左金丸血清藥物化學(xué)研究

龔夢鵑 周祥羽 岳 賀 李春苑 王淑美 梁生旺 鄒忠杰

廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室/ 廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

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左金丸血清藥物化學(xué)研究

龔夢鵑 周祥羽 岳 賀 李春苑 王淑美 梁生旺 鄒忠杰*

廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室/ 廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

目的：對左金丸血清藥物化學(xué)進行初步研究，通過分析入血成分探討左金丸在大鼠體內(nèi)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：通過比較左金丸水煎液、口服左金丸及單味生藥大鼠血清和空白血清HPLC圖譜，初步鑒定左金丸在大鼠血清中的移行成分。結(jié)果：口服左金丸水煎液后在大鼠血清中發(fā)現(xiàn)14個入血成分，其中5個為原型成分，9個為代謝產(chǎn)物。結(jié)論：該研究建立的方法可用于左金丸水煎液血清指紋圖譜和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

左金丸；血清藥物化學(xué)；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

中藥血清藥物化學(xué)是以傳統(tǒng)藥物化學(xué)方法為基礎(chǔ)，綜合利用色譜、質(zhì)譜等多種現(xiàn)代分析技術(shù)，分析鑒定口服中藥經(jīng)吸收后的血清中移行成分，研究其與藥效相關(guān)性，最終確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的應(yīng)用學(xué)科。該方法目前得到廣泛的認可和發(fā)展應(yīng)用，是研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的主要方法之一。目前，已利用中藥血清藥物化學(xué)方法確定了單味中藥及復(fù)方如杜仲[1]和三黃湯[2]等的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法》，方由黃連、吳茱萸(6∶1)組成，用于肝火犯胃、胃失和降所致的脘脅疼痛、口苦嘈雜、嘔吐吞酸等，主治胃實熱證。臨床上要用于肝火犯胃型急慢性胃炎、反流性食管炎、功能性胃腸疾病、慢性萎縮性胃炎、消化道潰瘍[3]等的治療。左金丸可以通過抗炎[4-5]來治療胃熱證。本課題組利用代謝組學(xué)的方法證實左金丸可以有效干預(yù)胃熱證大鼠紊亂的糖代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝[6]。目前，關(guān)于該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究還鮮有報道，本實驗采用中藥血清藥物化學(xué)的相關(guān)理論和研究方法對左金丸進行研究，旨在探求該復(fù)方發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-20A型紫外檢測器，DGU-20A5型真空脫氣機，CTO-10ASvp型柱溫箱，SIL-20AC自動進樣器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；Cosmosil 5C18-MS-II 柱(4.6 mm×250mm，5μm，日本NACALAI公司)；AG135型電子天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司)；1-14型低溫離心機(德國 Sigma 公司)；QF-3800氮氣吹干儀(紹興市衛(wèi)生醫(yī)療設(shè)備制造有限公司)。

1.2 藥品與試劑 黃連和吳茱萸飲片購自廣州采芝林藥店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院韓彬教授鑒定為正品。乙腈(批號：1506098)為色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司；屈臣氏蒸餾水；其余試劑為分析純。

鹽酸藥根堿(批號：15050712)、鹽酸小檗堿(批號：15010411)、鹽酸巴馬汀(批號：15032604)、表小檗堿(批號：15032526)、黃連堿(批號：15024568)、吳茱萸堿(批號：15032142)、吳茱萸次堿(批號：15042804)等對照品均購自北京天普標(biāo)準(zhǔn)品有限公司。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自中山大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(粵)2012-0125，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境設(shè)施中。

2 方法

2.1 左金丸、黃連、吳茱萸供試品溶液制備 黃連和吳茱萸以6∶1混合粉碎，10倍量蒸餾水浸泡1 h，煎煮2 h，雙層紗布濾過出藥汁，藥渣再加8倍水煎煮2h，濾出藥汁，合并兩次藥汁，加熱揮發(fā)至濃縮液(0.14 g生藥/mL)。濃縮液1.0mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖，超聲(功率100W，頻率 40kHz)3min，3500rpm離心 5min，取上清液過 0.45μm 濾膜，即得。稱取適量黃連和吳茱萸，分別10倍量蒸餾水浸泡1h，煎煮2h，雙層紗布濾過出藥汁，藥渣再加8倍水煎煮2h，濾出藥汁，合并兩次藥汁， 加熱揮發(fā)至黃連濃縮液(0.12g生藥/mL)、吳茱萸濃縮液(0.02g生藥/mL)，濃縮液1.0mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖，超聲(功率100W，頻率 40kHz)3min，3500rpm離心 5min，取上清液過 0.45μm 濾膜，即得。

2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取鹽酸藥根堿、黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿1mg，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。分別取各對照品溶液1mL，混合為混合對照品。

2.3 空白血清及含藥血清制備 取雄性SD大鼠，分為空白組和給藥組，灌胃前禁食12h，各給藥組分別灌服左金丸水煎液(1.4g生藥/kg)、黃連水煎液(1.2g生藥/kg)、吳茱萸水煎液(0.2g生藥/kg)，空白組灌服等量蒸餾水，1h后1%戊巴妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，收集的血液樣品室溫下凝固60min后在3500rpm條件下離心15min得到血清。血清加入4倍量甲醇，渦旋30s混勻，在10000 rpm條件下離心3min，取上清液，于40℃條件氮氣吹干后用100μL甲醇溶解，同上條件離心3min，取上清液，備用，供 HPLC 分析。

2.4 色譜條件 Cosmosil 5CI18-MS-II 柱(4.6 mm×250mm，5μm)；以乙腈為流動相A，以添加0.3%甲酸、0.1%三乙胺、氨水調(diào)PH至8.6的水溶液為流動相B，梯度洗脫，洗脫程序為：5%～10% A(0～5min)，10%～20% A(5～15min)，20%～40% A(15～30min)，40%～50% A(30～40min)，50%～70% A(40～50min)；柱溫28℃；檢測波長254nm；流速1mL/min；進樣量10μL，進樣前以流動相梯度初始條件平衡30 min。

2.5 左金丸及其血清中成分的分析 取左金丸供試品溶液、含藥血清、空白血清和混合對照品溶液在相同的色譜條件下進行HPLC分析，建立HPLC指紋圖譜，比較確定入血成分。

3 結(jié)果與討論

實驗通過比較單味飲片樣品、復(fù)方樣品、血清樣品及對照品對照圖譜的方法，采用相同的色譜條件進行檢測，以保留時間作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，對色譜峰進行分析指認。通過對多個采血時間點的血清樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)在大鼠灌胃左金丸水煎液60min后，血中移行成分較多，特征峰豐富，強度較大，故采用60min的血清樣品進行分析。實驗利用二極管陣列(DAD)檢測器進行紫外掃描檢測，在208、210、220、230、250、254、260、280、300和320nm 10個波長下檢測色譜圖，發(fā)現(xiàn)254nm下基線較平穩(wěn)，出峰較多，分離度較高，故確定為檢測波長。

在本實驗色譜條件下，經(jīng)與左金丸水煎液、單味飲片、含藥血清、空白血清比較分析確定入血成分的來源。大鼠灌胃左金丸水煎液的血清樣品中共檢測出14個移行成分(圖1)，其中5、8、9、11、12號峰是體外生藥中原型成分，1、2、3、4、6、7、10、13、14號峰推測為復(fù)方代謝產(chǎn)物，與對照品對比得知，8號峰是黃連堿，9號峰是表小檗堿，11號峰是鹽酸巴馬汀，12號峰鹽酸小檗堿。此外，左金丸水煎液成分主要體現(xiàn)與黃連有關(guān)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量很少。鄧雅婷等[7]曾研究表明黃連-吳茱萸藥對的不同比例配伍對各主要組分溶出的影響不同。來自吳茱萸藥材的成分隨著配伍黃連比例的增大溶出增加。本實驗中左金丸用到的黃連、吳茱萸以6∶1比例配伍，因此少量的吳茱萸配伍黃連后，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的溶出減少，左金丸水煎液和左金丸含藥血清中均無法檢測到。

黃連水煎液及其血清樣品色譜圖見圖2，大鼠黃連水煎液血清中共檢測出10個移行成分，其中6、8、9、10號峰為體外生藥原型成分，與對照品比較得知6號峰是鹽酸藥根堿，8號峰是黃連堿，9號峰是鹽酸巴馬汀，10號峰是鹽酸小檗堿，1、2、3、4、5、7號峰推測為黃連吸收入血代謝成分。左金丸含藥血清與黃連含藥血清相比，沒有鹽酸藥根堿的吸收峰，多了表小檗堿的吸收峰。因此，推測黃連在配伍吳茱萸后，入血成分鹽酸藥根堿被破壞，表小檗堿的入血質(zhì)量分數(shù)提高而被檢測到。

吳茱萸水煎液及其血清樣品見圖3，1號峰為吳茱萸入血代謝產(chǎn)物，2、3號峰經(jīng)與對照品比較，確定為吳茱萸煎和吳茱萸次堿，但在血清中沒有被檢測出，推測可能入血質(zhì)量分數(shù)太低或被機體代謝。

近年來，有學(xué)者利用色譜對單味藥黃連和吳茱萸中成分及配伍后進行研究，發(fā)現(xiàn)沒有新產(chǎn)生的吸收峰[8]，但黃連中生物堿溶出率明顯增高[9]。分析圖1和圖2可看出黃連在與吳茱萸配伍后被機體吸收成分明顯增多，3、10、13、14號峰是單味黃連所沒有的峰(圖1)，吳茱萸只有一個移行成分，為代謝產(chǎn)物(圖3)，配伍作用初步推測為輔助增加復(fù)方中有效成分吸收入血。

實驗運用HPLC法對左金丸血清藥物化學(xué)進行了研究，初步分析了左金丸的入血成分，血中移行成分主要來自黃連，黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿以原型成分吸收入血，初步推測其為治療胃熱證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

藥物血清化學(xué)成分的分析存在著含量低、組分多、分離難的特點，HPLC法僅適用于血清中有紫外吸收的成分，且靈敏度較低，亦無法對代產(chǎn)物進行定性[10]。因此，有待于結(jié)合更為靈敏的分析手段，進一步探究左金丸的體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)。

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Preliminary Study on Serum Pharmacochemistry of Zuojin Pill

GONG Mengjuan ZHOU Xiangyu YUE He LI Chunyuan WANG Shumei LIANG Shengwang ZOU Zhongjie*

School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM, Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province, Guangzhou 510006, China

Objective To carry out a preliminary study on serum pharmacochemistry of Zuojin Pill and to further explore its pharmacoldynamic material basis through analyzing the constituents absorbed into blood.Methods The prototype components and metabolites in rat serum were identified through analysis and comparison of the HPLC fingerprints of Zuojin Pill, rat serum obtained after oral administration of zuojin Pill or single crude drug and blank serum. Results After rats were administered with Zuojin Pill, 14 transitional constituents in blood were detected, among which 9 were metabolites and 5 were prototype constituents.Conclusion The method established in this study can be used to research the serum fingerprint and material foundation of Zuojin Pill.

Zuojin Pill; Serum Pharmacochemistry; Material Basis

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81403075，81603397)。

龔夢鵑(1983-)，女，漢族，副教授，研究方向為中藥藥效學(xué)研究。E-mail:gongmengjuan@139.com

鄒忠杰(1980-)，男，漢族，博士，教授，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: zouzhongjie@139.com

R284.1

A

1007-8517(2017)11-0056-04

2017-04-11 編輯：程鵬飛)