同源基因IRX1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義

許海濤+劉良田+唐永華+李屏

[摘要]目的 探討同源基因IRX1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 選取2014年5月～2016年5月于深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院和深圳市石巖人民醫(yī)院行手術(shù)治療的肝癌患者30例為觀察組，同期選取30例志愿者或肝臟良性病變者為對(duì)照組。制備標(biāo)本后行IRX1基因在肝臟組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)、IRX1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，比較兩組病例IRX1表達(dá)的差異。結(jié)果 對(duì)照組肝臟標(biāo)本組織中IRX1蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組中高、中、低分化的IRX1蛋白的表達(dá)分別是對(duì)照組的1.90、3.31、3.33倍，觀察組中高、中、低分化轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的2.95、1.83、4.46倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；觀察組標(biāo)本組織中IRX1陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組病例的并發(fā)癥比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 同源基因IRX1參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，且表達(dá)與肝癌的分化程度相關(guān)，IRX1可作為臨床判斷病情的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]原發(fā)性肝癌；同源基因；轉(zhuǎn)錄；表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（b）-0004-03

原發(fā)性肝癌是臨床較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤中的致死率居于第三位，據(jù)報(bào)道，每年約70萬(wàn)人口死于肝癌，其中一半以上的患者源自我國(guó)[1-2]。原發(fā)性肝癌的發(fā)生給患者的生命安全造成了極大的威脅[3]。目前，對(duì)該疾病的研究也不斷深入，但發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的研究仍然屬于發(fā)展階段，因此肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、轉(zhuǎn)移與分子機(jī)制的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。以往的研究結(jié)果顯示，易洛魁家族同源盒（IRX）基因在腫瘤的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中起癌基因或者抑癌基因的作用[4-5]。本研究主要探討同源基因IRX1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年5月～2016年5月于深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院和深圳石巖人民醫(yī)院行手術(shù)治療的肝癌患者30例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)為肝癌；②未接受放療或化療治療；③肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本于手術(shù)后立即取材；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為肝癌，但未行手術(shù)治療者；②未取病理活檢者；③拒絕加入本研究者。同期選取30例健康志愿者或肝臟良性病變者作為對(duì)照組。觀察組中，男性患者18例，女性患者12例；年齡48～75歲，平均（59.31±5.48）歲；根據(jù)Edmondson分級(jí)方法[6]對(duì)入組患者進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)（高分化）13例，Ⅱ級(jí)（中分化）10例，Ⅲ級(jí)（低分化）7例；乙肝病毒陽(yáng)性9例，伴隨肝硬化17例。對(duì)照組中，男性患者19例，女性患者11例；年齡50～75歲，平均（59.57±5.51）歲。健康志愿者17例，肝炎患者8例，肝硬化患者5例。兩組患者的年齡、性別等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2標(biāo)本收集

在患者行肝臟手術(shù)的過(guò)程中，取癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)癌肝組織，一部分行病理檢查，一部分用于制備標(biāo)本待檢，癌組織選取部位的劃分為：癌組織是指肉眼所見(jiàn)的腫瘤部位，癌旁組織是指在腫瘤邊界2 cm范圍內(nèi)的非癌組織為癌旁組織，距腫瘤2 cm以上的范圍為遠(yuǎn)癌肝組織。將取得的組織制備成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，并迅速置于液氮罐中，-80℃低溫冰箱內(nèi)保存，以備檢測(cè)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNAiso Plus購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Trans-blot半干轉(zhuǎn)電泳槽購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司，兔抗人IRX1單克隆抗體購(gòu)自北京百泰克生物有限公司，兔抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld生物工程公司，免疫組化試劑盒（SP）購(gòu)自北京中山金橋有限公司。

1.3.2 IRX1基因在肝臟組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè) 標(biāo)本制備完成后，運(yùn)用離心柱法將組織標(biāo)本的RNA提出出來(lái)，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，取出質(zhì)量約為80 mg的標(biāo)本，將研磨后的液氮加入1 ml RNAiso Plus試劑中，按照說(shuō)明書的步驟操作提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，于-0℃保存。IRX1 基因所選用的引物如下。上游：5′-CAGATGGGCTCGCAGTA？鄄TGAAC-3′，下游：5′-CCTTGAGCGTGCTGGTGTTCT-3′。反應(yīng)的條件為在95℃的環(huán)境下預(yù)變性3 min，并于該溫度下進(jìn)行變性10 s，于55℃的環(huán)境下退火30 s，并以此過(guò)程為循環(huán)進(jìn)行操作，共重復(fù)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.3肝臟組織中IRX1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 運(yùn)用Western blot法。以12 000 r/min的速度離心5 min，取上清液，行SDS-PAGE，加入兔抗人IRX1單克隆抗體（1∶2000稀釋），于37℃的環(huán)境下作用1 h，然后洗滌，后給予加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），于37℃的環(huán)境下作用30 min，用ECLKit 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組肝臟標(biāo)本組織中IRX1蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的比較

觀察組肝臟標(biāo)本組織中IRX1蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組中高、中、低分化的IRX1蛋白表達(dá)分別是對(duì)照組的1.90、3.31、3.33倍，觀察組中高、中、低分化轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的2.95、1.83、4.46倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2兩組肝癌的定位及特征分析

觀察組標(biāo)本組織中IRX1陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.531，P<0.05），兩組病例的并發(fā)癥比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

原發(fā)性肝癌是臨床較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率及致死率較高，影響了患者的正常生活[7-9]。在以往的工作中，肝癌的治療以手術(shù)為主要治療手段，其臨床治療效果也逐漸得到突破，但由于肝癌的發(fā)病比較隱匿，當(dāng)患者出現(xiàn)自覺(jué)癥狀來(lái)就診時(shí)往往已處于疾病的晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，從而影響了治療效果[7，10]，因此，本研究以上述研究背景為出發(fā)點(diǎn)，擬尋找早期診斷、判斷預(yù)后的指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組肝臟標(biāo)本組織中IRX1蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組中高、中、低分化的IRX1蛋白表達(dá)分別是對(duì)照組的1.90、3.31、3.33倍，觀察組中高、中、低分化轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的2.95、1.83、4.46倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示肝癌患者與非肝癌患者體內(nèi)的IRX1蛋白存在差異，且肝癌患者更高，因此，本研究推斷，IRX1表達(dá)和轉(zhuǎn)錄與肝癌的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性，肝癌患者體內(nèi)IRX1較高，或當(dāng)體內(nèi)IRX1較高時(shí)則提示肝癌的發(fā)生，宜及早醫(yī)治[11-12]。IRX1在腫瘤的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、肺發(fā)育過(guò)程等，由于腫瘤性質(zhì)的不同，IRX1發(fā)揮的作用也不同，如在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及胃癌中發(fā)揮的作用為抑癌基因[13-14]。目前，對(duì)IRX1與肝癌存在相關(guān)性的機(jī)制研究尚不完善，可能與下列因素有關(guān)：PAK1作為一種關(guān)鍵的分子參與了肝癌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程，因此本研究人員推斷，IRX1參與肝癌的形成過(guò)程可能是通過(guò)作用于MAPK信號(hào)通路中的靶點(diǎn)PAK1及其他的信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的[15-16]。

在肝癌患者的病理組織切片中，存在IRX1高表達(dá)，且與腫瘤的形成、生長(zhǎng)、繁殖、轉(zhuǎn)移等過(guò)程有關(guān)，但機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]辛晟梁.介入治療在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（2）：10-12.

[2]周亮，王世明.GP73、AFP 異質(zhì)體聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌早期診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（4）：15-17.

[3]王小峰，王世明，申增強(qiáng).聯(lián)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物在原發(fā)性肝癌中診斷價(jià)值的研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（3）：185-187.

[4]涂艷陽(yáng)，張鵬幸，張永生，等.IRX1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志，2016，3（10）：1-4.

[5]余爽，王靜，董冰，等.IRX2基因在原發(fā)性肝癌中表達(dá)的初步研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（3）：185-187.

[6]Jiang J，Liu W，Guo X，et al.IRX1 influences peritoneal spreading and metastasis via inhibiting BDKRB2-dependent neovascularizationon gastric cancer[J].Oncogene，2011，30（44）：4498-4508.

[7]楊華瑜，王繹沈，徐海峰，等.血清AFP、GP73、GPC3單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝癌的診斷價(jià)值[J].癌癥進(jìn)展，2013，11（3）：249-253.

[8]楊貴敏，楊運(yùn)強(qiáng)，趙云勝.血清異常凝血酶原，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3聯(lián)合甲胎蛋白檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的臨床意義[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42（7）：783-785.

[9]覃運(yùn)榮.5種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值的探討[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2010，21（2）：39-41.

[10]周志忠，林奎生，葉惠珍，等.HER-2/neu基因在肝癌高發(fā)區(qū)原發(fā)性肝癌表達(dá)和意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013， 34（8）：1354-1356.

[11]許成新，褚邦勇，徐玖飛，等.甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體、鐵蛋白和腫瘤相關(guān)因子聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（2）：308-309，311.

[12]姚建華.高爾基體蛋白73 和甲胎蛋白聯(lián)檢在原發(fā)性肝癌診斷中的臨床應(yīng)用[J].放射免疫學(xué)雜志，2012，25（6）：673-675.

[13]黃必軍，黃鐵軍，梁?jiǎn)⑷f(wàn)，等.應(yīng)用雙色FISH技術(shù)檢測(cè)肝癌中HER-2的定量擴(kuò)增及其臨床意義[J]遺傳學(xué)報(bào)：英文版，2001，28（9）：793-800.

[14]白雪峰，吳擁軍.常用腫瘤標(biāo)志物在肝癌診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2011，28（5）：473-475.

[15]龍璐，陳貞，王堃，等. 血清GP73、GPC3、AFP-L3和AFP檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的價(jià)值[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（28）：46-50.

[16]楊貴敏，楊運(yùn)強(qiáng)，趙云勝.血清異常凝血酶原，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 聯(lián)合甲胎蛋白檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的臨床意義[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42（7）：783-785.

（收稿日期：2017-03-14 本文編輯：許俊琴）

Expression and clinical significance of homologous gene IRX1 in primary hepatocellular carcinoma

XU Hai-tao1 LIU Liang-tian2 TANG Yong-hua1 LI Ping3

1.Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital of Guangming New District in Shenzhen City of Guangdong Province，Shenzhen 518000，China；2.Department of Clinical Laboratory，Shiyan People′s Hospital of Baoan District in Shenzhen City of Guangdong Province，Shenzhen 518108，China；3.Department of Pathology，Shiyan People′s Hospital of Baoan District in Shenzhen City of Guangdong Province，Shenzhen 518108，China

[Abstract]Objective To explore the expression and clinical significance of homologous gene IRX1 in primary hepatocellular carcinoma.Methods 30 patients with liver cancer who were treated by operation in People′s Hospital of Guangming New District in Shenzhen City and Shiyan People′s Hospital of Shenzhen City from May 2014 to May 2016 were selected as observation group，at the same period，30 volunteers or patients with benign liver diseases were selected as control group.Detection of mRNA transcription level and detection of IRX1 protein expression in liver tissue after IRX1 gene was prepared，and the differences of IRX1 expression were compared between the two groups.Results The expression and transcription level of IRX1 protein in the liver tissue of the control group were significantly different from that of the control group （P<0.05）.In the observation group，the expression of IRX1 protein in high，middle and low differentiation was 1.90 times，3.31 times and 3.33 times of control group respectively.In the observation group，high，middle and low differentiation transcription level was 2.95 times，1.83 times，4.46 times as compared with that in control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive rate of IRX1 in the observation group was significantly higher than that in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.There was no significant difference of complications between the two groups （P>0.05）.Conclusion IRX1 is involved in the incidence and development process of hepatocellular carcinoma，and its expression is correlated with the degree of differentiation of liver cancer.IRX1 can be used as an indicator for judge the state of an illness in clinic.

[Key words]Primary liver cancer；Homologous gene；Transcription；Expression