砷的不同形態(tài)在石菖蒲中的分布

陳 練 馬莎莎 - 易倫朝 - 顏鴻飛 - 王利兵 - 黎繼烈 -

(1. 湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；3. 昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

砷的不同形態(tài)在石菖蒲中的分布

陳 練1,2CHENLian1,2馬莎莎3MASha-sha3易倫朝3YILun-zhao3顏鴻飛1YANHong-fei1王利兵1,2WANGLi-bing1,2黎繼烈2LIJi-lie2

(1. 湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；3. 昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

建立砷元素6種形態(tài)的分析方法，研究砷的不同形態(tài)在石菖蒲不同部位中的含量、分布及轉(zhuǎn)化。采用高效液相色譜法(HPLC)分離，色譜柱HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)；流動相A為水，流動相B為pH 8.5的碳酸銨(50 mmol/L)與甲醇(1%)混合液，梯度洗脫，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(ICP-MS)測定不同形態(tài)的砷。該方法線性范圍為0.995～0.999，回收率為89%～97%。建立的檢測方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。對石菖蒲根莖、葉及與外源性三價砷浸泡后的根莖、葉進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，石菖蒲樣品中只存在砷的無機形態(tài)，且三價砷為主要存在的無機形態(tài)。石菖蒲的根莖為無機砷的主要富集部位，石菖蒲的根莖、葉均能將部分高毒性的三價砷轉(zhuǎn)化為毒性較低的五價砷。

砷；形態(tài)分析；石菖蒲；HPLC-ICP-MS

石菖蒲是一種天南星科、菖蒲屬禾草狀多年生草本植物，具有鎮(zhèn)靜安神、理氣活血、豁痰開竅等功效[1-3]。民間常食用石菖蒲以助益智安神。然而，有文獻(xiàn)[4]報道，石菖蒲中元素砷的含量較高。砷的毒性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)[5-7]。在砷的幾種存在形態(tài)中，三價砷(As III)的毒性最大，五價砷(As V)的毒性次之；一甲基砷(MMA)、二甲基砷 (DMA)的毒性較?。簧樘鸩藟A(AsB)和砷膽堿(AsC)幾乎沒有毒性。因此，要客觀地對元素砷進(jìn)行評價，僅考察砷的總量是不夠的，需要進(jìn)一步了解砷的各種形態(tài)的分布和含量。

目前，石菖蒲的研究文獻(xiàn)[8-9]主要涉及有機物和元素總量，而對砷形態(tài)分析的文獻(xiàn)[10-12]多側(cè)重于形態(tài)砷的含量分析，鮮見砷的不同形態(tài)的分布和遷移轉(zhuǎn)化研究。石菖蒲中砷的形態(tài)分析尚未見報道，不同形態(tài)的砷在石菖蒲不同部位分布和轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)也未見報道。本研究采用高效液相色譜-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)建立砷的6種形態(tài)的分析方法，研究砷的不同形態(tài)在石菖蒲不同部位的含量、分布及轉(zhuǎn)化。為砷的不同形態(tài)在石菖蒲中以至于植物產(chǎn)品中的分布、轉(zhuǎn)化研究，以及植物產(chǎn)品對砷的減毒作用研究，提供有價值的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亞砷酸根[三價砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08666，批號 1503，摩爾濃度(1.011±0.016) μmol/g]、砷酸根[五價砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08667，批號1503，摩爾濃度(0.233±0.005) μmol/g]、一甲基砷[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08668，批號 1412，摩爾濃度(0.335±0.011) μmol/g]、二甲基砷[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08669，批號1412，摩爾濃度(0.706 0±0.002 4) μmol/g]、砷甜菜堿[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08670，批號1412，摩爾濃度(0.518±0.015) μmol/g]、砷膽堿[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW08671，批號1305，摩爾濃度(0.374±0.015) μmol/g]：中國計量科學(xué)研究院；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃芪：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW 10028[GSB-18，總砷含量(0.57±0.05) μg/g]，中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所；

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GSB G 62028-90，批號13011627，濃度1 000 μg/mL，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；

鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GSB04-1728-2004，批號14307-3，濃度1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；

碳酸銨、硝酸(65%)、氨水(25%)：優(yōu)級純，德國Merck公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

石菖蒲樣品：湖南長沙，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院劉韶教授鑒定為石菖蒲(Acorustatarinowii)的根莖葉。

1.2 試驗儀器

高效液相色譜儀：1200型，配色譜柱HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)，美國Agilent公司；

電感耦合等離子體發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：820-MS型，配碰撞反應(yīng)器，美國Varian公司；

超聲波儀：B8510E-MT型，頻率60 HZ，美國Branson公司；

離心機：Universal 320型，德國Heittich公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：LABOROTA 4000型，德國Heidolph公司；

恒溫水浴搖床：BT300型，日本Yamato公司；

分析天平：MS403S型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 儀器條件 ICP-MS儀器條件見表1。ICP-MS測定75As，開啟碰撞模式以消除可能存在的多原子離子35Cl40Ar的干擾。采用內(nèi)標(biāo)元素72Ge補償信號漂移。

液相色譜條件：色譜柱為HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)。流動相A為水，B為pH 8.5的碳酸銨(50 mmol/L)與甲醇(1%)混合液。洗脫程序：0.0～3.0 min，100% B；3.1～9.0 min，90% B；9.1～9.5 min，100% B。流速1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL。

表1 ICP-MS 儀器參數(shù)表Table 1 Instrument parameters of ICP-MS

1.3.2 溶液的配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：三價砷、五價砷、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水逐級稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度見表2。6種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)工作液中保持內(nèi)標(biāo)物質(zhì)鍺的濃度為5 ng/mL。

表2 工作溶液濃度表Table 2 Concentrations of standard solutions nmol/mL

(2) 外源性三價砷接觸溶液的配制：三價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋成50 mL濃度分別為5.06，10.11，50.55，101.10 nmoL/mL 的三價砷浸泡液。

(3) 流動相B的配制：50 mmol 碳酸銨溶解于近1 L甲醇溶液(1%)中，用硝酸和氨水溶液調(diào)節(jié)pH 值為8.5，再用甲醇溶液(1%)定容至1 L，混勻、脫氣備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

(1) 石菖蒲樣品供試溶液的制備：將石菖蒲的根莖和葉完全剝離，稱取4 g根莖或葉分別置于陶瓷研缽中研磨。用約20 mL 提取液少量多次沖洗研缽與研桿后，溶液及樣品全轉(zhuǎn)移至100 mL三角燒瓶中。60 ℃恒溫水浴振蕩提取2.5 h后，浸提液4 500 r/min離心5 min，取清液過濾。樣品殘渣再次用20 mL提取液按上述過程提取兩次。過濾清液置于250 mL圓底蒸餾瓶中旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮后用超純水轉(zhuǎn)移定容到10 mL容量瓶。該溶液中保持內(nèi)標(biāo)物質(zhì)鍺的濃度為5 ng/mL。

(2) 外源性三價砷接觸樣品供試溶液的制備：稱取4 g根莖或葉樣品分別于三價砷接觸溶液中浸泡一定的時間。取出晾干后，與石菖蒲樣品相同的方法處理。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品供試溶液的制備：稱取1 g黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品同樣處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的有效性

6種砷的形態(tài)在以上色譜條件下，分離良好，見圖1。采用逐步稀釋測定3倍信噪比的方法，獲得6種砷形態(tài)的檢出限。對同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計算出峰時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察重現(xiàn)性。在0～20 nmol/mL濃度范圍內(nèi)，對6種形態(tài)砷的色譜峰與濃度進(jìn)行擬合。回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，6種形態(tài)砷的色譜峰與濃度間相關(guān)系數(shù)在0.995以上，有良好的線性關(guān)系。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，方法有良好的精密度。As(III)、As(V)的檢出限可達(dá)0.05 nmol/mL，MMA、DMA、AsB、AsC的檢出限可達(dá)0.03 nmol/mL，方法具有良好的靈敏度。

方法的準(zhǔn)確性用黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品加標(biāo)回收進(jìn)行驗證。黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中砷的標(biāo)識值為(0.57±0.05) μg/g，用該方法進(jìn)行測定，只檢出三價砷和五價砷，含量分別為0.10 μg/g及0.45 μg/g，總砷含量為0.55 μg/g，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)示值相符。實際樣品添加回收為89%～97%，數(shù)據(jù)見表4。由黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定值和回收率數(shù)據(jù)可知，方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, relative standard deviation and detection limit of the method

表4 添加濃度及回收率Table 4 Added concentrations and recoveries

2.2 無機砷在石菖蒲不同部位的分布及遷移試驗

用建立的方法對石菖蒲樣品進(jìn)行檢測，根莖中三價砷的含量為2.22 μmoL/kg，五價砷含量為0.3 μmoL/kg，一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿及砷膽堿均為未檢出；石菖蒲的葉中各種形態(tài)的砷均為未檢出。

三價砷為各種砷形態(tài)中毒性最大的，也是石菖蒲中砷的主要存在形態(tài)，因此，選擇砷的三價形態(tài)，研究其在石菖蒲不同部位中的遷移規(guī)律。考察在不同外源性三價砷接觸濃度和不同接觸時間的影響下，石菖蒲根莖和葉對無機砷吸收積累的量?？鄢浔旧淼娜齼r砷、五價砷的量，石菖蒲根莖和葉對無機砷吸收積累的量結(jié)果見表5、6。

2.3 討論

由表5、6可知，在高毒性三價砷單一來源接觸的情況下，石菖蒲樣品的根莖和葉均富集了三價砷和五價砷?？梢?，石菖蒲的根莖和葉均能通過生物代謝，將部分高毒性的三價砷轉(zhuǎn)化為較低毒性的五價砷。這可能是在石菖蒲根莖、葉細(xì)胞中，部分三價砷可以作為電子供體，被As(III)氧化酶催化從而被氧化為五價砷[13-14]，達(dá)到部分降低無機砷毒性的效果。

表5 不同濃度三價砷浸泡液浸泡4 d時石菖蒲根莖、葉中無機砷的分布量Table 5 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in different concentrations of As (III) solutions for 4 days

表6 10.11 nmol/mL三價砷浸泡液浸泡不同時間石菖蒲根莖、葉中無機砷的分布量Table 6 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in 10.11 nmol/mL As (III) solutions for different times

圖1 6種砷形態(tài)的色譜圖Figure 1 Chromatogram of six arsenic speciations

在根莖和葉中，三價砷、五價砷的積累量均與外源性三價砷的濃度及接觸時間成正比。隨著濃度和時間的增加，三價砷積累量的增幅高于五價砷積累量的增幅。可見，在三價砷單一來源接觸的情況下，三價砷仍是石菖蒲根莖和葉對砷的主要富集形態(tài)。

石菖蒲的根莖及葉對無機砷總量的積累與外源性高毒性的三價砷的濃度及接觸時間呈正相關(guān)。且在兩個因素下，石菖蒲的根莖對無機砷的積累總量均高于葉?？梢?，石菖蒲的根莖是積累無機砷的主要部位。這可能是在石菖蒲的根莖部無機砷與巰基化合物絡(luò)合，生成較為穩(wěn)定的砷-巰基絡(luò)合物，影響了無機砷向葉部的遷移，使得無機砷大部分富集在石菖蒲的根莖部[13-14]。

3 結(jié)論

本試驗建立的6種形態(tài)砷的分析方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。運用該方法測定石菖蒲中砷的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)石菖蒲中只存在無機形態(tài)的砷，其中三價砷為主要的存在形態(tài)。在有外源性三價砷接觸的情況下，石菖蒲樣品也只表現(xiàn)出對無機形態(tài)砷的積累。根莖是無機形態(tài)砷積累的主要部位。石菖蒲根莖和葉均能將部分三價砷轉(zhuǎn)化為五價砷，但三價砷仍為積累的主要形態(tài)。石菖蒲對外源性無機形態(tài)砷的積累與接觸時間和濃度呈正比。本試驗的研究成果對砷的不同形態(tài)在石菖蒲中的分布、轉(zhuǎn)換研究有重要的參考價值；可為砷的不同形態(tài)在植物產(chǎn)品中的分布、轉(zhuǎn)化及植物產(chǎn)品對砷的減毒作用研究提供了參考數(shù)據(jù)。

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Distribution Research of Arsenic speciationinAcoriTatarinowii

(1.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionNon-woodForestTrees,MinistryEducation,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 3.YunnanFoodSafetyResearchInstitute,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650500,China)

The speciation analytical method was developed to detect the arsenic (As) and research its styles, contents and distribution inAcoritatarinowii. The arsenic speciation was separated by high performance liquid chromatograph with anion exchange column (HAMILTON PR-X100, 4.1 mm×250 mm，10 μm). Mobile phases were ultra-pure water (A) and 50 mmol/L ammonium carbonate with 1% methanol(pH 8.5, B). Inductively coupled plasma emission and mass spectrometry was involved to detect arsenic speciation. The linear ranges were between 0.995 and 0.999, and the rate of recovery ranged from 89% to 97%. The method was confirmed to be accurate, stable and reliable. The results showed that leaves soaked in different contents As (III) solution for different times, only inorganic speciation of As was found, among which As (III) was the main speciation. The rhizome ofA.tatarinowiiwas the main enrichment position absorbing the inorganic arsenic. Both the rhizome and the leaves could transform the As (III) to As (V).

arsenic; speciation research;Acoritatarinowii; HPLC-ICP-MS

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.005

湖北省科技支撐計劃項目(編號：2015BHE015)；湖北省自然科學(xué)基金(編號：2014CFB891)；國家國際科技合作與交流項目(編號：2014DFG32310)

楊寧，男，武漢輕工大學(xué)助理實驗師，碩士。

何靜仁(1974—)，男，武漢輕工大學(xué)教授，博士。 E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn

2017-02-08