MEN-10，376對斷尾小鼠ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的影響

吳敏范，馬積昊，楊宇*，商麗宏，李娜然，張雅娟，吳孟霏

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院；3.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）

MEN-10，376對斷尾小鼠ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的影響

吳敏范1，馬積昊2，楊宇1*，商麗宏1，李娜然3，張雅娟4，吳孟霏2

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院；3.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）

目的：探討靜脈注射NK-2受體拮抗劑MEN-10，376對斷尾小鼠扣帶回前部（anterior cingulate gyrus，ACG）神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的影響。方法：應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究靜脈注射MEN-10，376對小鼠尾末端2.5 cm剪斷后30min ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：與空白對照組比較，斷尾小鼠ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)在斷尾后30min顯著增高；MEN-10，376靜脈注射抑制了斷尾引起的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增高（P＜0.01）。結(jié)論：斷尾小鼠ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增高的過程有外周速激肽NK-2受體參與。

MEN-10，376；NK-2受體；扣帶回前部；幻肢痛；Fos蛋白

研究證明扣帶回前部（anterior cingulate gyrus，ACG）是痛覺的重要中樞［1-2］；由于自然災(zāi)害、交通肇事、疾病等原因進(jìn)行截肢后的患者，60%以上出現(xiàn)幻肢痛（phantom limb pain，PLP）。目前，PLP發(fā)病的機(jī)制還不清楚［3］。研究發(fā)現(xiàn)截肢后大鼠的ACG對來自神經(jīng)中樞的刺激和來自外周組織的刺激反應(yīng)明顯增強(qiáng)［4］；神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)［5］、速激肽NK-2受體與痛覺有關(guān)［6-7］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，中樞速激肽NK-2受體參與小鼠斷尾引起的ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)顯著增高的過程［8］。但是，外周速激肽NK-2受體是否參與該過程尚未見報道。因此，本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了研究，并且比較了NK-2受體拮抗劑MEN-10，376對中樞NK-2受體與外周NK-2受體的作用，為治療PLP提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組選取昆明種成年雌性小鼠24只，體重（27±6）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2010-0001，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為空白對照組、斷尾后30min組、MEN-10，376（NK-2受體拮抗劑）靜脈注射（iv）組、生理鹽水iv組，各6只。

1.2 試劑ABC試劑盒及DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），MEN-10，376（美國Sigma公司）。

1.3 斷尾方法及給藥方法給予小鼠1%戊巴比妥鈉按照40mg/kg體重腹腔注射麻醉后，空白對照組不做任何處理；斷尾后30min組使用手術(shù)剪刀將小鼠尾末端2.5 cm剪斷；MEN-10，376 iv組按照1mg/kg體重給予1%MEN-10，376尾靜脈注射后10min剪斷小鼠尾末端2.5 cm；生理鹽水iv組給予同體積生理鹽水尾靜脈注射后10min剪斷小鼠尾末端2.5 cm，均用棉球止血。

1.4 檢測ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)斷尾后30min，將上述各組小鼠迅速斷頭、取腦，放入溫度為4℃的4%多聚甲醛溶液中過夜固定。冰凍切片機(jī)在-20℃的溫度下連續(xù)冠狀切片，切片的厚度為15μm。用常規(guī)的免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染片、洗片，最后用樹膠封片。用顯微圖像分析儀進(jìn)行切片ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞積分光密度及面積百分比的檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（x±s）表示，采用單因素方差分析、Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白對照組比較，斷尾后30min組、生理鹽水iv組ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著地增高（P＜0.01），即陽性細(xì)胞積分光密度和面積百分比都顯著地增高；而MEN-10，376 iv組ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)無明顯增高（P＞0.05）。與斷尾后30min組、生理鹽水iv組相比較，MEN-10，376 iv組ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)顯著地降低（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 尾靜脈注射MEN-10，376對斷尾小鼠ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)影響

圖1 尾靜脈注射MEN-10，376對斷尾小鼠ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)影響（免疫組化染色×400）

3 討論

研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)Fos蛋白的部位，與傷害性信息的傳入、分析整合有關(guān)［9］；截肢對大鼠ACG神經(jīng)元的活動有明顯的影響［4］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，剪斷小鼠尾末端后30 min引起ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增高。該結(jié)果表明，斷尾小鼠ACG的神經(jīng)元能感受傷害信息的傳入，參與斷尾引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PLP提供了新的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PLP是截肢術(shù)后患者常見的并發(fā)癥。然而，PLP的產(chǎn)生原因目前尚不清楚。NK-2速激肽受體參與痛覺活動［10］。中樞速激肽NK-2受體參與小鼠斷尾引起的ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)顯著增高的過程［8］。但是，外周速激肽NK-2受體是否參與該過程尚未見報道。本研究觀察到尾靜脈注射MEN-10，376能夠抑制剪斷尾末端誘發(fā)的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)水平的顯著增高，提示外周NK-2受體參與了剪斷尾末端誘發(fā)的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)水平的顯著增高過程，外周NK-2受體可能是治療PLP的重要潛在靶點(diǎn)之一。比較對剪斷尾末端誘發(fā)的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)水平顯著增高的抑制作用，MEN-10，376尾靜脈注射（ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞積分光密度5.9724± 0.9077和面積百分比1.6976±0.4305）強(qiáng)于蛛網(wǎng)膜下腔注射（ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞積分光密度6.2372±0.4174和面積百分比2.1594± 0.3392）［8］，提示MEN-10，376阻斷外周NK-2受體的作用強(qiáng)于阻斷中樞NK-2受體的作用。

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Effect of MEN-10，376 on Fos Protein Expression of Neurons in Anterior Cingulate Gyrus Caused by Am putating theM ice TailExtrem ity

WUMinfan1，MA Jihao2，YANGYu1*，SHANG Lihong1，LINaran3，ZHANGYajuan4，WUMengfei2
（1.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.He University，3.Laboratory of Morphology；4. Departmentof Neurology，The Fifth People's Hospitalof Shenyang）

Objective：To investigste the effectof intravenous injection of NK-2 receptor antagonistMEN-10，376 on Fos protein expression of neurons in anterior cingulate gyrus（ACG）caused by amputating the mice tail extremity.Method：The effect of intravenous injection ofMEN-10，376 on Fos protein expression ofneurons in ACG at30min after amputating themice tailextremity 2.5 cm was studied with immunohistochemistrymethod.Result：Compared with the control group，F(xiàn)os protein expression of neurons in ACG at30min after the amputating increased remarkably，which was inhibited by intravenous injection ofMEN-10，376（P＜0.01）.Conclusion：Peripheral tachykinin NK-2 receptors are involved in the process of remarkable increase in Fos protein expression of neurons in ACG of the amputatedmice.

MEN-10，376；NK-2 receptor；anterior cingulate gyrus；phantom limb pain；Fos protein

R338；Q432

A

1008-2344（2017）03-0196-02

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.003

2017-02-11

（文敏編輯）

遼寧省科技廳基金項(xiàng)目（No.L2015020391）；沈陽市科技局計劃項(xiàng)目（No.F13-220-9-45）

吳敏范（1963—），女（滿），博士，教授，研究方向：痛覺及鎮(zhèn)痛機(jī)制.

［通訊作者］楊宇（1976—），男（漢），碩士，講師，研究方向：痛覺及鎮(zhèn)痛機(jī)制.E-mail：129977@qq.com