RP-HPLC法同時(shí)測定人血清中奧氮平和富馬酸喹硫平濃度

劉 威 曹敏娟 尚 翔 姚樹永

蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000

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RP-HPLC法同時(shí)測定人血清中奧氮平和富馬酸喹硫平濃度

劉 威 曹敏娟 尚 翔 姚樹永*

蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000

目的：建立同時(shí)測定人血清中奧氮平、富馬酸喹硫平濃度的高效液相色譜法。方法：血清樣品以乙醚進(jìn)行提取并測定，Hypersil C18反相柱 (150mm×4.6mm, 5μm)為色譜柱，流動相為25mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0，內(nèi)含0.5%三乙胺)-乙腈(65∶35，V/V)，流速為1.0mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為254nm。結(jié)果：奧氮平在10.0～250.0μg、富馬酸喹硫平在50.0～1000.0μg范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系；奧氮平、富馬酸喹硫平的低、中、高3種濃度相對平均回收率分別為103.3%、100.8%、98.7% 和97.5%、98.2%、101.1%，日內(nèi)、日間RSD均低于10% (n=5)。奧氮平和富馬酸喹硫平的檢測限均為5.0μg/L。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于臨床奧氮平和富馬酸喹硫平的血藥濃度監(jiān)測。

高效液相色譜法；奧氮平；喹硫平；血藥濃度

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(包括G1314F紫外檢測器、G1316A柱溫箱、G1329B自動進(jìn)樣器、G1311C多元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、Agilent Chem32化學(xué)工作站)；KS-120D型超聲波清洗機(jī)(新芝儀器廠)；XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；電子分析天平(美國OHAUS)。1.2 材料 奧氮平(批號：100948-201501)、富馬酸喹硫平(批號：100815-201202)、阿米替林(批號100518-201303)對照品均源于中國食品藥品檢定研究院。奧氮平(批號：160204，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；喹硫平(批號：B151133，湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司)。

空白血清由蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院血站提供。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(pH6.0，內(nèi)含0.5%三乙胺)-乙腈(65∶35．V/V)，使用0.45μm微孔濾膜負(fù)壓過濾；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對照品和內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取奧氮平對照品與喹硫平對照品各1mg，分別置于10mL量瓶，加甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為 0.1mg/mL的對照品溶液置冰箱4℃保存。臨用時(shí)用甲醇稀釋成所需濃度的奧氮平與喹硫平對照品溶液。精密配制濃度為 2mg/L阿米替林甲醇溶液作為工作內(nèi)標(biāo)液。

2.3 樣品處理方法 取含奧氮平和喹硫平的血清樣品1mL，加內(nèi)標(biāo)10μL(2mg/L阿米替林)，并加入25%維生素C溶液10μL及1.0mol/L氫氧化鈉溶液0.2mL，快速震蕩數(shù)秒。加入乙醚4mL提取，在旋渦混合器上渦旋2min，靜置1h，取出醚層，置尖底試管中，于30℃水浴至干。殘?jiān)?00μL流動相復(fù)溶，取20μL進(jìn)樣分析。

2.4 色譜分離情況 在本實(shí)驗(yàn)條件下，空白血清、奧氮平與喹硫平對照品血清，以及精神病患者服藥后的血清樣品，經(jīng)高效液相色譜分析法測定，得到的色譜圖見圖1。由圖1可知，奧氮平、喹硫平和阿米替林內(nèi)標(biāo)物的色譜峰能夠完全分離。奧氮平、阿米替林和喹硫平的保留時(shí)間為4.7min、5.8min、8.3min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在7個(gè)具塞的離心管中分別加入空白血清1.0mL，再分別加入不同濃度、相同體積的奧氮平和喹硫平對照品溶液和內(nèi)標(biāo)物阿米替林，振蕩數(shù)秒，使血清奧氮平濃度分別為10、20、40、80、100、125、250μg/L，喹硫平為50、100、200、400、500、800、1000μg/L。然后按照“2.3”項(xiàng)處理后，經(jīng)高效液相色譜分析，測得奧氮平和喹硫平峰面積 (Ai), 內(nèi)標(biāo)物峰面積As, 以Ai/As比值為橫坐標(biāo),以血清樣品所對應(yīng)其各點(diǎn)濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)最小二乘法線性回歸，得到奧氮平10～250μg，喹硫平50～1000μg范圍的血清濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。奧氮平的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=0.3117Ai/As-3.2145 (r=0.9972)，喹硫平的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=0.2066Ai/As+2.1861 (r=0.9995)。當(dāng)信噪比(S/N)=3時(shí)，奧氮平與喹硫平的檢測定量下限可達(dá)到5μg/L。

2.6 回收率與精密度實(shí)驗(yàn) 取奧氮平質(zhì)量濃度為10、80、250μg/L的含藥血清樣品，喹硫平質(zhì)量濃度為50、400、800μg/L的血清樣品，經(jīng)色譜分析，得到的相對回收率均大于90%。同時(shí)在1d內(nèi)重復(fù)5次和2周內(nèi)重復(fù)5次測定濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間誤差和回收率。結(jié)果表明，該方法符合生物樣品分析要求。見表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法配制奧氮平質(zhì)量濃度為10、80、250μg/L，喹硫平質(zhì)量濃度為 50、400、800μg/L的血清樣品共18份(1式3份)，分別考察室溫放置4h、4℃冰箱放置24h、-20℃冰箱凍存1周后的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行色譜分析。結(jié)果未見凍存樣品的藥物降解，RSD均<15%。

表1 奧氮平和喹硫平的精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.8 樣品的質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)按照“2.3”項(xiàng)的方法分別配置奧氮平(10、80、250μg/L)和喹硫平(50、400、800μg/L)血清樣品共36個(gè)血清樣品(1式6份)，置于-20℃凍存?zhèn)溆脼橘|(zhì)控樣品。每次檢測血樣時(shí)同時(shí)檢測質(zhì)控樣品，如果相對回收率均落在85%～115%之內(nèi)即可認(rèn)為檢測正常，否則須檢查整個(gè)操作過程及儀器原因。

2.9 患者血樣測定 1例男性精神病患者，口服奧氮平15mg/d和喹硫平400mg/d。2周后早晨服藥前空腹采血檢測其血清藥物濃度。結(jié)果奧氮平為61.3μg/L，喹硫平為310.2μg/L。

3 討論

奧氮平和喹硫平結(jié)構(gòu)中都有苯環(huán)，紫外吸收明顯。奧氮平與喹硫平對照品溶液在190～400nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)喹硫平和奧氮平在254nm處均有強(qiáng)吸收峰，因此本實(shí)驗(yàn)選擇254nm作為最佳檢測波長。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫(25～40℃)、不同流速 (0.8～1.5 mL/min)、不同pH磷酸鹽緩沖液(4.0、6.0、6.86)的流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明柱溫為40℃、流速為1.0mL/min、流動相為磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)-乙腈(65∶35)時(shí)，柱效較高，主藥峰與雜質(zhì)峰能夠有效地分離。實(shí)驗(yàn)過程中分別使用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷為提取劑，發(fā)現(xiàn)乙醚的提取率最高，所取血清1mL，進(jìn)樣量20μL可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，提高了靈敏度，避免樣品雜質(zhì)的干擾，可達(dá)到分析目的。奧氮平在儲存和提取中易被空氣氧化，因此加入維生素C作為抗氧劑。

奧氮平和喹硫平血藥濃度具有治療窗窄、個(gè)體差異大等特點(diǎn)，因此進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測是必要的[9]。單獨(dú)檢測奧氮平和喹硫平藥物血藥濃度已有報(bào)道[6-8]，但還未見使用高效液相色譜法同時(shí)測定這兩種藥物的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)建立了人血清中奧氮平和喹硫平同時(shí)測定的方法，準(zhǔn)確、靈敏并能滿足臨床需要，可以用于臨床藥物監(jiān)測。

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RP-HPLC Method for the Determination of Human Plasma of Olanzapine and Quetiapine Concentration

LIU Wei CAO Minjuan SHANG Xiang YAO Shuyong*

Suzhou Psychiatric Hospital, Suzhou 215000,China

Objective To establish a method for determination olanzapine and quetiapine in human serum by RP-HPLC．Methods The analytes were extracted after serum samples had been alkalinized. The HPLC separation of the analytes was performed on a reversed-phase Hypersil C18column,using 25mmol·L-1phosphat buffer (pH6.0,containing 0.5% triethylamine)-acetonitrile (65∶35, V/V) as mobile phase, with a flow-rate of 1.0mL·min-1anda detective wavelength of 254nm．The temperature of the column was 40℃．Results The calibration curves were linear in the ranges of 10.0～250.0μg·L-1for olanzapine, 50.0～1000.0μg·L-1for quetiapine respectively. The relation of peak area and concentration showed linear in the range of the average recoveries of olanzapine and quetiapine at high,middle and low concentrations were 103.3%、100.8%、98.7% and 97.5%、98.2%、101.1% respectively. The intra-day and inter-day variationsRSDwere less than 10% (n=5). The minimum detectable concentration of both olanzapine and quetiapine were 5.0μg·L-1.Conclusion The method is accurate, sensitive and simple for routine therapeutic drug monitoring (TDM) and for the study of the pharmacokinetics of olanzapine and quetiapine.

RP-HPLC ; Olanzapine ; Quetiapine ; Serum Drug Concentration

劉威(1990-)，女，碩士研究生，臨床藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。E-mail:weiyuliu901118@163.com

姚樹永，男，本科副主任藥師。E-mail：15306215199@163.com

R914.1

A

1007-8517(2017)11-0036-03

2017-04-01 編輯：梁志慶)