究。

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