HPLC法測定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸的含量

付 林 古 銳 澤翁擁忠* 天喜格勒

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 3.馬爾康綠業(yè)生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 馬爾康 624000

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HPLC法測定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸的含量

付 林1古 銳2澤翁擁忠2*天喜格勒3

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 3.馬爾康綠業(yè)生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 馬爾康 624000

目的: 建立高效液相色譜法(HPLC)同時測定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸含量的方法，比較3種成分在不同部位以及牛蒡子不同炒制時間的含量。方法:采用Welchrom C18柱(5μm，4.6mm×250mm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測波長為280nm；柱溫為30℃。結(jié)果: 3種成分的進(jìn)樣量分別在4.2844～51.4128μg，0.3254～3.9048μg，0.3072～3.6864μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.64%，100.81%，97.92%，RSD值均小于1.5%；牛蒡葉和牛蒡根中幾乎沒有牛蒡子苷和牛蒡子苷元；牛蒡子所有炒制品與生品比較，三者的總含量均下降，炒制時間從10～40min時，牛蒡子苷、綠原酸的含量下降，牛蒡子苷元的含量增加。結(jié)論:該方法簡便、準(zhǔn)確，精密度、重復(fù)性良好，可為牛蒡子質(zhì)量控制提供依據(jù)，不同部位、炒制時間結(jié)果可以為牛蒡綜合開發(fā)提供依據(jù)。

HPLC；牛蒡子苷；牛蒡子苷元；綠原酸；含量測定

牛蒡子為菊科二年生草本牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實，由于藥用價值較高，全國各地亦有普遍栽培[1]。其可生用或炒用(炒牛蒡子)，用時搗碎，其藥性辛、苦、寒，歸肺、胃經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、利咽透疹、解毒消腫的功效，屬于發(fā)散風(fēng)熱藥[2]。現(xiàn)代研究表明，牛蒡子具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等多種藥理作用，而其主要含牛蒡子苷、牛蒡子苷元等木脂素類[3]，綠原酸等有機(jī)酸類和黃酮類等成分[4]。牛蒡根主要含硫炔類、多炔類、多酚類、揮發(fā)油、菊糖以及氨基酸等化學(xué)成分，具有抗菌、抗突變、防癌、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[5]。牛蒡葉主要含黃酮類、多糖、多酚類化合物，具有一定的抗氧化、抑菌作用[6]。此外，牛蒡還是藏藥—齊嵩的來源，被各地藏醫(yī)所用，而《晶珠本草》記載，齊嵩有破痞塊，除結(jié)石，舒脈之效[7]。研究采用HPLC法測定牛蒡中有效成分牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸的含量，并比較3種成分在牛蒡不同部位以及牛蒡子不同炒制時間的含量，為牛蒡的質(zhì)量控制和綜合開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010A島津高效液相色譜儀；SB-52000超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；ULUP-1-10T型超純水機(jī)(成都優(yōu)普超純水科技有限公司)。1.2 材料 牛蒡子苷對照品(批號：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>98.5%)；牛蒡子苷元對照品(批號：MUST-15093011，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.62%)；綠原酸對照品(批號：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>98.5%)；甲醇(色譜純)，甲醇(分析純)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 稱取綠原酸對照品0.01536g、牛蒡子苷對照品0.21422g、牛蒡子苷元對照品0.01627g，共同置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，制備成混合對照品儲備液。則綠原酸的濃度為0.3072mg/mL，牛蒡子苷的濃度為4.2844mg/mL，牛蒡子苷元的濃度為0.3254mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 取牛蒡子粉末(過60目篩)約0.5g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇約45mL，超聲提取30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18柱(5μm，4.6mm×250mm，柱號 W1021170)；流動相為甲醇-0.1%磷酸水(梯度洗脫：0～3min，30%甲醇；3～10min，30%～50%甲醇；10～30min，50%～65%甲醇)；流速為1.0mL/min；檢測波長為280nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10μL。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各對照品峰理論塔板數(shù)均大于5000，相鄰兩峰的分離度R大于1.5，系統(tǒng)適用性良好，各組分的色譜峰分離良好，色譜圖見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0μL，按照“2.3”項下的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。表明3種成分在線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系；強(qiáng)制過原點后，r值均能達(dá)到0.9999，可采用外表一點法計算該3種成分的含量。

表1 3種成分的線性關(guān)系

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.1”項下混合對照品儲備液，分別在0、2、6、8、24h時按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄3種成分各自的峰面積，計算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為0.85%，0.34%，0.97%，表明混合對照品儲備液在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.5.3 精密度試驗 精密量取“2.1”項下混合對照品儲備液5μL，按照“2.3”項下的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各自峰面積，并根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算相應(yīng)的RSD值，得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為1.19%、0.25%、1.46%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批次的牛蒡子粉末(過60目篩)各0.5g，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件,分別進(jìn)樣分析，記錄實驗數(shù)據(jù)，計算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分含量的RSD分別為0.76%、1.10%、0.69%。結(jié)果表明該試驗方法重復(fù)性良好。

2.5.5 耐用性試驗 取制備的同1份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、24h時，按照“2.3”項下色譜條件，依次進(jìn)樣分析，記錄3種成分各自的峰面積，計算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為1.49%、1.36%、1.43%，結(jié)果表明該供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含量的牛蒡子粉末(綠原酸為0.616%，牛蒡子苷為11.000%，牛蒡子苷元為0.887%，過60目篩)6份，每份約0.2g，精密稱定。并精密加入“2.1”項下混合對照品儲備液，使其與樣品中各成分含量相同或相近。按“2.2”項下方法制備加樣溶液，按照“2.3”項下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2～4。表明該試驗方法準(zhǔn)確度良好。

表2 綠原酸加樣回收率

表3 牛蒡子苷加樣回收率

表4 牛蒡子苷元加樣回收率

2.6 含量測定 取13批不同來源的牛蒡子、葉、根樣品，打粉，過60目篩；另從批號為“馬爾康”牛蒡子樣品中取出部分，將其分為4份，進(jìn)行炒制，炒制時間分別為10、20、30、40min，打粉，過60目篩。合計樣品批數(shù)為17批。分別從每1份粉末中稱取約0.5g，按“2.2”項下方法制得相應(yīng)供試品溶液,并按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)行含量測定,各成分含量見表5。

表5 牛蒡中3種成分含量測定結(jié)果 (n=2，%)

續(xù)表5

表5 牛蒡中3種成分含量測定結(jié)果 (n=2，%)

3 討論

本實驗前期對提取方法、提取溶劑種類和濃度、提取時間等因素進(jìn)行了考察。比較了超聲30min，超聲60min，回流30min3種方法，結(jié)果表明，超聲30min時牛蒡子中3種成分總含量最高，而回流提取操作不便，結(jié)果偏差較大；比較了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、無水乙醇4種提取溶劑。結(jié)果表明，用甲醇提取時，3種成分總含量最高；比較了超聲10、20、30、40、60min5個提取時間，結(jié)果表明，超聲30min時，3種成分總含量最高。因此，本實驗以甲醇為提取溶劑，超聲30min為提取方法。

流動相的選擇最初建立在文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上，以甲醇-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰型不好且分離不完全，因此改為甲醇-0.1%磷酸水，調(diào)整出“2.3”項下的梯度。用PDA檢測器在200～400nm波長進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸在326nm處有最大吸收，牛蒡子苷在277nm處有最大吸收，牛蒡子苷元在280nm處有最大吸收，綜合考慮故測定波長選定為280nm。

含量測定結(jié)果顯示，不同來源的牛蒡子，其3種成分獨(dú)自的含量以及總含量都相差較大，出于對牛蒡子有炒用和生用兩種用法的考慮，本文對“馬爾康”批次牛蒡子樣品炒制不同時間后測定含量。結(jié)果表明，所有炒制品與其生品比較，三者的總含量均下降；炒制時間從10～40min時，牛蒡子苷、綠原酸的含量有下降的趨勢，牛蒡子苷元的含量有增加的趨勢?？梢?，炒制時間對牛蒡子中此3種成分的含量有一定的影響。從結(jié)構(gòu)上來看，綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩(wěn)定部分，因此不能經(jīng)受高溫、強(qiáng)光及長時間加熱[9]。牛蒡子苷是苷元和糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)，水溶性較大，易被酶或酸水解，分子中又含內(nèi)酯環(huán)，可能存在熱不穩(wěn)定性。這種結(jié)果提示，不同來源的牛蒡子可能存在不同程度的受熱影響。此外，牛蒡葉和牛蒡根中幾乎沒有牛蒡子苷和牛蒡子苷元，這與前期的文獻(xiàn)[10]研究大致相符。

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Simultaneous Determinate the Content of Arctiin，Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L．by HPLC

FU Lin1GU Rui2ZEWENG Yongzhong2*TIANXI Gele3

1.College of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137，China; 2.College of Ethnic Medicine, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137，China; 3.Ma’erkang L ye Biotechnology Development Limited Liability Company, Ma’erkang 624000,China

Objective To establish a HPLC method for the content determination of Arctiin , Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L．a(chǎn)nd to make a comparison of content of this three components among different parts as well different time that ArctiiFructus fried. Methods The separation was carried on Welchrom C18(5μm , 4.6mm×250mm)column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric(gradient elution) at the flow rate of 1.0mL·min-1．The detection wavelength was set at 280nm．The column temperature was 30℃．Results The linear range were 4.2844～51.4128μg for Arctiin, 0.3254～3.9048μg for Arctigenin and 0.3072～3.6864μg for Chlorogenic acid． Average recovery rates were 99.64%，100.81%，97.92%, withRSDless than 1.5%． There was little Arctiin and Arctigenin both in Arctium lappa leaves and Arctium lappa root．Compared with ArctiiFructus that wasn’t fried, total content of three components in fried ArctiiFructus decreased. Content of Arctiin and Chlorogenic acid decreased while Arctigenin increased when frying time changed from 10 minutes to 40 minutes．Conclusion The HPLC method is accurate, reliable and reproducible to analyze three components in Arctium lappa L , which can provide the scientific basis for formulating the quality standard of ArctiiFructus．Results of different parts as well different time that ArctiiFructus fried can provide the scientific basis for comprehensive development of Arctium lappa L.

HPLC; Arctiin ; Arctigenin ; Chlorogenicacid ; Content determination

四川省科技支撐計劃(No：2015FZ0032)。

付林(1992-),女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥品種、質(zhì)量與資源開發(fā)。E-mail：1069902727@qq.com

澤翁擁忠(1982-)，男，藏族，碩士，講師，研究方向為民族醫(yī)學(xué)。E-mail：2549626645@qq.com

R932

A

1007-8517(2017)11-0039-04

2017-04-05 編輯：梁志慶)