同步輻射X射線成像技術(shù)在腦成像研究中的應(yīng)用

湯喬偉，蔡小青，李 江，諸 穎，王麗華，田 陽(yáng)，樊春海，胡 鈞

（1.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所,中國(guó)科學(xué)院微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201800；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,基礎(chǔ)交叉研究中心,上海同步輻射光源，張江實(shí)驗(yàn)室,上海 201210；3.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,上海 200025；4.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200241；5.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049）

大腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分，思考、運(yùn)動(dòng)等心理或生理運(yùn)動(dòng)都離不開大腦，其重要性不言而喻.人腦神經(jīng)聯(lián)接功能異常會(huì)導(dǎo)致帕金森癥、癲癇、精神分裂癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病［1～5］，人腦聯(lián)接圖譜是這一系列問題的重要突破點(diǎn).聯(lián)接組學(xué)主要是通過分析神經(jīng)元之間的聯(lián)接和組織方式來(lái)達(dá)到分析大腦的運(yùn)行機(jī)制這一終極目的的一門學(xué)科，描繪出完整的人腦聯(lián)接圖譜不僅可以幫助理解特定反應(yīng)和行為回路的構(gòu)成，也可以幫助理解這些回路是如何整合來(lái)產(chǎn)生一個(gè)具有一致性和優(yōu)先級(jí)的適應(yīng)性輸出［6］.

人腦聯(lián)接圖譜的繪制離不開成像方法的支持，目前，應(yīng)用于腦成像領(lǐng)域的三維成像方法主要是核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、光學(xué)成像和電子顯微鏡成像（Electron microscopy，EM），通過這些成像方法已獲得了神經(jīng)元和神經(jīng)回路不同尺度的圖像數(shù)據(jù).在突觸分辨率下，研究者們已通過EM獲得了線蟲、果蠅及小鼠等全腦或部分腦聯(lián)接組圖譜［7～9］，但黑腹果蠅的大腦體量只有約0.08 mm3，成像時(shí)間長(zhǎng)約16個(gè)月，依次推算若要成像1 mm3需要花費(fèi)16.7年，假設(shè)對(duì)人全腦成像則需花費(fèi)2.5×107年，因此以現(xiàn)有的EM成像技術(shù)，完成人腦聯(lián)接圖譜幾乎是不可能完成的任務(wù).作為科學(xué)研究新的大型光源，同步輻射光源在各研究領(lǐng)域均取得了重大的成果突破，其中同步輻射X射線成像技術(shù)，相較于實(shí)驗(yàn)室X射線源具有高準(zhǔn)直性、高亮度等優(yōu)勢(shì)，無(wú)論是對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)成像，還是對(duì)大腦中蛋白質(zhì)及元素探測(cè)都具有高靈敏度［10，11］.基于同步輻射的微米X射線斷層掃描（Micro-computed tomography，Micro-CT）和X射線納米全息層析成像（X-ray nano holotomagraphy，XNH）等技術(shù)，具有高穿透性（可對(duì)毫米厚度的腦組織塊進(jìn)行成像）和成像速度快（可在1 min內(nèi)成像1 mm3的組織塊）的特點(diǎn)［12］.同步輻射X射線成像技術(shù)可能會(huì)是腦科學(xué)尤其是大尺寸腦組織聯(lián)接圖譜繪制的一大利器.本綜述先介紹了核磁共振波譜、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡等成像方法在腦成像及聯(lián)接圖譜中的應(yīng)用，再對(duì)同步輻射X射線成像的基本情況及其在腦成像領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜合評(píng)述，探討了同步輻射X射線成像技術(shù)在人腦聯(lián)接圖譜繪制的應(yīng)用前景及現(xiàn)有技術(shù)的局限，指出了進(jìn)一步研究的重點(diǎn)發(fā)展方向.

1 腦科學(xué)研究的主要成像方法

神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的基本組成單位，神經(jīng)元成像對(duì)神經(jīng)科學(xué)的研究至關(guān)重要.腦聯(lián)接圖譜研究大致分為3個(gè)層次［13］：宏觀聯(lián)接圖譜（Macroscopic connectome），其分辨率在毫米級(jí)以上，研究不同腦灰質(zhì)區(qū)域之間的聯(lián)接，主要成像工具是核磁共振波譜；介觀聯(lián)接圖譜（Mesoscopic connectome），其分辨率在微米級(jí)至亞微米級(jí)，研究不同類型神經(jīng)元之間的聯(lián)接，主要成像工具是光學(xué)顯微鏡；微觀聯(lián)接圖譜（Microscopic connectome），其分辨率在納米級(jí)，在突觸水平上對(duì)神經(jīng)元之間的聯(lián)接進(jìn)行研究，主要成像工具是電子顯微鏡.成像速度和成像體量會(huì)直接影響獲取全腦神經(jīng)聯(lián)接圖譜的時(shí)間［14］，圖1［15］對(duì)生物成像技術(shù)的空間和時(shí)間分辨率進(jìn)行了比較.核磁共振成像、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡在成像速度、成像體量及分辨率上各有優(yōu)勢(shì)，下面著重介紹它們?cè)谀X成像領(lǐng)域及聯(lián)接圖譜中的應(yīng)用.

Fig.1 Comparison of the spatial and temporal resolutions of biological imaging techniques[15]

1.1 核磁共振成像

核磁共振成像是一種斷層成像技術(shù)，MRI的成像信號(hào)來(lái)源于樣品本身，無(wú)需注射放射性同位素，這使得MRI具有高安全性，可廣泛用于醫(yī)學(xué)成像.在神經(jīng)系統(tǒng)病變、心血管系統(tǒng)病變、軟組織病變等方面MRI具有良好的成像效果，臨床上已應(yīng)用于腦腫瘤、腦梗塞等疾病的檢查.研究者通過MRI可對(duì)不同腦灰質(zhì)區(qū)域之間的宏觀聯(lián)接進(jìn)行研究，也可對(duì)大腦模型進(jìn)行探索.

MRI對(duì)鐵含量具有高敏感性，Brammerloh等［16］通過核磁共振弛豫法測(cè)定了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中的鐵含量，并由此測(cè)量出黑質(zhì)黑體的神經(jīng)元密度，為早期檢測(cè)帕金森綜合癥中多巴胺能神經(jīng)元缺失的生物標(biāo)志物的開發(fā)提供了研究方向.鐵信號(hào)的變化不僅會(huì)影響帕金森綜合癥的發(fā)病，在非典型帕金森綜合癥中也有鐵信號(hào)的變化，主要體現(xiàn)在進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）和多發(fā)性系統(tǒng)萎縮（MSA）上［17］.MRI可無(wú)創(chuàng)可視化大腦結(jié)構(gòu)，但缺少細(xì)胞特異性和功能信息.Aswendt等［18］開發(fā)了一種新型順磁造影劑，響應(yīng)僅由抑制性γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元表達(dá)的谷氨酸脫羧酶活性，從而可選擇性檢測(cè)GABA能神經(jīng)元.

MRI安全性高，適用于活體成像，并由于其較快的成像速度，可用于獲取和分析不同人群的大腦差異.Basaia等［19］對(duì)肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）、原發(fā)性側(cè)索硬化癥（PLS）、進(jìn)行性肌肉萎縮（PMA）和健康對(duì)照在內(nèi)的173例人群進(jìn)行了腦部MRI掃描評(píng)估.結(jié)合圖形分析和聯(lián)接組學(xué)，他們?cè)u(píng)估了全局拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)特性、區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能性腦聯(lián)接，發(fā)現(xiàn)了在ALS患者和PLS患者中結(jié)構(gòu)連通性降低，這種結(jié)構(gòu)聯(lián)接改變可能與運(yùn)動(dòng)障礙相關(guān).MRI可用于大腦模型預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)獲取，Agosta等［20］通過對(duì)200名運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。∕ND）患者進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查、認(rèn)知評(píng)估以及腦部MRI信號(hào)的檢測(cè)，建立了Royston-Parmar這一運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的生存預(yù)測(cè)模型.如果將神經(jīng)元視為節(jié)點(diǎn)，神經(jīng)元之間的軸突視為邊緣，在大腦網(wǎng)絡(luò)中會(huì)出現(xiàn)高邊緣數(shù)及密集互聯(lián)的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)被稱為富人俱樂部（Rich club），Bertolero等［21］通過分析線蟲結(jié)構(gòu)和功能網(wǎng)絡(luò)、獼猴結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和人腦功能網(wǎng)絡(luò)，提出了邊緣在不同網(wǎng)絡(luò)分布不同的多樣性俱樂部（Diverse club），發(fā)現(xiàn)了Diverse club對(duì)于綜合網(wǎng)絡(luò)整合的重要性，其中人腦數(shù)據(jù)的獲取通過fMRI（functional MRI）實(shí)現(xiàn).

MRI的分辨率通常在毫米級(jí)，分辨率的限制使得MRI更適用于宏觀尺度下不同腦區(qū)之間聯(lián)接圖譜的繪制.2013年，加拿大和德國(guó)的研究人員［22］將人腦切成7400片，將切片染色并進(jìn)行核磁共振成像和數(shù)字化處理，最終生成高清模型呈現(xiàn)出大腦的皮層、腦灰質(zhì)和白質(zhì)等大體結(jié)構(gòu)［圖2（A）和（B）］.2022年劍橋大學(xué)的Bethlehem和賓夕法尼亞大學(xué)的Seidlitz等［23］對(duì)不同年齡人群的MRI數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制了首個(gè)涵蓋各年齡段（從受孕后115 d到100歲）的人腦圖譜，通過基于位置、尺度、形狀的廣義加法（Generalized additive model for location scale and shape，GAMLSS）模型等方法，對(duì)大腦中的特征變化與年齡相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了腦生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，并發(fā)現(xiàn)了阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等疾病患者腦區(qū)結(jié)構(gòu)與正常人群的差異.這些研究成果證實(shí)了腦聯(lián)接圖譜對(duì)于腦疾病治療診斷的重要意義.

Fig.2 Three-dimensional reconstruction of neurons

1.2 光學(xué)成像方法

當(dāng)代神經(jīng)科學(xué)的開端與發(fā)展離不開光學(xué)成像方法，Golgi和Cajal在一個(gè)多世紀(jì)前通過光學(xué)顯微鏡觀察到染色的神經(jīng)細(xì)胞，展現(xiàn)了神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)圖像.隨著光學(xué)成像設(shè)備和染色標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，光學(xué)成像方法依舊是腦成像領(lǐng)域不可或缺的方法.光學(xué)成像方法具有較廣的記錄范圍和較高的時(shí)空分辨率，并可結(jié)合多種特異性染色標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能成像.由于阿貝極限的限制，光學(xué)成像方法的分辨率主要在亞微米尺度.光片照明熒光顯微鏡（Light-sheet fluorescence microscopy，LSFM）、雙光子顯微鏡（Two-photon microscopy，TPM）以及顯微光學(xué)切片斷層掃描成像系統(tǒng)（Micro-optical sectioning tomography，MOST）廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元成像.

1.2.1 光片照明熒光顯微鏡 LSFM的成像原理與點(diǎn)掃描技術(shù)（如共聚焦顯微鏡和TPM）不同，LSFM只激發(fā)一定厚度的組織塊，形成光學(xué)切片并對(duì)該切片成像，LSFM避免了長(zhǎng)時(shí)間的熒光激發(fā)帶來(lái)的光漂白現(xiàn)象，并擁有比點(diǎn)掃描成像技術(shù)更好的體積成像能力［24］.Doerr等［25］通過基于狂犬病毒（Rabies Virus，RV）的逆行追蹤結(jié)合LSFM，可視化移植細(xì)胞和連接的宿主神經(jīng)元，通過與MRI參考數(shù)據(jù)集的共配準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了宿主輸入神經(jīng)元的精確解剖分配.在細(xì)胞分辨率條件下，Tomer等［26］通過將景深擴(kuò)展與光學(xué)切片相結(jié)合，搭建了球面像差輔助擴(kuò)展景深（SPherical-aberration-assisted extended depth-of-field，SPED）光片顯微鏡，提升了其成像速度和體積視場(chǎng)，通過對(duì)透明化的小鼠大腦成像和對(duì)斑馬魚大腦進(jìn)行Ca2+成像，展現(xiàn)了SPED光片顯微鏡的高速細(xì)胞分辨率體積圖譜的獲取能力.

高成像深度可避免頻繁的組織切片及機(jī)械應(yīng)力對(duì)組織帶來(lái)的損傷，但由于光散射，活體動(dòng)物的非侵入性深部組織的三維光學(xué)成像具有挑戰(zhàn)性.Wang等［27］開發(fā)了一種近紅外Ⅱ區(qū)的光片顯微成像技術(shù)，在不進(jìn)行侵入性手術(shù)的前提下可將成像深度提升至750μm.在該技術(shù)基礎(chǔ)上，該課題組對(duì)完整的小鼠頭部進(jìn)行三維成像，并監(jiān)測(cè)到創(chuàng)傷性腦組織損傷部位的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的募集情況.成像通量會(huì)影響到獲取三維成像數(shù)據(jù)的速度.Fang等［28］將大視場(chǎng)貝塞爾光片顯微技術(shù)與三維壓縮感知算法相結(jié)合，對(duì)腦組織進(jìn)行三維高通量各向同性成像.該技術(shù)可對(duì)經(jīng)過快速透明化的腦組織進(jìn)行1～5μm厚度的光學(xué)層析激發(fā)，并在10 min內(nèi)獲取了小鼠大腦的三維數(shù)據(jù)集.

對(duì)腦組織進(jìn)行LSFM成像通常需要透明化技術(shù)的支持，德國(guó)組織醫(yī)學(xué)和再生研究所的Zhao等［29］通過開發(fā)由小膠束介導(dǎo)的人體器官高效清除與標(biāo)記（Small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling，SHANEL）方法對(duì)完整人體器官進(jìn)行透明，實(shí)現(xiàn)厘米尺度人體器官的三維（3D）組織學(xué)研究.該工作首次透明了完整人全腦，并通過改良的LSFM獲取了直徑約3 cm的完整清晰的人眼鑲嵌圖像，三維重建了鞏膜、虹膜和懸韌帶等解剖結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，為完整人腦3D組織學(xué)研究提供了基礎(chǔ).光片顯微鏡結(jié)合組織透明技術(shù)、神經(jīng)元標(biāo)記技術(shù)可在腦組織三維成像中扮演重要的角色.

1.2.2 雙光子顯微鏡 TPM是一種用于非侵入式或低侵入式的活體生物樣品成像的熒光顯微鏡，可提供生物樣品的結(jié)構(gòu)和功能信息.由于非侵入性的成像方式、較小的光毒性、較深的成像深度和良好的空間分辨率等優(yōu)點(diǎn)，雙光子顯微鏡成為了生物活體腦成像中不可或缺的工具.傳統(tǒng)TPM的活體成像深度在500μm左右，Wang等［30］報(bào)道了一種通過近紅外Ⅱ區(qū)激光激發(fā)具有近紅外Ⅰ區(qū)熒光發(fā)射的共軛聚合物聚四｛［（4，4，9，9-四（4-辛氧基苯基）-4，9-二氫-s-苯并二茚并［1，2-b：5，6-b′］二噻吩）］-替代-合-［4，7-二（2-噻吩基）-2，1，3-苯并噻二唑］｝（PIDTDBT），以此實(shí)現(xiàn)具有更高活體成像深度的TPM成像方法.結(jié)果表明，通過1200 nm的激發(fā)光可獲得最大成像深度1010μm的小鼠大腦血管三維結(jié)構(gòu)圖.在亞細(xì)胞分辨率上，Chen等［31］改良了TPM的成像系統(tǒng)，通過對(duì)自適應(yīng)光學(xué)（AO）TPM系統(tǒng)的優(yōu)化和波前傳感算法的改進(jìn)，將小鼠腦活體成像深度擴(kuò)展到了腦下700μm，實(shí)現(xiàn)了對(duì)第5層錐體神經(jīng)元的亞細(xì)胞分辨率經(jīng)顱成像.在該課題組之前的工作中，通過植入自聚焦（GRIN）透鏡結(jié)合AO技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠海馬CA1（Cornu ammonis）區(qū)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)成像，并可分辨樹突棘等精細(xì)結(jié)構(gòu)［32］，為高分辨在體光學(xué)深腦成像提供了新成像方法.

為了擴(kuò)大TPM的成像視野，Zong等［33］開發(fā)了快速高分辨微型雙光子顯微鏡（Fast high-resolution，miniaturized two-photon microscope，F(xiàn)HIRM-TPM 2.0），可用于大視場(chǎng)、多平面和長(zhǎng)期腦成像.FHIRMTPM 2.0相較于上一代系統(tǒng)，成像視場(chǎng)擴(kuò)大了7.8倍，可在420μm×420μm×180μm的體積上實(shí)現(xiàn)軸向分辨率1μm的多平面成像，并將微型物鏡的工作距離提升到1 mm.對(duì)自由運(yùn)動(dòng)小鼠頭部的長(zhǎng)時(shí)間成像具有較大挑戰(zhàn)，F(xiàn)HIRM-TPM 2.0穩(wěn)定性高，可在數(shù)周時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè)同一腦區(qū)的神經(jīng)元活動(dòng)，對(duì)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)行為與神經(jīng)元活動(dòng)之間的研究提供成像方法.

長(zhǎng)距離投射神經(jīng)元的形態(tài)重建對(duì)研究大腦信息交流具有重要意義，TPM較高的成像深度和高分辨率，使得TPM可用于全腦范圍內(nèi)的投射神經(jīng)元成像.2019年，美國(guó)霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所珍妮亞研究中心的Winnubst等［34］通過腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）標(biāo)記了小鼠大腦中的少數(shù)投射神經(jīng)元，通過改良的連續(xù)雙光子斷層掃描成像系統(tǒng)以亞微米分辨率對(duì)小鼠全腦進(jìn)行成像，重建了運(yùn)動(dòng)皮層、丘腦等腦區(qū)的1000多個(gè)投射神經(jīng)元，建立了當(dāng)時(shí)最大的亞微米分辨投射神經(jīng)元數(shù)據(jù)集.該研究對(duì)腦聯(lián)接圖譜的構(gòu)建具有重要意義.

1.2.3 顯微光學(xué)切片斷層掃描成像系統(tǒng) MOST是近些年發(fā)展的新成像技術(shù)，Li等［35］于2010年首次發(fā)表了這一工作.MOST采用延時(shí)積分電荷耦合器件（Charge coupled device，CCD），切片與成像同時(shí)進(jìn)行，在縮短數(shù)據(jù)獲取時(shí)間的同時(shí)降低了圖像配準(zhǔn)的難度.該課題組通過MOST兩百多小時(shí)的不間斷掃描，獲得了小鼠全腦的冠狀切面圖像［圖2（C）～（F）］，體素尺寸0.33μm×0.33μm×1μm.在該課題組后續(xù)的工作中，將熒光光路引入MOST中搭建出了fMOST（fluorescence MOST）對(duì)神經(jīng)元熒光成像［36］以及HD-fMOST（High-Definition fMOST）以提高樣品成像中的信噪比［37］.針對(duì)MOST數(shù)據(jù)集的分析，該課題組開發(fā)了NeuroGPS和NeuroGPS-Tree軟件可對(duì)胞體進(jìn)行定位和對(duì)密集染色的神經(jīng)元進(jìn)行自動(dòng)分割［38，39］.改良的FNT（Fast neurit tracer）軟件可對(duì)MOST數(shù)據(jù)集進(jìn)行三維追蹤與分析，提升了MOST數(shù)據(jù)集的分析速度［40］.

通過MOST可在數(shù)天內(nèi)獲取小鼠全腦數(shù)據(jù)集.Zhang等［41］通過MOST獲取了AD轉(zhuǎn)基因小鼠的全腦亞微米分辨血管圖譜，通過對(duì)AD模型小鼠和野生型小鼠海馬中血管直徑及分支角度的測(cè)量分析，發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠海馬中的血管損傷，尤其體現(xiàn)在海馬齒狀回.Wang等［42］報(bào)道了一種化學(xué)層析結(jié)合fMOST的成像技術(shù)，成像前只激發(fā)亞微米厚度的頂層腦組織以降低背景干擾，從而實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞分辨率下的全腦高通量多色成像.Sun等［43］通過AAV病毒示蹤結(jié)合fMOST對(duì)AD模型小鼠全腦成像，解析了內(nèi)側(cè)前額葉皮層腦外投射神經(jīng)元形態(tài)及輸入/輸出聯(lián)接，揭示了小鼠物體識(shí)別記憶缺陷中內(nèi)側(cè)前額葉皮層環(huán)路機(jī)制.MOST不僅適用于小鼠全腦成像，對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物獼猴同樣適用.Zhou等［44］通過病毒標(biāo)記結(jié)合fMOST對(duì)獼猴全腦進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率成像，體素尺寸0.65μm×0.65μm×3μm，實(shí)現(xiàn)了獼猴腦的三維自動(dòng)數(shù)據(jù)采集.在此基礎(chǔ)上該課題組發(fā)現(xiàn)獼猴腦中前額葉皮層的神經(jīng)元可同時(shí)靶向視覺皮層、紋狀體、丘腦和中腦多個(gè)腦區(qū).

MOST為投射神經(jīng)元重建和神經(jīng)元分型提供了成像手段.2021年，Peng等［45］通過稀疏標(biāo)記和fMOST重建了小鼠大腦丘腦、紋狀體等腦區(qū)中的1741個(gè)神經(jīng)元，結(jié)合不同形狀特征和基因表達(dá)特征確定了11種投射神經(jīng)元類型.同年，Mu?oz-Casta?eda等［46］通過遺傳和病毒標(biāo)記結(jié)合fMOST構(gòu)建了小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層，上肢區(qū)域（MOp-ul）的3D結(jié)構(gòu)圖譜，并由此確定了24種投射神經(jīng)元類型.2022年，Gao等［40］率先構(gòu)建了小鼠前額葉皮層6357個(gè)單神經(jīng)元的全腦投射圖譜，建立了最大的小鼠全腦介觀神經(jīng)聯(lián)接圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并確定了64種投射神經(jīng)元亞型.該工作發(fā)現(xiàn)了前額葉皮層內(nèi)部的3個(gè)功能相關(guān)模塊和其內(nèi)部聯(lián)接以及神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組亞型與投射組亞型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并提出前額葉皮層可能的工作模型.MOST的快速成像速度和高分辨率使其廣泛地應(yīng)用于全腦成像及圖譜構(gòu)建.

由于高分辨率和熒光成像，通過光學(xué)成像方法可獲得高襯度的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)圖像，此外光學(xué)成像方法也是活體高分辨成像的重要技術(shù)手段.近些年發(fā)展的連續(xù)掃描成像方法使得光學(xué)成像方法在全腦數(shù)據(jù)獲取中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為介觀聯(lián)接圖譜構(gòu)建提供了技術(shù)手段.

1.3 電子顯微鏡

高分辨率EM是目前唯一可全面解析單個(gè)突觸聯(lián)接的神經(jīng)元成像方法，可提供納米分辨率識(shí)別突觸結(jié)構(gòu)［47］.由于EM的成像原理，利用EM成像需要對(duì)腦組織進(jìn)行超薄切片，這使得通過EM獲取模式動(dòng)物的全腦數(shù)據(jù)集成為巨大挑戰(zhàn).1986年White等［48］通過EM成像完成了線蟲的第一張大腦全連線圖，盡管線蟲僅擁有302個(gè)神經(jīng)元，但這項(xiàng)工作通過手繪神經(jīng)元耗費(fèi)15年才完成.

近些年發(fā)展的連續(xù)切片電子顯微鏡（serial-section electron microscopy，ssEM）提升了模式動(dòng)物大腦數(shù)據(jù)集的獲取速度.Bock等［8，49］通過ssEM分別對(duì)小鼠皮質(zhì)區(qū)的部分神經(jīng)元和成年黑腹果蠅完整大腦做了三維重建［圖2（G）和（H）］；Hildebrand等［50］通過ssEM對(duì)斑馬魚幼蟲的全腦進(jìn)行了三維重建分析；Cook等［6］通過ssEM重建了秀麗隱桿線蟲的全腦神經(jīng)聯(lián)接圖譜.2021年Allen大腦研究所［51］公布了小鼠視覺新皮層中20萬(wàn)個(gè)腦細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)和聯(lián)接的數(shù)據(jù)集，這些研究成果證明EM在獲取模式動(dòng)物大腦納米分辨率數(shù)據(jù)集方面強(qiáng)大的能力.2021年哈佛和谷歌的研究團(tuán)隊(duì)［52］以4 nm分辨率對(duì)人類大腦皮層進(jìn)行了約5000片30 nm厚度切片的連續(xù)掃描，繪制出了“百萬(wàn)分之一”人腦神經(jīng)3D聯(lián)接圖譜.從數(shù)據(jù)集中該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了不同的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，如軸突卷曲且互相盤旋的神經(jīng)元以及擁有兩個(gè)軸突的神經(jīng)元，這說(shuō)明獲取3D聯(lián)接圖譜對(duì)解析人腦結(jié)構(gòu)具有重要意義.

EM數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量龐大，以上述人腦數(shù)據(jù)集為例，針頭大小組織塊的數(shù)據(jù)量達(dá)到了1.4 PB.并且由于形狀的不規(guī)則性，從EM數(shù)據(jù)集中識(shí)別提取特征結(jié)構(gòu)具有挑戰(zhàn).雖然發(fā)展了EM數(shù)據(jù)集的神經(jīng)元自動(dòng)分割方法以加快神經(jīng)元追蹤的速度［53］，但突觸結(jié)構(gòu)的重建仍然靠人工操作，這增加了通過EM獲取納米分辨率圖譜的時(shí)間.Buhmann等［47］通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法開發(fā)了CIRCUITMAP，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)果蠅全腦EM數(shù)據(jù)集中突觸聯(lián)接的自動(dòng)識(shí)別，特別是果蠅大腦中典型的一對(duì)多突觸結(jié)構(gòu).該工作對(duì)EM數(shù)據(jù)集的自動(dòng)處理提供了新方法，突破了此前繪制果蠅大腦聯(lián)接組的瓶頸.EM在納米分辨率聯(lián)接組圖譜的繪制中起到不可或缺的作用，是探索模式動(dòng)物乃至人腦全聯(lián)接圖譜的重要成像手段.

2 同步輻射X射線成像的基本情況

接近光速（v≈c）的帶電粒子在電磁場(chǎng)中沿曲線軌道運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)在帶電粒子運(yùn)動(dòng)的切線方向發(fā)出電磁輻射，由于它最初在同步加速器上發(fā)現(xiàn)，故稱之為“同步輻射”.同步輻射光源發(fā)展至今已有四代裝置問世［圖3（A）］［54］：第一代同步輻射光源依托于高能物理研究的加速器；第二代同步輻射光源是專門為同步輻射應(yīng)用而設(shè)計(jì)的光源；第三代同步輻射光源相對(duì)于第二代光源亮度提高了100倍，這使得依托同步輻射光源進(jìn)行時(shí)間分辨和空間分辨的研究成為可能；第四代同步輻射光源為自由電子激光器，目前中國(guó)也已在多地興建第四代同步輻射光源.同步輻射光的波長(zhǎng)覆蓋了從遠(yuǎn)紅外到X射線波段的連續(xù)光譜，并且其高亮度、高準(zhǔn)直性、高偏振等性質(zhì)是傳統(tǒng)光源無(wú)法比擬的.此外，同步輻射光源的潔凈、能量可調(diào)性和窄脈沖等，也是其作為科學(xué)研究一大利器的主要原因.同步輻射光源誕生至今，已在物理學(xué)、化學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)和地質(zhì)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮出了重大的作用［55～57］.

Fig.3 Different imaging methods based on synchrotron radiation

2.1 同步輻射成像方法

同步輻射光源由于其較長(zhǎng)的波段，衍生出了一系列的掃描分析方法，如同步輻射紅外光譜、磁圓二色譜、同步輻射X射線成像相關(guān)技術(shù)等［圖3（B）］［54］.同步輻射X射線具有豐富的輻射-物質(zhì)相互作用，包括吸收、衍射、散射、熒光等相互作用.基于這些相互作用，開發(fā)了一系列的實(shí)驗(yàn)方法：X射線吸收成像（X-ray absorption imaging）［圖3（C）］［58］、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、廣角X射線散射（Wide angle X-ray scattering，WAXS）、小角X射線散射（Small angle X-ray scattering，SAXS）、X射線相襯成像（X-ray phase-contrast imaging，X-PCI）和X射線熒光（X-ray fluorescence，XRF）等成像方法.X射線吸收成像、X射線相襯成像（X-PCI）和X射線熒光成像等方法，由于其獨(dú)特的性質(zhì)，在腦科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用.

隨著成像技術(shù)的發(fā)展，基于傅里葉光學(xué)的X射線衍射成像技術(shù)形成了X射線衍射成像（X-ray diffraction imaging，XDI）和相干X射線衍射成像（Coherent X-ray diffraction imaging，CXDI/CDI）等技術(shù)X射線衍射成像原理是X射線照射物體時(shí)，碰撞物體內(nèi)的原子或離子發(fā)生散射，增強(qiáng)了X射線某些方向上的相位，從而用于解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)［59］.CDI由Sayre首次提出［60］，與XDI不同的是相干X射線直接照射樣品，通過探測(cè)器接受樣品的遠(yuǎn)場(chǎng)衍射圖像，最后使用重構(gòu)算法計(jì)算樣品的吸收和相位信息，從而獲得樣品的結(jié)構(gòu)信息.由于其不依賴成像的光學(xué)器件，CDI有望突破更高的分辨率.在第四代同步輻射的基礎(chǔ)上，CDI可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨成像［61，62］.

鬼成像（Ghost imaging，GI）又被稱作量子關(guān)聯(lián)成像，也被稱作單像素相機(jī)成像.GI是一種間接成像方式，通過預(yù)先測(cè)定照射在物體上的光場(chǎng)分布以及透過物體的總光強(qiáng)之間的關(guān)聯(lián)來(lái)復(fù)原物體的圖像.由于其與傳統(tǒng)成像方式的不同，GI對(duì)探測(cè)器的要求低，降低了散粒噪聲對(duì)于測(cè)量的影響，并可實(shí)現(xiàn)超低輻射的X射線鬼成像（X-ray ghost imaging，XGI）.但由于X射線波長(zhǎng)短，衍射線的強(qiáng)度及分布受擾動(dòng)影響較大，故在同步輻射光源上，XGI有更大的發(fā)揮空間［63］.

2.2 同步輻射在腦科學(xué)功能研究中的應(yīng)用

發(fā)展神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)系統(tǒng)且詳細(xì)的描述，現(xiàn)如今有許多新方法以越來(lái)越高的分辨率用于測(cè)繪神經(jīng)組織，這些高分辨且大通量的數(shù)據(jù)測(cè)量將有可能徹底改變大腦的發(fā)育研究［64］.由于同步輻射光源的高亮度等性質(zhì)，基于同步輻射的各種成像方法具有高分辨率、高穿透深度、高探測(cè)靈敏度等優(yōu)勢(shì)，可用于腦科學(xué)研究.

模式動(dòng)物和人類大腦中的金屬元素和蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)影響大腦的結(jié)構(gòu)與功能，基于同步輻射的X射線成像方法可用于測(cè)量這些物質(zhì).腦組織樣品在經(jīng)過X射線照射后，內(nèi)層電子發(fā)生電離產(chǎn)生空缺，外層電子發(fā)生躍遷從而發(fā)出次級(jí)熒光X射線，產(chǎn)生的能量與元素種類相關(guān)，從而可以用于探測(cè)元素.XRF可用于探測(cè)神經(jīng)元內(nèi)部元素和化學(xué)分析，對(duì)闡明大腦相關(guān)機(jī)制具有重要作用.Bissardon等［65］提出了一種基于同步輻射的XRF成像方法，結(jié)合X射線熒光納米成像探針可以提供亞細(xì)胞水平上離子分布所需要的靈敏度和空間分辨率，闡明細(xì)胞器水平上整個(gè)細(xì)胞內(nèi)金屬的二維及三維分布和濃度.Domart等［66］將受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated emission-depletion microscopy，STED）和XRF結(jié)合起來(lái)，以40 nm的空間分辨率成像大鼠海馬神經(jīng)元中的銅、鋅和蛋白質(zhì)，揭示了鋅和微管蛋白在樹突中的納米級(jí)共定位以及銅和F-肌動(dòng)蛋白的共分離.由于鋅、銅參與神經(jīng)元的分化和突觸的可塑性，這一機(jī)制將有望為記憶形成提供實(shí)際證據(jù).

由于組織散射和吸收的影響，熒光成像中的成像深度受限，對(duì)腦組織進(jìn)行透明化可一定程度上提升成像深度.同步輻射XRF相比于傳統(tǒng)熒光成像手段，擁有更高的穿透深度和能量分辨率.Yan等［67］使用EB和免疫球蛋白G（lgG）設(shè)計(jì)了一種雙峰探針，對(duì)黑質(zhì)致密區(qū)（SNc）和腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)了通過同步輻射XRF識(shí)別特定的神經(jīng)元.Surowka等［68］將同步輻射X-PCI和XRF聯(lián)用，在觀測(cè)到黑質(zhì)（SN）神經(jīng)元的前提下，對(duì)神經(jīng)元內(nèi)部的元素與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)共定位成像，在化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)組織之間建立起了分析方法.

軟X射線由于其獨(dú)特的被吸收性質(zhì)，在測(cè)量生物樣品的軟X射線范圍（約0.1～1 keV）時(shí)，無(wú)需染色劑或者造影劑標(biāo)記.2018年，Everett等［69］通過同步輻射X射線掃描透射顯微鏡（Scanning transmission X-ray microscopy，STXM）對(duì)無(wú)標(biāo)記脫水人腦組織進(jìn)行了40 nm分辨率成像，可清晰分辨神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu).2020年，Brooks等［70］通過光學(xué)顯微鏡成像帕金森患者腦組織切片定位多巴胺能神經(jīng)元后，結(jié)合STXM對(duì)人腦神經(jīng)黑素進(jìn)行無(wú)標(biāo)記納米成像.在后續(xù)的工作中，該課題組對(duì)帕金森患者的人腦組織切片進(jìn)行成像，展示了帕金森氏病患者含神經(jīng)黑素神經(jīng)元鐵沉積物特征，該研究可能為治療帕金森氏病提供幫助［71］.

基于同步輻射的成像方法由于其高分辨率和高靈敏度適用于腦科學(xué)功能的研究.同步輻射XRF對(duì)于金屬元素具有較高的靈敏度，為了解帕金森等疾病的發(fā)病機(jī)理研究提供了技術(shù)手段［72］.同步輻射X射線技術(shù)還可對(duì)在體大鼠腦血管進(jìn)行成像，進(jìn)一步研究腦血管的結(jié)構(gòu)和功能改變［73］.如果將病毒包裝的質(zhì)粒小鼠特定腦區(qū)進(jìn)行表達(dá)后，利用不同金屬染料對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行特異性標(biāo)記，有望利用同步輻射X射線成像技術(shù)對(duì)功能性神經(jīng)環(huán)路成像.近些年發(fā)展的冷凍軟X射線斷層掃描（Cryo-SXT）成像技術(shù)和納米級(jí)蛋白質(zhì)定位的基因編碼X射線細(xì)胞成像等方法［74～78］也有望在腦科學(xué)功能研究中發(fā)揮重要的作用.

3 同步輻射在大腦結(jié)構(gòu)成像中的應(yīng)用

通過分析線蟲、果蠅、小鼠和人類的聯(lián)接組數(shù)據(jù)，研究者們?nèi)〉昧艘幌盗醒芯砍晒?，并在分析神?jīng)元聯(lián)接的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了調(diào)控模式動(dòng)物的部分行為［79］.神經(jīng)元全聯(lián)接圖譜需要納米分辨率成像技術(shù)的支持，目前EM在獲取納米分辨率大腦數(shù)據(jù)集中占據(jù)著主導(dǎo)地位.雖然EM擁有納米分辨率，但獲取較大模式動(dòng)物大腦的數(shù)據(jù)集仍是耗時(shí)的.神經(jīng)元的主要結(jié)構(gòu)（如胞體、樹突、軸突及樹突棘）都落在介觀尺度范圍內(nèi)，跨腦區(qū)投射神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的重建通常也需要對(duì)大腦完整成像，故介觀尺度全腦成像同樣重要.目前在介觀尺度下無(wú)損/低損成像全腦樣品仍存在挑戰(zhàn).

提高Z軸分辨率可獲得Z方向上更多的信息，光學(xué)成像方法通常是通過降低組織切片或光學(xué)切片的厚度來(lái)提高Z軸分辨率，但成像時(shí)間會(huì)成倍增加.由于采用光學(xué)切片，LSFM的Z軸分辨率很難降低至1 mm以下.基于同步輻射X射線的成像方法（如Micro-CT，X-PCI和XNH）擁有各向同性分辨率，Z軸分辨率可達(dá)0.3μm甚至數(shù)十納米.由于同步輻射光源的高亮度和硬X射線的高穿透性，此類成像方法成像深度高，可對(duì)立方毫米體積未經(jīng)透明化處理的腦組織塊三維成像.這降低了樣品的預(yù)處理時(shí)間，保留了組織完整性，并避免了頻繁的組織切片對(duì)腦組織帶來(lái)的損傷［58］.基于同步輻射的X射線成像方法的優(yōu)勢(shì)，使其適用于較大模式動(dòng)物腦組織成像，下面著重介紹X-PCI，XNH和Micro-CT這3種應(yīng)用于大腦結(jié)構(gòu)成像的成像方法.

3.1 X射線相襯成像

X-PCI利用軟組織樣品對(duì)X射線相位信息的響應(yīng)，獲得良好的X射線對(duì)比度，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記成像.無(wú)標(biāo)記成像可簡(jiǎn)化樣品的處理流程，縮短樣品的預(yù)處理時(shí)間.Fratini等［80］通過同步輻射X-PCI，在無(wú)造影劑和切片的前提下，對(duì)小鼠脊髓血管和神經(jīng)元系統(tǒng)進(jìn)行亞微米分辨三維分布成像［圖4（A）］，解決了血管與神經(jīng)元系統(tǒng)之間的糾纏關(guān)系問題.對(duì)于更大的模式動(dòng)物大鼠，X-PCI同樣適用，Hu等［81］對(duì)大鼠脊髓血管和神經(jīng)元系統(tǒng)進(jìn)行三維無(wú)損成像，同樣無(wú)染色劑和造影劑的支持.這證明同步輻射X-PCI是一種優(yōu)秀的同時(shí)成像血管和神經(jīng)元系統(tǒng)的成像方法.

Fig.4 Imaging of model animal soft tissues by X-PCI

同步輻射X-PCI可成像腦神經(jīng)元并擁有高穿透深度.Koh等［82］通過同步輻射X-PCI對(duì)帕金森患者腦組織中路易小體（Lewy body）的顯微細(xì)節(jié)進(jìn)行成像，結(jié)果表明，在對(duì)不經(jīng)過染色處理的3 mm厚組織塊進(jìn)行成像時(shí)仍可清晰分辨3個(gè)殘留的路易小體.Rodgers等［83，84］通過X-PCI對(duì)福爾馬林固定和石蠟包埋的小鼠大腦進(jìn)行了虛擬組織學(xué)研究，量化了組織固定和包埋過程中的形態(tài)變化.神經(jīng)探針是神經(jīng)科學(xué)研究的重要工具，但由于宿主與探針之間的相互作用，植入性的微型設(shè)備可能在時(shí)間推移下出現(xiàn)功能不穩(wěn)定和造成組織損傷的情況.B?hm等［85］通過X-PCI對(duì)神經(jīng)探針植入?yún)^(qū)域進(jìn)行無(wú)標(biāo)記成像，成像結(jié)果仍可區(qū)分細(xì)胞、血管及探針［圖4（B）和（C）］，基于此，該課題組發(fā)現(xiàn)了探針植入對(duì)組織帶來(lái)的損傷.通過X-PCI獲取的圖像數(shù)據(jù)存在條狀或環(huán)狀偽影的情況，這會(huì)影響提取關(guān)鍵信息的效率和難度，Croton等［86］發(fā)展了一種在不需要對(duì)樣品有先驗(yàn)信息的情況下有效的環(huán)狀偽影校正方法，采用雙材料相位檢索算法增強(qiáng)圖像對(duì)比度，基于此，對(duì)新西蘭白兔的頭部進(jìn)行成像，降低了偽影對(duì)數(shù)據(jù)處理帶來(lái)的影響.

X-PCI適用于人腦的細(xì)胞分辨率研究.Bikis等［87］通過傳統(tǒng)基于同步輻射的X射線斷層掃描和基于同步輻射的X射線雙光柵干涉測(cè)量法對(duì)石蠟包埋的人腦組織進(jìn)行成像，對(duì)對(duì)比度噪聲比（CNR）等指標(biāo)進(jìn)行了定量比較，并討論了石蠟包埋下相位襯度和吸收襯度的相對(duì)優(yōu)點(diǎn).T?pperwien等［88］通過優(yōu)化光學(xué)結(jié)構(gòu)的X-PCI對(duì)石蠟包埋的無(wú)標(biāo)記人小腦進(jìn)行3D成像，結(jié)合Hough變換和區(qū)域生長(zhǎng)算法，成功識(shí)別了分子層和顆粒層細(xì)胞并從中提取出浦肯野細(xì)胞［圖4（D）］，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算出分子層和顆粒層細(xì)胞的密度.結(jié)果表明，顆粒層的細(xì)胞具有很強(qiáng)的短程有序性和局部聚集性，通過對(duì)神經(jīng)元“Packing”量化，解釋了人類小腦如何在10%的體積下容納人腦總神經(jīng)元的80%.

同步輻射X-PCI適用于胞體和浦肯野細(xì)胞等的三維成像以及腦中的胞體分布研究.通過X-PCI成像無(wú)需對(duì)樣品染色，最大化保留了組織的完整性，避免了頻繁的組織切片對(duì)樣品帶來(lái)的損傷.

3.2 X射線納米全息層析成像

XNH是一種同步輻射高分辨X射線成像技術(shù)，它結(jié)合了全息和層析重建，原理類似X射線斷層掃描，但XNH技術(shù)根據(jù)樣品引起光束細(xì)微相移的變化來(lái)獲取圖像［89，90］.XNH以其高分辨率、高穿透深度和快成像速度彌補(bǔ)了光鏡和電鏡之間的空白，是大尺寸腦組織高分辨成像的重要技術(shù)手段［91］.

XNH能獲得神經(jīng)元亞細(xì)胞分辨率結(jié)構(gòu)信息.Khimchenko等［92］通過XNH對(duì)人小腦和皮層樣品進(jìn)行無(wú)標(biāo)記成像，并與蘇木精和伊紅染色的組織切片進(jìn)行比較［圖5（A）和（B）］.結(jié)果顯示，XNH可在更高分辨率下獲得亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如核膜和核孔）的信息，且XNH具有更好的在單細(xì)胞核仁水平上快速層析成像的能力［圖5（C）］.XNH具有高穿透深度和高各向同性分辨率.通過對(duì)立方毫米體積的人腦樣品成像，各向同性體素分辨率25 nm，空間分辨率88 nm，可清晰觀察到浦肯野細(xì)胞和錐體細(xì)胞等的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu).該課題組還通過對(duì)福爾馬林固定和石蠟包埋的人腦組織進(jìn)行XNH成像，各向同性體素分辨率為50 nm，并通過發(fā)展半自動(dòng)分割方法，成功將浦肯野細(xì)胞的亞核結(jié)構(gòu)等分割出來(lái)［93］.

Fig.5 Imaging of model animal soft tissues by XNH[92]

大腦中存在跨腦區(qū)投射的神經(jīng)元，保留組織的完整性和快速成像有利于對(duì)投射神經(jīng)元等的追蹤.XNH成像速度快，可在12 h以50 nm的各向同性分辨率成像果蠅整腦［92］，且XNH具有較大的視場(chǎng)/分辨率比，適用于追蹤較長(zhǎng)神經(jīng)元.2020年哈佛大學(xué)的Kuan等［94］通過多次XNH掃描，結(jié)合Mosaic成像策略追蹤了果蠅肌肉到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單根運(yùn)動(dòng)軸突.通過訓(xùn)練卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從數(shù)據(jù)中快速分割出神經(jīng)元，果蠅和小鼠神經(jīng)元以87 nm的空間分辨率被密集重建，通過和EM的聯(lián)用數(shù)百個(gè)皮質(zhì)區(qū)錐體細(xì)胞在納米分辨率上被重建出來(lái).

綜上所述，XNH以其高分辨率、無(wú)須標(biāo)記和快速成像能力在腦組織精細(xì)成像中起到了重要作用.

3.3 微米X射線斷層掃描

Micro-CT基于硬X射線吸收成像.近幾十年來(lái)X射線吸收成像在原子尺度下廣泛應(yīng)用于研究非均相催化劑結(jié)構(gòu)和組成、揭示活性位點(diǎn)的性質(zhì)、建立催化劑結(jié)構(gòu)基序、局部電子結(jié)構(gòu)和催化性質(zhì)之間聯(lián)系［95，96］.由于硬X射線不能被碳、氫、氧、氮這一類低原子序數(shù)元素強(qiáng)吸收，導(dǎo)致軟組織產(chǎn)生的對(duì)比度較低，故在通過硬X射線吸收成像對(duì)生物組織成像時(shí)，通常需要染色技術(shù)或增強(qiáng)對(duì)比技術(shù)的支持.

鋨酸染色和碘造影劑常被用于增強(qiáng)血管成像的對(duì)比度.Zhang等［97］在2014年對(duì)此前通過同步輻射Micro-CT對(duì)動(dòng)物大腦微血管成像的研究成果進(jìn)行了綜述，展現(xiàn)了Micro-CT成像血管的能力.Seo等［98］通過鋨酸和醋酸鈾染色結(jié)合Micro-CT對(duì)斑馬魚進(jìn)行三維成像，通過比較高膽固醇血癥斑馬魚模型與正常斑馬魚的全身三維形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥斑馬魚血管周圍脂肪、皮下脂肪及小腸和肝臟中的脂質(zhì)積累，這將有助于了解循環(huán)血管高脂血癥疾病的發(fā)病機(jī)制.Micro-CT作為一種微米及亞微米快速成像方法，可作為納米分辨率EM和毫米分辨率MRI之間的補(bǔ)充.Foxley等［99］通過將MRI，Micro-CT和EM聯(lián)用，對(duì)醛固定和鋨酸染色的小鼠大腦5個(gè)空間分辨率的成像，這種多尺度成像有助于快速定位目標(biāo)區(qū)域，以更高的分辨率對(duì)該區(qū)域精細(xì)成像.

碘造影劑相比于鋨酸染色毒性更小，Metscher等［100］開發(fā)了一種以無(wú)機(jī)碘和磷鎢酸為基礎(chǔ)的染色劑，在簡(jiǎn)化處理流程的基礎(chǔ)上擁有更高的X射線成像整體對(duì)比度和組織差異對(duì)比度.該課題組通過Micro-CT對(duì)模式動(dòng)物進(jìn)行三維X射線成像，成功從成像數(shù)據(jù)集中分辨出單個(gè)肌肉纖維和單個(gè)血細(xì)胞.通過碘造影劑提高組織度通常是不可逆的，Strotton等［101］開發(fā)了一種可逆碘染色技術(shù)，對(duì)石蠟包埋的直徑3.5 mm大鼠脊髓進(jìn)行了快速（12 min）高分辨（3.2～4.8μm）Micro-CT三維成像，通過淺層學(xué)習(xí)機(jī)器可以從Micro-CT數(shù)據(jù)集中將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等宏微觀特征提取出來(lái).

Mazzarello等［102］對(duì)Golgi發(fā)現(xiàn)高爾基染色法的歷史進(jìn)行了回顧，高爾基染色法可染色神經(jīng)元的胞體、軸突、樹突和樹突棘結(jié)構(gòu).硬X射線會(huì)被高原子序數(shù)元素吸收，由于高爾基染色液中含有汞、鉻等元素，通過高爾基染色的神經(jīng)元在Micro-CT上有良好的對(duì)比度.Kim等［103］通過高爾基染色結(jié)合同步輻射Micro-CT觀測(cè)到了浦肯野細(xì)胞［圖6（A）］并分辨了樹突的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠皮層發(fā)育障礙模型中浦肯野細(xì)胞的三維分形維數(shù)有明顯減少，樹突的復(fù)雜度明顯降低，該研究可能會(huì)對(duì)無(wú)腦回畸形和各種神經(jīng)發(fā)育障礙的病因和進(jìn)一步的潛在治療方案提供見解.Fonseca等［104］在巴西同步輻射光源上對(duì)高爾基染色的小鼠腦海馬神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元等進(jìn)行成像［圖6（B）］，并從數(shù)據(jù)集中自動(dòng)提取出神經(jīng)元結(jié)構(gòu)［圖6（C）～（E）］.他們通過將基于匹羅卡品誘發(fā)的癲癇小鼠與正常小鼠對(duì)照，發(fā)現(xiàn)癲癇小鼠額葉和海馬區(qū)胞體數(shù)量明顯降低.高爾基染色的腦組織會(huì)產(chǎn)生部分偽影，一定程度上會(huì)影響神經(jīng)元識(shí)別.Jiang等［105］優(yōu)化了高爾基染色方法，降低了高爾基染色方法產(chǎn)生偽影的數(shù)量，提高了被染色的神經(jīng)元同周圍組織的對(duì)比度，基于此，結(jié)合Micro-CT對(duì)小鼠的脊髓神經(jīng)元進(jìn)行成像并從數(shù)據(jù)集中提取出單運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元.

同步輻射Micro-CT的三維成像速度是目前最快的，可達(dá)到1 mm3/min［12］.2020年Chin等［106］報(bào)道了一種“AXON”（Accelerated X-ray Observation of Neurons）成像策略，可在幾分鐘內(nèi)對(duì)果蠅大腦進(jìn)行各向同性分辨率0.3μm的投影圖拍攝，并在實(shí)際測(cè)試中幾天內(nèi)繪制了果蠅的全腦神經(jīng)聯(lián)接的X射線成像圖譜.Micro-CT的成像深度高，可穿透2 mm厚度的高爾基染色鼠腦樣品.該課題組通過硬X射線CT結(jié)合高爾基染色方法對(duì)果蠅全身［圖6（F）］和小鼠全腦進(jìn)行成像，并可清晰分辨神經(jīng)元的軸突與樹突結(jié)構(gòu).數(shù)據(jù)結(jié)果表明通過Micro-CT可在10 d內(nèi)獲取小鼠大腦的數(shù)據(jù)集，并從多角度分析了通過同步輻射X射線CT繪制多尺度聯(lián)接圖譜的可行性［58，107，108］.同步輻射硬X射線同樣可對(duì)高爾基染色小鼠神經(jīng)元的軸突和樹突棘進(jìn)行高精度成像，Wu等［107］在臺(tái)灣光源上實(shí)現(xiàn)了20 nm分辨率的軸突和樹突棘成像.

通過Micro-CT對(duì)模式動(dòng)物腦神經(jīng)元的胞體、軸突和樹突成像已取得了一系列的成果，由于Micro-CT極快的成像速度、高成像深度和神經(jīng)元染色技術(shù)帶來(lái)的神經(jīng)元對(duì)比度提升，利用Micro-CT繪制介觀尺度下大腦神經(jīng)聯(lián)接圖譜具有很高的可行性.

Micro-CT，X-PCI和XNH相比較于光學(xué)成像方法及EM擁有以下優(yōu)勢(shì)：（1）X射線成像擁有各向同性分辨率，在Z軸上具有更高的分辨率，突破了LSFM等Z軸分辨率的限制.光學(xué)成像方法提高Z軸分辨率的方式通常是減少切片或光學(xué)切片的厚度，但數(shù)據(jù)獲取時(shí)間大幅增加.Micro-CT的各向同性分辨率可達(dá)到0.3μm，XNH的分辨率可達(dá)到20 nm，允許在Z軸上獲得更多的結(jié)構(gòu)信息；（2）X射線成像樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單，樣品無(wú)需透明化處理和薄切片，XNH和X-PCI還可對(duì)無(wú)標(biāo)記的腦組織進(jìn)行成像.通過MOST成像后樣品完整性被嚴(yán)重?fù)p傷，而同步輻射X射線成像方法可保留組織的完整性，在此前提下經(jīng)過成像的樣品可進(jìn)行后續(xù)的組織學(xué)研究；（3）硬X射線的穿透深度高，可滿足立方毫米體積的腦組織塊成像，這降低了多組數(shù)據(jù)配準(zhǔn)的工作量和工作難度；（4）相比于熒光成像等成像手段，X射線成像無(wú)光漂白的現(xiàn)象，可長(zhǎng)時(shí)間成像，并可以反復(fù)成像；（5）Micro-CT的成像速度快，在1 min內(nèi)可以成像1 mm3的組織塊，可縮短數(shù)據(jù)獲取的時(shí)間，是目前成像速度最快的三維成像手段.

此外，全場(chǎng)透射X射線顯微鏡（Full-field transmission X-ray microscopy，F(xiàn)ull-field TXM）在近十年也已在多個(gè)同步輻射光源上投入適用，TXM與光學(xué)顯微鏡的正入射不同，TXM采用空心環(huán)形光照明，成像系統(tǒng)的空間分辨率和成像視場(chǎng)受到菲涅爾波帶片的限制.2018年Ge等［109］在National Synchrotron Light Source II（NSLS-II）上通過Full-field TXM在1 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了空間分辨率低于50 nm的納米層析成像，與之前的成像手段相比速度提高了10倍以上.Holler等［110］報(bào)道了一種16 nm各向同性三維分辨率的成像方法，采用了相干衍射成像（CDI），保證分辨率的同時(shí)擁有較深的穿透深度.2021年美國(guó)阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的De Andrade等［111］在TXM上實(shí)現(xiàn)了小于10 nm空間分辨率的快速（85 min）3D層析成像，縮小了X射線技術(shù)與EM分辨率之間的差距.TXM將成為高分辨腦成像的重要技術(shù)手段.

Fig.6 Imaging of model animal soft tissues by Micro-CT

4 繪制人腦聯(lián)接圖譜的需求與現(xiàn)有技術(shù)的局限

聯(lián)接組是指神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元聯(lián)接的總和，是全聯(lián)接的總和.當(dāng)兩個(gè)神經(jīng)元之間有突觸聯(lián)接時(shí)，就說(shuō)明這兩個(gè)神經(jīng)元之間是存在聯(lián)接的，聯(lián)接組的差異對(duì)個(gè)體差異至關(guān)重要.基因組早在受孕時(shí)就已經(jīng)確定，但神經(jīng)元之間的聯(lián)接在后天會(huì)發(fā)生改變，無(wú)論是增強(qiáng)減弱還是增加減少神經(jīng)元之間的聯(lián)接，神經(jīng)元之間的聯(lián)接總是在發(fā)生改變［112］.雖然2021年有關(guān)人海馬區(qū)單細(xì)胞RNA測(cè)序的結(jié)果表明人成年后沒有真正意義上新生神經(jīng)元的產(chǎn)生［113，114］，但神經(jīng)元之間的聯(lián)接在不斷發(fā)生改變，從而導(dǎo)致聯(lián)接組的改變.所以聯(lián)接組可能會(huì)更好地揭示大腦的運(yùn)行機(jī)制以及每個(gè)人的個(gè)體差異性.

聯(lián)接組對(duì)于理解模式動(dòng)物乃至人腦的行為模式及意識(shí)均具有重要意義.迫切需要聯(lián)接組學(xué)研究者們解決的一個(gè)問題是，如何通過聯(lián)接組來(lái)考察復(fù)雜的行為，Susoy等［115］對(duì)線蟲的性行為進(jìn)行了描述，并證實(shí)了對(duì)聯(lián)接組的研究可以用于考察復(fù)雜的行為.由于線蟲僅有302個(gè)神經(jīng)元，這也是目前唯一可以編譯出完整、詳細(xì)聯(lián)接組的模式動(dòng)物，他們通過將復(fù)雜的交配行為分解成各種子行為，將神經(jīng)元活動(dòng)與線蟲的聯(lián)接組相對(duì)應(yīng)，以判斷線蟲交配行為與神經(jīng)元之間的聯(lián)系.研究發(fā)現(xiàn)在使用的8種線蟲中，大腦活動(dòng)圖呈現(xiàn)了高度一致性，并基于此可預(yù)測(cè)第9種線蟲的行為.在準(zhǔn)確摘除了線蟲中與轉(zhuǎn)動(dòng)相關(guān)的一個(gè)神經(jīng)元，線蟲失去了轉(zhuǎn)動(dòng)的能力.這說(shuō)明獲取聯(lián)接組圖譜對(duì)于理解大腦功能以及不同模式動(dòng)物乃至人類的行為是至關(guān)重要甚至是必要的.聯(lián)接組并不是一成不變的，同種模式動(dòng)物的聯(lián)接組也會(huì)發(fā)生改變.通過比較同種模式動(dòng)物的多個(gè)聯(lián)接組，可以比較個(gè)體上的特征差異.Witvliet等［116］對(duì)8個(gè)基因完全相同的線蟲幼蟲和成年蟲之間神經(jīng)元聯(lián)接方式的差異進(jìn)行了比較，研究結(jié)果表明，盡管在基因上相同，大腦中神經(jīng)元間的聯(lián)接卻有約40%的差異.一致的聯(lián)接可能與動(dòng)物基本的生存活動(dòng)相關(guān)，而聯(lián)接的差異性可能是個(gè)體差異的原因.所以多組聯(lián)接組圖譜對(duì)于聯(lián)接組學(xué)的研究是必要的，可用于比較個(gè)體之間的一致性和差異性，最終將行為、疾病等與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與聯(lián)接結(jié)合起來(lái).

通過EM獲取百萬(wàn)分之一人腦聯(lián)接組數(shù)據(jù)耗費(fèi)了大量的采樣時(shí)間和儲(chǔ)存空間［48］，目前想通過EM獲取完整人腦聯(lián)接組數(shù)據(jù)幾乎是不可能完成的任務(wù).基于同步輻射的TXM和XNH可能是解決這一問題的突破點(diǎn)，目前TXM已經(jīng)實(shí)現(xiàn)小于10 nm空間分辨率的快速（85 min）三維層析成像［111］，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了20 nm空間分辨率的高爾基染色神經(jīng)元成像［107］，XNH也已實(shí)現(xiàn)25 nm各向同性分辨率果蠅和小鼠神經(jīng)元的三維成像［94］，且仍未達(dá)到XNH的極限.雖然目前仍未有通過TXM和XNH對(duì)突觸三維成像的報(bào)道，但如果可進(jìn)一步提高成像分辨率及神經(jīng)元的對(duì)比度，TXM和XNH有望應(yīng)用于突觸分辨率的聯(lián)接組圖譜構(gòu)建.結(jié)合TXM和XNH較快的成像速度，其有望在人腦聯(lián)接組圖譜的構(gòu)建中提供重要的技術(shù)支持.

獲取完整人腦聯(lián)接組數(shù)據(jù)的另一突破點(diǎn)是構(gòu)建介觀尺度腦聯(lián)接圖譜.通過EM構(gòu)建聯(lián)接組圖譜受限于其成像速度，對(duì)大尺寸腦組織往往只能成像部分腦區(qū)，對(duì)跨腦區(qū)投射的神經(jīng)元無(wú)法成像其完整結(jié)構(gòu).由于胞體、軸突、樹突的尺寸在介觀尺度上，構(gòu)建介觀尺度人腦聯(lián)接圖譜也是至關(guān)重要的，可通過圖譜分析神經(jīng)元在腦區(qū)之間的交流甚至分析復(fù)雜的人類行為.但獲取人腦介觀尺度腦聯(lián)接圖譜的工作量是驚人的，并受到多方面條件的制約.熒光顯微鏡技術(shù)是目前應(yīng)用于介觀尺度腦聯(lián)接圖譜研究最廣泛和有效的手段，熒光成像得益于熒光標(biāo)記技術(shù)的飛躍發(fā)展，但目前常用的熒光標(biāo)記技術(shù)［如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基于AAV、狂犬病毒（Rabies virus，RV）等病毒標(biāo)記技術(shù)］無(wú)法用于活體人腦組織標(biāo)記，這極大限制了熒光成像技術(shù)在人腦聯(lián)接圖譜研究上的應(yīng)用.高爾基染色法可對(duì)死后的人腦組織進(jìn)行固定及染色，高爾基染色對(duì)于人腦神經(jīng)元成像具有更高的普適性.但對(duì)目前的MOST而言，若以分辨率0.3μm×0.3μm×0.3μm對(duì)完整人腦進(jìn)行成像，需要花費(fèi)數(shù)百年.

Micro-CT可能是繪制人腦介觀腦聯(lián)接圖譜的重要技術(shù)手段.Micro-CT具有各向同性、高穿透深度、高對(duì)比度及快成像速度等一系列優(yōu)勢(shì).以人腦體量（約1.2×106mm3）來(lái)計(jì)算，對(duì)完整人腦進(jìn)行介觀尺度成像只需要不到900 d的時(shí)間.人腦介觀尺度聯(lián)接圖譜的繪制是一個(gè)巨大的工程，任何課題組和研究團(tuán)隊(duì)都無(wú)法獨(dú)立完成，需要多團(tuán)隊(duì)的分工合作.目前國(guó)際上由中國(guó)上海光源（SSRF）、中國(guó)臺(tái)灣同步輻射研究中心（NSRRC）、韓國(guó)浦項(xiàng)光源（Pohang Light Source）、新加坡光源中心（SSLS）、日本Spring 8光源、澳大利亞以及泰國(guó)光源等共同成立的大科學(xué)裝置群的同步輻射神經(jīng)科學(xué)亞太聯(lián)盟（Synchrotrons for Neuroscience-an Asia-Pacific Strategic Enterprise，SYNAPSE），旨在繪制全世界首幅人全腦介觀X射線聯(lián)結(jié)圖譜成像［99］，趙振堂、胡鈞和樊春海為聯(lián)盟執(zhí)委.該聯(lián)盟是非政府組織，通過數(shù)十條相關(guān)同步輻射X射線成像線站，相互通力合作，擬在2025年前完成第一例介觀尺度人全腦聯(lián)接圖譜X射線三維成像圖譜.以目前1 mm3/min的成像速度，十條相關(guān)同步輻射X射線成像線站協(xié)作，完成人全腦介觀尺度X射線成像所用時(shí)間不到90 d.基于上述種種原因，同步輻射Micro-CT或?qū)⒊蔀槿四X介觀聯(lián)接圖譜繪制的重要手段.

要獲得人腦介觀聯(lián)接圖譜，目前仍存在一些問題需要攻克.首先，現(xiàn)階段最適合Micro-CT的神經(jīng)元染色方法是高爾基染色法，但傳統(tǒng)高爾基染色方法僅有1%～5%的隨機(jī)標(biāo)記效率.雖然稀疏染色可讓Micro-CT產(chǎn)生的投影圖有足夠的對(duì)比度和襯度，但要獲取人腦聯(lián)接圖譜就需要獲取更多數(shù)據(jù)集來(lái)提高覆蓋所有神經(jīng)元的置信度，這在一定程度上增大了數(shù)據(jù)獲取的工作量.其次，軸突是神經(jīng)元之間交流的關(guān)鍵，雖然高爾基染色技術(shù)在一定程度上可染色軸突，但目前仍未有對(duì)跨腦區(qū)投射神經(jīng)元軸突染色的報(bào)道.提高高爾基染色神經(jīng)元的完整性和效率可使高爾基染色技術(shù)更好地應(yīng)用于Micro-CT.由于光路及同步輻射光穩(wěn)定性的原因，通過Micro-CT獲取的投影圖中會(huì)出現(xiàn)明暗條紋以及亮度不均的情況，這一定程度上會(huì)影響圖像關(guān)鍵信息的提取.近些年深度學(xué)習(xí)的方法廣泛應(yīng)用于不同科學(xué)領(lǐng)域，如果能從深度學(xué)習(xí)入手，對(duì)投影圖的明暗條紋及背景進(jìn)行精準(zhǔn)扣除將會(huì)對(duì)關(guān)鍵信息有更準(zhǔn)確的判斷.最后，Micro-CT獲取的是二維投影數(shù)據(jù)且組數(shù)較多，如何對(duì)多組數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)快速切片重構(gòu)以及空間上的配準(zhǔn)是急需解決的問題.所以無(wú)論是改良現(xiàn)有的高爾基染色技術(shù)、開發(fā)新型的適用于Micro-CT神經(jīng)元成像的染色標(biāo)記技術(shù)還是發(fā)展適用于Micro-CT大數(shù)據(jù)處理技術(shù)都是至關(guān)重要的.

5 總結(jié)與展望

同步輻射X射線成像相比于其它技術(shù)手段，體現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).Micro-CT成像具有高速、高穿透性、各向同性分辨率等方面的優(yōu)勢(shì)；XNH在具備高分辨率的同時(shí)擁有高穿透和較快的成像速度；X-PCI則可以對(duì)無(wú)標(biāo)記的組織樣品進(jìn)行成像，縮短樣品制備的時(shí)間；XRF則可以對(duì)腦組織中的相關(guān)金屬元素進(jìn)行定量分析等.這一系列技術(shù)展示了同步輻射光源這一大科學(xué)裝置在腦成像領(lǐng)域扮演的重要角色.同步輻射X射線成像也在不斷開發(fā)新的成像方法，如何將其應(yīng)用于腦成像領(lǐng)域中還有待探索和考究.人腦介觀尺度聯(lián)接圖譜的繪制是一個(gè)巨大的工程，這不可能是一個(gè)課題組可以完成的，需要多個(gè)課題組分工合作，目前國(guó)際上已經(jīng)成立了基于大科學(xué)裝置群的SYNAPSE.針對(duì)不同聯(lián)接圖譜分辨率的需求，適用的方法也不盡相同.但就人腦亞微米分辨聯(lián)接圖譜也就是介觀聯(lián)接圖譜而言，同步輻射X射線成像技術(shù)是最快速且高分辨的方法，但仍有許多問題需要解決.如果僅靠單一光源線站對(duì)人腦進(jìn)行X射線Micro-CT數(shù)據(jù)的獲取，數(shù)據(jù)獲取的時(shí)間仍舊十分龐大，這一問題的解決方法是眾多大科學(xué)裝置群多線站合作（如SYNAPSE）或開發(fā)更快速更大體量的成像系統(tǒng).其次，如何從龐大的人腦成像數(shù)據(jù)中快速高效提取有效信息、保留結(jié)構(gòu)框架、剔除無(wú)用的信號(hào)和噪音也是急需解決的問題.最后，應(yīng)當(dāng)改良或開發(fā)新的神經(jīng)元染色標(biāo)記技術(shù)，使其適用于同步輻射X射線成像方法.如果有這一系列技術(shù)的支持和突破，完成人腦聯(lián)接圖譜的繪制將只是時(shí)間問題，同步輻射X射線成像技術(shù)應(yīng)在其中發(fā)揮不可替代的重要作用.