兩株煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和促生防病潛力評(píng)價(jià)

徐同偉，周建云，祖慶學(xué)，文錦濤，簡(jiǎn)勝義，胡 勇，刁朝強(qiáng)，曾慶賓，陳德鑫

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266100；2.貴州省煙草公司貴陽(yáng)市公司，貴陽(yáng) 550000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100000；4.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617026）

兩株煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和促生防病潛力評(píng)價(jià)

徐同偉1,3，周建云2，祖慶學(xué)2，文錦濤2，簡(jiǎn)勝義2，胡 勇2，刁朝強(qiáng)2，曾慶賓4，陳德鑫1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266100；2.貴州省煙草公司貴陽(yáng)市公司，貴陽(yáng) 550000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100000；4.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617026）

煙草黑脛病在我國(guó)煙區(qū)分布廣泛，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量。篩選出對(duì)煙草具有防病和促生作用的細(xì)菌是有效控制煙草黑脛病危害和提高煙草產(chǎn)量的重要途徑。通過稀釋涂布平板法、對(duì)峙培養(yǎng)法從煙草病株根際土壤中篩選出YBM-4和YJC-4兩株細(xì)菌。根據(jù)分子形態(tài)學(xué)、最適生長(zhǎng)條件和生理生化及16S rDNA基因序列分析比對(duì)結(jié)果，鑒定YBM-4是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），YJC-4是沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。在對(duì)峙培養(yǎng)中，YBM-4和YJC-4細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病菌絲的相對(duì)抑制率分別是85.34%和72.99%。在盆栽試驗(yàn)中，YBM-4和YJC-4對(duì)煙株生物量和農(nóng)藝性狀的促生作用明顯，YBM-4、YJC-4和YBM-4+YJC-4混劑（比例1：1）對(duì)煙草黑脛病的平均防治效果分別是76.37%、80.06%和81.50%，病程進(jìn)展曲線下面積（AUDPC）分別比對(duì)照降低265.01，281.58，287.32。表明細(xì)菌YBM-4和YJC-4具有潛在的利用和開發(fā)價(jià)值。

細(xì)菌；煙草黑脛病；拮抗；促生；生防潛力

病蟲害是制約煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）是一種兼性寄生菌，喜高溫高濕，主要危害煙株根部和莖基部，導(dǎo)致煙葉減產(chǎn)、品質(zhì)降低，具有毀滅性危害[2]。目前對(duì)于該病的防控主要采用化學(xué)農(nóng)藥、抗病品種及一些栽培措施，但都有其缺陷性和局限性。采用拮抗菌也可以有效控制該病的危害[3-4]，而且具有無污染、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，開發(fā)和利用潛力巨大，符合煙草根莖病害控制的發(fā)展方向。

芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，研究發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌作為拮抗菌對(duì)煙草黑脛病具有良好的防治效果[5-6]，作為促生細(xì)菌（PGPR）對(duì)煙株的產(chǎn)量有明顯的提高作用[7-10]。其中枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[11]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[12]和短小芽孢桿菌（B. pumilus）[13]等利用抗生、溶菌、競(jìng)爭(zhēng)、重寄生作用抑制病原菌對(duì)植物的侵染和危害。短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）[14]和多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[15]等通過改善煙株根際環(huán)境、平衡植物激素水平來促進(jìn)煙葉的生長(zhǎng)和發(fā)育。近些年拮抗菌的研究熱度不減，但是針對(duì)煙草，既有抗病效果又有促生作用的研究較少，推廣應(yīng)用更是不足。

本研究從黑脛病病株的根際土壤中篩選出12株對(duì)黑脛病菌有較好防治效果的細(xì)菌。根據(jù)分子形態(tài)學(xué)、生理生化特性、基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，明確了生防效果最好的菌株YBM-4和YJC-4的系統(tǒng)分類地位，利用對(duì)峙培養(yǎng)和盆栽試驗(yàn)探究了兩株細(xì)菌的生防和促生效果，以期為菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試煙草品種為紅花大金元（易感品種），煙草黑脛病菌為0號(hào)小種，均由國(guó)家煙草改良中心提供。2015年7月從貴陽(yáng)、攀枝花、西昌、濰坊、臨沂、青島等6煙區(qū)采集土壤87份，選取5～10 cm深處的黑脛病株根際土壤。其中YBM-4篩選自四川攀枝花煙區(qū)，YJC-4篩選自貴州貴陽(yáng)修文煙區(qū)。

拮抗菌的培養(yǎng)和分離用NA和NB培養(yǎng)基；抑菌活性測(cè)定用燕麥培養(yǎng)基；生理生化性狀測(cè)定用運(yùn)動(dòng)型培養(yǎng)基、檸檬酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖肉湯培養(yǎng)基；Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（江蘇靈寶化學(xué)有限公司），枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（黑龍江德強(qiáng)生物股份有限公司）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌株的篩選和分離 參照Niemann的稀釋涂布平板法[16]，待測(cè)土壤除雜過篩后，稱取5 g，加到100 mL錐形瓶中，用無菌水定容至50 mL，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，28 ℃，200 r/min震蕩1 h，使待測(cè)土樣充分稀釋均勻，靜止沉淀后，取上清液1 mL梯度稀釋至10-1～10-6倍，吸取各梯度溶液200 μL。用滅菌的涂布器均勻涂布在NA培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，空白對(duì)照用無菌水，3次重復(fù)。挑取生長(zhǎng)性狀不同的單菌落，多次平板培養(yǎng)和純化，直到獲得純化的單菌落，甘油保存。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法[17]，用直徑5 mm的打孔器將煙草黑脛病菌接種到OA培養(yǎng)基的中點(diǎn)，在菌塊離中心20 mm處對(duì)稱兩側(cè)接種8 μL拮抗菌液（約1.0×106cfu/mL），倒置，在28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察黑脛病菌周圍有無抑菌帶，并測(cè)量其抑菌直徑大小d（mm），對(duì)照接種等量無菌水，其他均相同。相對(duì)抑菌率（%）=[(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑]×100%。

1.2.3 分子形態(tài)學(xué)鑒定 （1）取樣，將細(xì)菌分別接種到NB培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，取足量菌液3000 r/min離心。（2）固定：用2.5%的戊二醛和2%鋨酸固定。（3）脫水處理：用乙醇的PBS溶液按30%，50%，70%，90%濃度梯度處理樣品，后經(jīng)100%乙醇和叔丁醇脫水處理。（4）冷凍干燥。（5）噴施Pt粉后，在電鏡下觀察YJC-4和YBM-4兩種菌的分子形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 生理生化特性鑒定 參照《植病研究方法》[18]，利用革蘭氏染色法檢驗(yàn)細(xì)菌陽(yáng)性/陰性，穿刺法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)性和明膠液化情況，1.5%二甲基對(duì)苯撐二胺檢測(cè)細(xì)菌中的氧化酶，溴百里酚藍(lán)（1.5%酒精溶液）檢測(cè)檸檬酸鹽，格里斯（Griess-llosvary）試劑法檢測(cè)硝酸鹽和N2，V-P試驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)菌的陽(yáng)性/陰性，甲基紅試驗(yàn)檢測(cè)糖代謝產(chǎn)酸的變化，溴百里酚藍(lán)檢測(cè)葡萄糖、果聚糖、淀粉的分解狀況，觀察7%氯化鈉溶液中拮抗菌的生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定 （1）根據(jù)DNA提取試劑盒的步驟，取過夜培養(yǎng)的拮抗菌1 mL，經(jīng)過細(xì)胞裂解、除雜和洗脫后，-20 ℃保存；（2）以799F(5'-AA CAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492 (5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3')為引物擴(kuò)增菌株16S rDNA；（3）50 μL擴(kuò)增體系：Template 1 μL，Reverse primer 1 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，2×Easy Tap?PCR Super Mix 25 μL，ddH2O 22 μL；（4）PCR反應(yīng)體系：94 ℃，5 min；94 ℃，30 sec；55 ℃，30 sec；72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。（5）PCR產(chǎn)物序列測(cè)定后，利用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較，用MEGA5.1的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 促生盆栽試驗(yàn) 當(dāng)紅花大金元煙苗生長(zhǎng)到5～6片葉時(shí)，取出后清水沖凈，分別在兩種拮抗菌液（約1.0×106cfu/mL）中浸根，30 min后取出并移栽到花盆中（上口徑100 mm×高90 mm）。移栽后緩苗3 d，用同濃度的菌液對(duì)煙株灌根處理，10 mL/株，每次重復(fù)20株，3次重復(fù)，空白用等量的清水處理。在28 ℃，80%濕度的人工氣候室中培養(yǎng)并觀察。移栽后45 d，每個(gè)重復(fù)選取具有代表性的5株，測(cè)量整株鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，根鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，平均株高，平均根長(zhǎng)，最大葉長(zhǎng)，最大葉寬，分析拮抗菌對(duì)煙株生長(zhǎng)量、農(nóng)藝性狀的促生效果。

1.2.7 盆栽試驗(yàn)防效 將配制好的兩種菌液（約1.0×106cfu/mL）分成3個(gè)處理，處理1是YJC-4菌液、處理2是YBM-4菌液、處理3是YJC-4和 YBM-4菌液按體積比1∶1混合，分別對(duì)生長(zhǎng)在盛有滅菌土壤的花盆（上口徑100 mm×高90 mm）中的紅花大金元煙苗（5～6片葉）灌根處理，同時(shí)接種黑脛病菌，每隔7 d，菌液灌根1次，共3次，用58%甲霜·錳鋅和枯草芽孢桿菌作為對(duì)照，500倍液，對(duì)照用等量的無菌水，其他處理措施均相同。每個(gè)處理18株，3次重復(fù)。在第3次施藥后7 d和 14 d調(diào)查發(fā)病率（%）、病情指數(shù)，相對(duì)防治效果（%）和病程進(jìn)展曲線下面積（AUDPC）。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T39—1996）規(guī)定執(zhí)行。計(jì)算公式：病程進(jìn)展曲線下面積（AUDPC）=∑[(Ai+Bi-1)/2](Ti-Ti-1)，Ai和Bi-1表示病情指數(shù)，Ti和Ti-1表示兩次調(diào)查結(jié)果的時(shí)間差[19]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用DPS軟件，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1拮抗菌的平板抑菌效果

圖1可知，通過對(duì)峙培養(yǎng)法，YBM-4細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病抑菌效果最明顯，產(chǎn)生清晰的抑菌圈，菌絲稀疏，邊緣受到抑制和溶解，最大抑菌直徑是74.25 mm，相對(duì)抑制率為85.34%。其次為YJC-4，菌絲生長(zhǎng)稀疏不均勻，最大抑菌直徑是63.50 mm，相對(duì)抑制率72.99%，具有較好的抑菌效果。（其中A：對(duì)照組菌落直徑d1=87.00 mm；B：YBM-4菌落直徑d2=12.75 mm；C：YJC-4菌落直徑d3=23.50 mm）。

2.2分子形態(tài)學(xué)鑒定

如圖2所示，在掃描電子顯微鏡6×104倍下觀察，YBM-4拮抗菌為橢圓柱狀，內(nèi)生芽孢，兩頭寬中間略窄，表面粗糙，灰暗不透明，大小為a1（0.38～0.66 μm）×b1（1.27～1.58 μm），YJC-4拮抗菌為圓柱狀，內(nèi)生芽孢，表面附有黏液，灰白色，大小為a2（0.31～0.47 μm）×b2（1.30～1.78 μm）。其中D為YBM-4，E為YJC-4拮抗菌。

圖1拮抗菌YBM-4和YJC-4對(duì)煙草黑脛病菌的抑制作用Fig. 1 Inhibiting effects of stains YBM-4 and YJC-4 onPhytophthora nicotianae

2.3生理生化特性鑒定

如表1所示，YBM-4菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有一定運(yùn)動(dòng)性，在V-P測(cè)驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)顯陽(yáng)性，氧化酶、明膠液化呈陰性，可以利用檸檬酸鹽和水解淀粉，在硝酸鹽培養(yǎng)液中產(chǎn)生亞硝酸鹽和N2，能夠分解葡萄糖，不分解果聚糖，在7%氯化鈉中生長(zhǎng)良好。YJC-4菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有運(yùn)動(dòng)性，在氧化酶、V-P試驗(yàn)和甲基紅中顯陽(yáng)性，明膠液化顯陰性，可以利用檸檬酸鹽，不能水解淀粉，產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽和N2，分解葡萄糖、果聚糖，可以在7%氯化鈉中正常生長(zhǎng)。

2.4分子生物學(xué)鑒定

如圖3所示，YBM-4和YJC-4菌的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為635 bp、670 bp，將這兩株菌的16S rDNA序列通過BLAST程序?qū)Ρ确治?，YBM-4與枯草芽孢桿菌B. subtilis（KT985478.1）進(jìn)化關(guān)系最近，同源性達(dá)99%，YJC-4與沙福芽孢桿菌B. safensis（JF411315.1）進(jìn)化關(guān)系最近，同源性99%。根據(jù)分子形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16SrDNA序列同源性分析，YBM-4鑒定為枯草芽孢桿菌，登錄號(hào)為KX663829，YJC-4為沙福芽孢桿菌，登錄號(hào)為KX663830。

表1 YBM-4和YJC-4兩種菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of YBM-4 and YJC-4

2.5促生作用

2.5.1 兩種拮抗菌對(duì)煙苗生物量的促生作用 如表2所示，移栽后45 d，2株細(xì)菌對(duì)煙株的整株鮮質(zhì)量，整株干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量的促進(jìn)作用明顯。其中YBM-4細(xì)菌對(duì)干質(zhì)量、根干質(zhì)量的促進(jìn)作用最明顯，比對(duì)照分別增加59.93%、79.08%，莖部粗壯，葉色濃綠。YJC-4細(xì)菌處理的煙株促生作用也較好，整株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比對(duì)照分別增加48.66%和50%，根部鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量分別增加31.62%和62.09%，根系比對(duì)照更濃密。YJC-4菌的整體促進(jìn)效果略差于YBM-4，但差異不顯著，與對(duì)照差異極顯著，表明2株細(xì)菌可以有效促進(jìn)側(cè)根形成，煙苗的生長(zhǎng)和物質(zhì)的積累。

2.5.2 兩種拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促生作用如表3所示，移栽后45 d，2株細(xì)菌對(duì)煙苗的株高、根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬的促進(jìn)作用明顯。其中YBM-4細(xì)菌對(duì)根長(zhǎng)和株高的促進(jìn)作用最明顯，特別是促進(jìn)主根系的生長(zhǎng)，與對(duì)照相比，增長(zhǎng)率分別是28.53%和12.41%，略高于YJC-4處理的煙苗2.94%和0.89%，兩者差異不顯著，與對(duì)照相比差異極顯著。YBM-4細(xì)菌促進(jìn)煙苗的葉長(zhǎng)、葉寬增加6.85%和4.84%，略低于YJC-4處理的煙苗2.94%和0.89%，之間差異不顯著，與對(duì)照相比差異顯著。表明2株細(xì)菌可以有效促進(jìn)煙苗的株高和主根系的伸長(zhǎng)，增加葉片表面積。

圖3拮抗菌YBM-4和YJC-4的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains YBM-4 and YJC-4 based on 16SrRNA gene sequence

表2拮抗菌對(duì)煙株生物量的促生作用Table 2 Antagonistic strains of tobacco biomass growth promoting effect

表3拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促生作用Table 3 Antagonistic bacteria on Agronomic Characters of tobacco plant growth promoting effect

2.6盆栽試驗(yàn)

如表4所示，施藥后第7天調(diào)查表明，YBM-4、YJC-4和YBM-4+YJC-4混劑（比例1：1）與CK相比，防效分別為79.70%、81.17%和82.03%，與對(duì)照差異極顯著。甲霜·錳鋅處理的煙苗防效為84.67%，略好于3類細(xì)菌菌液，但差異性不顯著，5組處理與對(duì)照相比差異性均顯著。表明短時(shí)間內(nèi)，5組處理對(duì)煙草黑脛病的防治效果均明顯。第14天的調(diào)查表明，YBM-4+YJC-4混劑的防治效果最好，為80.97%，與甲霜·錳鋅防治效果相當(dāng)，差異不顯著，其次為YJC-4和YBM-4，防效分別為78.94%和73.03%。甲霜·錳鋅的病程進(jìn)展曲線下面積比對(duì)照低288.78，表明甲霜·錳鋅可有效推遲黑脛病的發(fā)生，有效緩解病情的加重和蔓延。其次為YBM-4+YJC-4混劑，比對(duì)照低287.32，兩者差異不顯著，枯草芽孢桿菌AUDPC最大，效果最差。綜上所述，YBM-4+YJC-4混劑的防效明顯，兩種細(xì)菌混合后，相互作用，可有效增強(qiáng)對(duì)煙草黑脛病的防治效果，延緩和推遲病害的發(fā)生和擴(kuò)散。

表4拮抗菌對(duì)煙草黑脛病的病程進(jìn)展曲線下面積和盆栽試驗(yàn)防治效果Table 4 Control efficacy and AUDPC of strain YBM-4andYJC-4 on tobacco black shank in greenhouse

3 討 論

枯草芽孢桿菌（B. subtilis）作為植物根際細(xì)菌，對(duì)煙苗的促進(jìn)作用已有報(bào)道。易有金等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B-001可有效定殖在根莖部，從而增加煙草幼苗根長(zhǎng)、株高、葉長(zhǎng)、葉寬和鮮質(zhì)量。本試驗(yàn)研究表明，枯草芽孢桿菌YBM-4通過浸根、灌根2種方式侵入到煙苗根部周圍，提高煙株根部的微生物活性，豐富菌群結(jié)構(gòu)[21]。接種YBM-4細(xì)菌45 d后，與對(duì)照相比煙苗的根系發(fā)達(dá)、莖稈粗壯，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和所需礦質(zhì)元素的吸收，從而提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。沙福芽孢桿菌此方面的研究鮮有報(bào)道，沙福芽孢桿菌YJC-4與枯草芽孢桿菌YBM-4相比，促進(jìn)葉長(zhǎng)葉寬、增加葉片表面積效果更好，但差異性不顯著。YJC-4細(xì)菌應(yīng)用潛力較大，具有深入研究的必要性。

與植物相關(guān)的芽孢桿菌，分為植物病原菌、生防菌和腐生菌三類。王進(jìn)等[11]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌21b對(duì)煙草黑脛病菌的抑制率達(dá)78.33%。本試驗(yàn)2次調(diào)查結(jié)果表明，在施藥后第7 d，YJC-4和YBM-4作為單菌劑，YBM-4+YJC-4作為混合菌劑，甲霜·錳鋅作為化學(xué)藥劑，均可有效控制煙草黑脛病的發(fā)生和蔓延。施藥后第14 d，防效均有所減弱，特別是枯草芽孢桿菌菌劑效果最差，防效只有65.31%。但YBM-4+YJC-4混合菌劑的防治效果較好，為80.97%，AUDPC比對(duì)照降低287.32，表明兩種拮抗菌及其混劑的防效可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，延緩黑脛病的發(fā)生和擴(kuò)展，且防治作用明顯。但是由于受復(fù)雜環(huán)境的影響，氣候、雨水、溫度等對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)和定殖能力都會(huì)造成各種阻礙，因此，拮抗菌的大田應(yīng)用效果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

拮抗菌的應(yīng)用和發(fā)展是生物防治的一種重要手段和方法，其中芽孢桿菌具有分布廣、抵抗力強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究篩選的兩株芽孢桿菌，YJC-4和YBM-4能有效防治煙草黑脛病，促進(jìn)煙苗的生長(zhǎng)與發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)，效果持久，具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值，為煙草黑脛病的生物防治提供了新的資源。

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Screening, Identification, Biocontrol and Growth-promoting Potential Evaluation of Two Bacterial Strains against Tobacco Black Shank

XU Tongwei1,3, ZHOU Jianyun2, ZU Qingxue2, WEN Jintao2, JIAN Shengyi2, HU Yong2, DIAO Chaoqiang2, ZENG Qingbin4, CHEN Dexin1*
(1. Tobacco Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266100, China; 2. Guiyang Tobacco Company, Guiyang 550001, China; 3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 4. Panzhihua Branch of Sichuan Tobacco Company, Panzhihua, Sichuan 617026, China)

Tobacco black shank is widely distributed in tobacco growing areas in China and has serious effects on tobacco production and quality. One of the potential control approaches against tobacco black shank is to use antagonistic bacterial. Using the culture plate dilution method, YBM-4 and YJC-4, two bacterial strains were isolated from tobacco rhizosphere soil to have an antagonistic effect on tobacco black shank. Based on comprehensive analysis on morphology, biological traits and physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA gene sequence analysis, YBM-4 was identified asBacillus subtilisand YJC-4 was identified asBacillus safensis. The two strains of YJC-4 and YBM-4 had significant antagonism against tobacco black shank. In paired cultures, relative inhibition rate of YJC-4 and YBM-4 reached 85.34% and 72.99%. In the pot experiment, effects of YBM-4 and YJC-4 on tobacco agronomic traits and biomass growth promoting were obvious. The control effects on tobacco black shank of YBM-4, YJC-4 and YBM-4+YJC-4 mixture (1：1 ratio) were 76.37%, 80.06% and 81.50%, with the AUDPC lower than that of the control group by 265.01, 281.58, and 287.32 respectively. YBM-4 and YJC-4 have a potential in bio-control of tobacco black shank.

bacteria; tobacco black shank; antagonism; growth; biocontrol potential

S435.72

1007-5119（2017）03-0044-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.008

貴州省煙草公司貴陽(yáng)市公司重大專項(xiàng)“貴陽(yáng)煙草主要病蟲草綠色防控技術(shù)集成示范與推廣”（201602）；中國(guó)煙草總公司四川省公司科技項(xiàng)目“煙草主要病蟲害綠色防控技術(shù)研究與應(yīng)用”（SCYC201604）

徐同偉（1990-），男，碩士研究生，主要研究方向是植物病害防治。E-mail：xutongwei123@126.com。*通信作者，E-mail：13963973187@126.com

2016-11-22

2017-03-24