響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蘋果渣低聚糖的工藝

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(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

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響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蘋果渣低聚糖的工藝

陳文超,張錦華,葉崢,田旭靜,張婧婷,范三紅*

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

以蘋果渣為原材料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法,研究超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響。優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為超聲時(shí)間35 min、料液比1∶17 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度43 ℃,在此實(shí)驗(yàn)條件下,蘋果渣低聚糖實(shí)際得率為13.23%。結(jié)果表明,響應(yīng)面分析法對(duì)超聲波輔助提取蘋果渣低聚糖的工藝優(yōu)化合理可行,為其開發(fā)利用提供了理論支持。

蘋果渣,低聚糖,提取,響應(yīng)面

我國(guó)是蘋果生產(chǎn)大國(guó),自2004年起一直居全世界鮮蘋果出口國(guó)第一[1]。2015年,我國(guó)蘋果資源豐富,種植面積高達(dá)232.2公頃,總產(chǎn)值達(dá)4100萬(wàn)噸[2],帶動(dòng)了蘋果汁加工業(yè)的發(fā)展,使我國(guó)成為最大的蘋果汁出口國(guó)[3],2015年我國(guó)蘋果汁出口量為47.5萬(wàn)噸[4],但同時(shí)也產(chǎn)生了大量的蘋果殘?jiān)?。從我?guó)目前蘋果渣利用情況來(lái)看,蘋果渣多數(shù)以回收垃圾方式處理,少數(shù)用作動(dòng)物飼料[5-6]。蘋果渣中含有酚類、糖類、蛋白質(zhì)、纖維素和維生素等[7-8]。因此,將蘋果渣中的有效成分進(jìn)行提取分離,對(duì)減少環(huán)境污染,提高廢渣利用率有重要意義。

低聚糖又名寡糖,是由2～10個(gè)單糖分子由糖苷鍵聚合而成的低度聚合物[9]。已證實(shí)低聚糖具有改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、調(diào)節(jié)腸胃功能、改善血脂代謝、提高人體免疫功能、延緩衰老和抑制腫瘤等顯著藥理活性[10]。由于低聚糖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量較小,因此溶解性和穩(wěn)定性好,與多糖相比,活性明顯提高且毒性低[11]。獲得低聚糖的方式主要有:天然提取[12]、多糖降解[13]、生物法[14-15]、化學(xué)或酶法合成[16]等。國(guó)內(nèi)外目前對(duì)蘋果渣多酚[17-18]、果膠[19]、膳食纖維[20]等功能性成分的研究較為深入,而對(duì)蘋果渣低聚糖的研究較少,已有研究報(bào)道了采用多糖降解[10]的方法提取蘋果渣中的功能性低聚糖。天然提取法相比于多糖降解法,具有耗時(shí)短、操作方便、工作程序簡(jiǎn)單、有利于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)探討蘋果渣低聚糖的天然提取分離技術(shù),采用超聲波輔助提取,且對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,為尋找蘋果渣的新利用途徑和獲得更高的加工附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

干燥蘋果渣 陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司運(yùn)城分公司;葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇 均為分析純。

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SC-3614低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SHZ-B水浴 恒溫振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HRHS24電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;JP-040ST型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;JA1203N型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果渣預(yù)處理 去除蘋果渣中除了殘余果肉及果皮的雜質(zhì),用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目的篩子,將處理好的蘋果渣于-4 ℃保存。

1.2.2 蘋果渣低聚糖提取流程 粉碎蘋果渣加入乙醇溶液→超聲波浸提→4000 r/min、15 min離心分離(去除多糖)[21]→上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至原液體積的1/4左右→加4倍體積無(wú)水乙醇醇沉24 h(去除多糖及蛋白質(zhì))[21]→4000 r/min、15 min離心分離→上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至原液體積的1/4左右→ 蘋果渣粗低聚糖溶液[22]

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在超聲波功率為240 W下,分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間四個(gè)因素對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響。

1.2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 料液比為1∶20 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,超聲溫度為40 ℃,分別在不同超聲時(shí)間(8、16、24、32、40 min)下考察蘋果渣低聚糖的得率。

1.2.3.2 料液比對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,超聲時(shí)間為32 min,超聲溫度為40 ℃,分別在不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)下考察蘋果渣低聚糖的得率。

1.2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 料液比為1∶20 g/mL,超聲溫度為40 ℃,超聲時(shí)間為32 min,分別在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、50%、65%、80%、95%)下考察蘋果渣低聚糖的得率。

1.2.3.4 超聲溫度對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 料液比為1∶20 g/mL,超聲時(shí)間為32 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,分別在不同超聲溫度(25、30、40、50、60 ℃)下考察蘋果渣低聚糖的得率。

1.2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選用料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以低聚糖得率(Y)為指標(biāo),優(yōu)化蘋果渣低聚糖提取工藝條件,響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experimental design

1.2.5 蘋果渣低聚糖含量的測(cè)定 此工藝中提取及醇沉過(guò)程中采用較高濃度的乙醇為溶劑,多糖無(wú)法溶解在其中,且蘋果渣中的單糖含量很低[23],推斷此工藝得到的蘋果渣提取液中糖類化合物以低聚糖為主,因此低聚糖含量可用總糖含量來(lái)表示[24],故采用苯酚-硫酸法[25]測(cè)定低聚糖含量。

將葡萄糖在105 ℃下干燥至恒定重量,精密稱取25 mg,放置在250 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水使之溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中,分別加水至2 mL。每個(gè)試管中精密加入5%苯酚試液1.0 mL,振蕩搖勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL,振蕩充分且搖勻,在40 ℃的水浴鍋中保溫18 min,取出后迅速降至室溫,在490 nm處測(cè)定吸光度值。取2 mL蒸餾水,相同的方法操作,作為空白對(duì)照。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=14.431X+0.0047,R2=0.9972。

將提取液稀釋取2 mL,加5 mL濃硫酸,1 mL苯酚,根據(jù)苯酚-硫酸法于490 nm處測(cè)吸光度,計(jì)算低聚糖得率。

式中:x為提取液中低聚糖濃度(mg/mL);n為稀釋體積;m為蘋果渣質(zhì)量(g)。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn),采用QriginPro 9.0軟件進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 超聲提取時(shí)間對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響如圖1所示。在32 min之內(nèi),蘋果渣低聚糖得率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)超聲時(shí)間為32 min時(shí),低聚糖得率最高,之后隨著超聲時(shí)間增加低聚糖得率反而減少。這可能是因?yàn)槌暡ㄗ饔脮r(shí)間和超聲波作用強(qiáng)度存在一定聯(lián)系,作用時(shí)間越長(zhǎng),強(qiáng)度也相應(yīng)增加,低聚糖的結(jié)構(gòu)受到一定破壞,致使低聚糖得率也減少[24]。

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on the yield of oligosaccharides in apple pomace

圖2 料液比對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.1.2 料液比對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 料液比對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響如圖2所示。在一定范圍內(nèi),加大料液比,蘋果渣低聚糖得率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),之后得率減小,推測(cè)可能由于料液比影響超聲波作用于蘋果渣的效果,料液比過(guò)小,溶液太粘稠,超聲波不能充分作用于蘋果渣,料液比過(guò)大,蘋果渣被過(guò)量稀釋,超聲波同樣也不能充分作用于蘋果渣[26]。因此選擇料液比為1∶20(g/mL)。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響如圖3所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,蘋果渣低聚糖得率增加,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),低聚糖得率最大,隨之下降。可能因?yàn)榫酆隙容^高的蘋果渣低聚糖不溶于80%以上的乙醇,低聚糖在乙醇溶劑中含量減少,導(dǎo)致低聚糖得率降低[24]。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.1.4 超聲溫度對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響 超聲溫度對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響如圖4所示。隨著超聲溫度的上升,低聚糖得率逐漸增加,在40 ℃時(shí),低聚糖得率達(dá)到最高,隨后下降,逐漸趨于平緩,可能由于溫度升高使溶劑揮發(fā),溶液粘度隨之增加,從而不利于低聚糖溶解,蘋果渣低聚糖得率下降[27],因此,超聲提取溫度選擇40 ℃為宜。

圖4 超聲提取溫度對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.2響應(yīng)面優(yōu)化提取蘋果渣低聚糖工藝

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以超聲時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和超聲溫度(D)為自變量,以蘋果渣低聚糖得率(Y)為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0.6對(duì)蘋果渣低聚糖得率進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析。表2為響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果,其中1～20為析因?qū)嶒?yàn),21～25為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 對(duì)表2中的數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行回歸分析,得到蘋果渣低聚糖得率的二次模型:

Y=13.16+0.40A+0.13B-0.033C+0.86D+0.49AB+0.20AC+0.37AD-0.60BC+0.63BD+0.12CD-0.84A2-0.98B2-1.65C2-2.05D2

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析見表3?；貧w模型極顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),說(shuō)明模型可以擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。決定系數(shù)R2=95.49%,預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值具有較好的相關(guān)性,說(shuō)明此模型可以解釋95.49%響應(yīng)值的變化,因此,該回歸方程可以描述各因素對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響,可用以確定蘋果渣低聚糖的最佳提取工藝。模型中一次項(xiàng)A、D,二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2(p<0.01)影響極顯著,交互項(xiàng)AB、BC、BD(p<0.05)影響顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程作出響應(yīng)面圖和等高線圖,由表3可知,AB、BC、BD交互作用具有顯著性,分析雙因素交互作用如下。

圖5 超聲提取時(shí)間和料液比交互影響低聚糖得率的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of ultrasonic extraction time and solid-liquid ratio on oligosaccharides yield

從響應(yīng)面曲面的坡度可以看出每個(gè)因素對(duì)低聚糖得率影響的強(qiáng)弱水平,從等高線圖的形狀可以看出兩個(gè)變量間的交互作用是否顯著[28]。坡度越大說(shuō)明該因素對(duì)低聚糖得率影響越強(qiáng),等高線圖為橢圓形說(shuō)明兩因素之間交互作用顯著。由圖可以看出在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi),存在蘋果渣低聚糖的最大得率。由圖5可知,超聲時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)蘋果渣低聚糖得率影響顯著,超聲時(shí)間24～40 min、料液比1∶15～1∶25 g/mL時(shí),低聚糖得率先增大后減小。超聲時(shí)間32 min、料液比1∶20 g/mL附近值對(duì)蘋果渣低聚糖得率有重要影響。由圖6可以看出,料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果渣低聚糖得率影響顯著,料液比1∶15～1∶25 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%～95%時(shí),低聚糖得率先增大后減小。料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%附近值對(duì)蘋果渣低聚糖得率有重要影響。由圖7可得,料液比和超聲溫度的交互作用蘋果渣低聚糖得率影響顯著,料液比1∶15～1∶25 g/mL、提取溫度30～50 ℃時(shí),低聚糖得率先增大后減小。料液比1∶20 g/mL、超聲溫度40 ℃附近值低聚糖得率最大。

圖6 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響低聚糖得率的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ethanol volume fraction on oligosaccharides yield

圖7 料液比和超聲提取溫度交互影響低聚糖得率的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic extraction temperature on oligosaccharides yield

綜合響應(yīng)面圖和等高線圖可知,四個(gè)因素對(duì)蘋果渣低聚糖得率的影響及兩因素交互作用與回歸分析一致。利用Design-Expert 8.0.6分析處理,對(duì)擬合的二次回歸方程求最大值得到蘋果渣低聚糖提取的最佳工藝條件為:超聲時(shí)間35.01 min、料液比1∶16.67 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.64%、超聲溫度42.84 ℃。在此條件下單次提取蘋果渣低聚糖,預(yù)測(cè)值得率為13.3753%。

2.2.4 超聲波提取蘋果渣低聚糖工藝條件的驗(yàn)證及確定 考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性及方便性,修正最佳提取條件為:超聲時(shí)間35 min、料液比1∶17 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度43 ℃。按此條件進(jìn)行三次重復(fù)提取實(shí)驗(yàn),蘋果渣低聚糖得率分別為13.24%、13.17%、13.29%,計(jì)算得平均得率為13.23%,與預(yù)測(cè)值13.3753%接近,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢暂^好地預(yù)測(cè)超聲波提取蘋果渣低聚糖的實(shí)際提取效果,具有可行性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析,對(duì)超聲波提取蘋果渣低聚糖工藝中的主要參數(shù)進(jìn)行分析優(yōu)化,確定了超聲時(shí)間和超聲溫度為顯著影響因素,即最佳工藝條件為超聲時(shí)間35 min、料液比1∶17 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度43 ℃,此條件下低聚糖得率為13.23%。該方法縮短了蘋果渣低聚糖提取時(shí)間,操作簡(jiǎn)便易行,為蘋果渣資源綜合利用率提供了理論支持。

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Optimizationofoligosaccharideextractionwithultrasonic-assistedfromapplepomacebyresponsesurfacemethodology

CHENWen-chao,ZHANGJin-hua,YEZheng,TIANXu-jing,ZHANGJing-ting,FANSan-hong*

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The apple pomace was used as raw material to extract oligosaccharide by means of ultrasonic-assisted. The effect of ultrasonic time,solid-liquid ratio,ethanol volume fraction and ultrasonic temperature on the yield of oligosaccharides from apple pomace were investigated using Box-Behnken design and response surface methodology,which based on the single factor experiment. The optimal process parameters were as follows:ultrasonic time 35 min,solid-liquid ratio 1∶17 (g/mL),ethanol volume fraction 80%,ultrasonic temperature 43 ℃. Under these conditions,the yield of oligosaccharides from apple pomace was up to 13.23% in practice. The results showed that the method of response surface analysis was reasonable and feasible for ultrasonic extraction of apple pomace oligosaccharides,providing theoretical support for its development and utilization.

apple pomace;oligosaccharide;extraction;response surface methodology

2016-11-23

陳文超(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：164951270@qq.com。

*通訊作者:范三紅(1963-)，男，大學(xué)本科，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012011031-4)；2016年山西省高等學(xué)校教學(xué)改革創(chuàng)新項(xiàng)目(J2016003)；2016年山西省研究生教育改革研究課題(2016JG26)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)12-0277-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.050