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    羅紅霉素納米脂質體包封率的測定

    2017-07-05 12:56曾朝暉林明越
    中國醫(yī)藥科學 2017年7期
    關鍵詞:高效液相色譜法

    曾朝暉++林明越

    [摘要] 目的 建立羅紅霉素納米脂質載體包封率測定的高效液相色譜法。 方法 色譜條件:Diamonsil-C18柱(200mm×4.6mm,5μm);柱溫30℃;流動相:0.067mol/L磷酸二氫銨水溶液(三乙胺調PH為7.5)-乙腈(3∶2);檢測波長205nm;體積流量1.0mL/min;進樣量20μL。對該色譜條件下測定羅紅霉素的方法學進行考察,建立超濾離心法測定羅紅霉素納米脂質載體的包封率。 結果 在此色譜條件下羅紅霉素與輔料及溶劑峰均得到良好分離,羅紅霉素在50.00~1000μg/mL濃度范圍內線性關系良好(r=0.9995,n=7),超濾離心法測得羅紅霉素納米脂質載體的包封率為(88.7±0.2)%。 結論 該方法準確可靠、簡單快速,可用于羅紅霉素納米脂質載體包封率的測定。

    [關鍵詞] 羅紅霉素;包封率;高效液相色譜法;超濾離心法

    [中圖分類號] R283 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616(2017)07-31-04

    Determination of entrapment efficiency of roxithromycin nano-liposomes

    ZENG Zhaohui1 LIN Mingyue2

    1.Department of Pharmacy,F(xiàn)oshan Nanhai District Eighth People's Hospital,F(xiàn)oshan 528216,China;2.Pharmaceutical Preparation Center,F(xiàn)oshan Hospital of TCM,F(xiàn)oshan 528200,China

    [Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of entrapment efficiency of roxithromycin nano-liposomes. Methods Chromatographic conditions:diamonsil-C18 column(200mm×4.6mm,5μm);column temperature 30℃;mobile phase:0.067mol/L ammonium dihydrogen phosphate solution(adjusting pH to 3.0 with triethylamine)-acetonitrile(3:2);detection wavelength 205nm;volume flow rate 1.0mL/min;injection volume 20μL.The method for determination of roxithromycin in the chromatographic conditions was investigated and centrifugal ultrafiltration method was established to determine entrapment efficiency of roxithromycin nano-liposomes. Results In this chromatographic condition,roxithromycin,excipient and solvent peaks were all well separated. Roxithromycin in the concentration range of 50.00-1000μg/mL had a good linear relationship(r=0.9995,n=7).Entrapment efficiency of roxithromycin nano-liposomes determined by centrifugal ultrafiltration method was(88.7±0.2)%. Conclusion The method is accurate,reliable,simple and quick.It can be used for determination of entrapment efficiency of roxithromycin nano-liposomes.

    [Key words] Roxithromycin;Entrapment efficiency;High performance liquid chromatography;Centrifugal ultrafiltration method

    羅紅霉素是新一代的抗生素,其主要結構是大環(huán)內酯類,通過藥理實驗發(fā)現(xiàn)其主要活性表現(xiàn)在對于革蘭氏陽性菌、衣原體、厭氧菌等的抑制上[1-2]。根據最新研究進展,對于大環(huán)內酯類的抗生素的含量測定的方法主要包括高效液相色譜法和生物法。而作為生物法,由于它的周期比較長、操作不夠簡便等因素從而被高效液相色譜法所逐漸所替代。而紫外分光光度法的測定主要缺點是其紫外吸收不強,只有在紫外的210nm末端處有一些吸收,而在該波長下,大多數的溶劑都有一定的吸收,對實驗結果的干擾比較大[3-7]。

    由于羅紅霉素具有一定的毒副作用,包括了一些過敏反應以及神經毒性等,這些毒副作用嚴重影響了羅紅霉素的廣泛使用[8]。本研究采用一種全新的方法制備了羅紅霉素納米脂質體(NLC),該脂質載體能顯著的提高其在水中的溶解度,達到延長藥物在體內作用時間的目的,有效改善藥物的吸收,分布,代謝以及排泄,從而有效的提高了羅紅霉素的治療效果,與此同時,也能有效降低藥物的毒副作用[9-10]。本研究對羅紅霉素納米脂質體的分離通過超速離心的方法,同時,采用HPLC法測定納米脂質載體中的含量,現(xiàn)報道如下。

    1 儀器與試藥

    Zetasizer激光粒度測定儀(英國Malvern 公司);Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司);DF-101S恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器);FA2004N電子天平(上海精密科學儀器);PH儀(上海谷雨環(huán)保科技有限公司);超濾離心管(MW30000)(美國Milipore公司);透析袋(截留分子量14000Da)(上海綠鳥科技發(fā)展有限公司);Waters2695高效液相色譜儀(美國沃特斯公司);Diamonsil C18色譜柱(迪馬科技有限公司);羅紅霉素(批號130405)成都普思生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純購自德國默克;無水乙醇、三乙胺、磷酸二氫銨、2%磷鎢酸均購自天津市福晨化學試劑廠。

    2 方法與結果

    2.1 羅紅霉素納米脂質載體的制備

    2.1.1 羅紅霉素納米脂質載體的處方 根據預實驗結果篩選羅紅霉素納米脂質載體的處方,得出最優(yōu)處方見表1。

    2.1.2 紅霉素納米脂質載體的制備 根據篩選處方,采用高溫乳化低溫固化法,依處方量精密稱取羅紅霉素、GMS、SA、MCT、卵磷脂作為油相;取吐溫-80、HS-15作為水相。將有機相在800r/min攪拌下緩慢加入水相中,70℃條件下,將有機溶劑盡可能揮發(fā),2h后,半透明乳液倒入40mL冰水中,置于冰浴下攪拌,1h后得羅紅霉素NLC混懸液。

    2.2 HPLC測定羅紅霉素NLC包封率方法的建立

    2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 選擇迪馬-C18柱(200mm×4.6mm,5μm)為固定相,流動相為0.067mol/L磷酸二氫銨水溶液(三乙胺調PH為7.5)-乙腈(60∶40),柱溫30℃,檢測波長205nm,體積流量1.0mL/min,進樣量20μL。結果表明各項測試數據均符合方法學要求,從圖譜可看出藥物與雜質峰分離明顯,見表2和圖1。

    2.2.2 標準曲線的建立 精密量取羅紅霉素50.0mg置于50mL容量瓶中,加流動相定容至刻度,配成50.00~1000μg/mL一系列濃度的羅紅霉素溶液。在205nm波長處進行HPLC測定。以峰面積(Y)為縱坐標和濃度(X)為橫坐標進行線性回歸,繪制羅紅霉素標準曲線得標準曲線方程為:Y=3254.3X-26198,r=0.9995。結果表明在50.00~1000μg/mL范圍內羅紅霉素的線性關系良好。見圖2。

    2.2.3 專屬性實驗 (1)對照品溶液的制備:將羅紅霉素對照品儲備液10mL置于10mL容量瓶中,得到濃度為1000μg/mL的對照品溶液。(2)供試品溶液的制備:將羅紅霉素納米脂質載體溶液1.0mL置于10mL的容量瓶中,破乳,超聲10min,流動相定容;3000r/min離心10min,取上清液經0.22μm濾膜過濾后即得。(3)空白納米脂質載體溶液的制備 將空白納米脂質載體溶液1.0mL,照“2.2.3.2”項下方法,即得。將上述三種溶液進行HPLC分析,判斷輔料對藥物含量測定的影響,色譜圖見圖3。

    2.2.4 精密度實驗 精密配制低、中、高3種濃度(50.00、600.0、1000μg/mL)的羅紅霉素對照品溶液,在“2.2.1”條件下進樣,1d內重復測定3次,連續(xù)測定3d,得到峰面積,并計算其RSD值。日內RSD分別為1.4%、0.6%、0.1%,日間RSD分別為1.9%、1.2%、0.5%。日間和日內的精密度均小于2.0%。結果表明該方法具有較好的精密度。

    2.2.5 重復性實驗 將所制備的樣品,按照“2.2.3.2”項下制備3份供試品溶液,在“2.2.1”條件下分別進樣,記錄峰面積,得出RSD值,結果羅紅霉素濃度為401.2μg/mL,其RSD為1.7%。表明該方法重復性良好。見表3。

    2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.3.2”項下的羅紅霉素NLC供試品溶液,分別在0、4、8、12、24h進樣測定,測得其RSD為1.0%,小于2.0%。表明羅紅霉素納米脂質載體供試品在24h內具有較好的穩(wěn)定性。

    2.2.7 回收率實驗 精密稱取羅紅霉素對照品適量,加入空白納米脂質載體適量配成濃度為500.0、6000、10000μg/mL的溶液,各三份,精密量取上述各溶液1.0mL,加無水乙醇1.0mL破乳。超聲10min用流動相定容,分別配成濃度為50.00、600.0、1000μg/mL的供試液,3000r/min離心10min,上清液經0.22μm濾膜過濾后取續(xù)濾液20μL進樣測定。結果顯示低、中、高3種濃度的平均回收率分別為98.4%、99.6%、99.7%;RSD分別為1.9%、0.7%、0.2%。結果表明回收率實驗中,羅紅霉素與空白納米脂質載體不發(fā)生吸附作用。對包封率測定基本沒影響,此法符合要求。

    2.3 羅紅霉素納米脂質載體包封率的測定

    2.3.1 羅紅霉素膜透過率試驗

    2.3.1.1 低溫超濾離心溫度的選擇 采用低溫超濾法測定包封率,采取單因素考察,改變不同溫度,考察溫度的不同對超濾離心的影響,結果顯示溫度在4℃左右離心效果最好。

    2.3.1.2 低溫超濾離心轉速的選擇 采用低溫超濾法測定包封率,改變不同轉速,考察轉速的不同對超濾離心的影響,結果顯示轉速在8000r/min左右離心效果最好。

    2.3.1.3 低溫超濾離心離心時間的選擇 采用低溫超濾法測定包封率,改變不同離心時間,考察時間的不同對超濾離心的影響,結果顯示超濾時間在20min左右離心效果最好。

    2.3.1.4 羅紅霉素膜透過率測定 取低、中、高(50.00、600.0、1000μg/mL)3種濃度的對照品溶液,量取各溶液500μL置于離心超濾管(截留相對分子量為30K)中,8000r/min離心30min,超濾液過濾后進樣,采用HPLC測定含量,結果顯示低、中、高3種濃度的平均透過率分別為98.5%、99.5%、99.6%;RSD分別為0.7%、0.4%、0.3%。表明羅紅霉素的濃度對其膜透過率無明顯影響。

    2.3.2 超濾回收率 取適量對照品溶液,加入適量的空白納米脂質載體配成濃度為50.00、600.0、1000μg/mL的溶液各3份。精密量取各溶液500μL置于離心超濾管(截留相對分子量為30K)中,8000r/min離心30min,超濾液過濾后進樣,采用HPLC測定含量,結果顯示低、中、高3種濃度的平均回收率分別為96.9%、98.9%、99.4%;RSD分別為1.9%、0.4%、0.2%。表明實驗中,空白納米脂質載體對包封率的測定沒影響。

    2.3.3 包封率的測定 取納米脂質載體乳液500μL置于離心超濾管中,8000r/min離心30min,然后取超濾液過濾后進樣,采用HPLC法測定,得游離的羅紅霉素含量,即W游;另取納米脂質載體乳液1.0mL,破乳,超聲,流動相定容至10mL,離心10min,上清液過濾后進樣測定得W測。按2015版

    中國藥典[11]計算脂質體包封率的公式進行計算,包封率=(W總-W游)/W總×100%;W總=W測×10/2,為總投入藥量,W游為未包入脂質體的游離藥量。對其進行包封率的測定,結果表明羅紅霉素納米脂質載體的包封率符合要求,見表4。

    3 討論

    對于納米脂質體中的游離藥物的分離方法有很多報道,主要包括了凝膠過濾法[12]、微型柱離心法[13]、透析法、冷凍超速離心法、低溫超濾離心法等[14-15]。而綜合分析這些方法,超濾法具備了操作簡單、分離快速等優(yōu)勢,所以受到研究者們越來越多的重視[16]。

    在預實驗中,研究者們試圖采用超速離心法,但得到的樣品包封率均低于20%。分析失敗的可能原因為超速離心法的原理,而本研究所采用的主要材料相對密度均較小,因此導致在實驗中懸浮液中有大量的載藥納米粒沒有完全沉淀,導致測定結果不符合要求。

    所以本研究選用超濾法對羅紅霉素納米脂質體的包封率進行測定,同時對其進行了方法學的初步考察,表明本方法符合測定要求。

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    (收稿日期:2017-02-27)

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