食品轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)的方法驗(yàn)證研究

韓玥 郭錚蕾 李偉 徐姍

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局北京100026）

食品轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)的方法驗(yàn)證研究

韓玥 郭錚蕾 李偉 徐姍

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局北京100026）

按照歐盟聯(lián)合研究中心歐盟網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室方法驗(yàn)證工作組編制的指南文件要求，對(duì)SN/T1204-2003《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法》進(jìn)行方法驗(yàn)證，分別驗(yàn)證了DNA提取質(zhì)量、方法的重復(fù)性和相對(duì)檢出限3個(gè)指標(biāo)。驗(yàn)證結(jié)果顯示：選用的DNA提取試劑盒提取質(zhì)量合格；相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜25%，重復(fù)性良好；相對(duì)檢測(cè)限為0.2%轉(zhuǎn)基因含量。因此，該指南文件在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證中具有指導(dǎo)作用。

食品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)；定性檢測(cè)；方法驗(yàn)證

1 前言

在開始檢測(cè)之前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能夠正確地應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，如果標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生了變化，應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證[1]。驗(yàn)證需要識(shí)別相應(yīng)的人員能力、設(shè)施和環(huán)境、設(shè)備、檢測(cè)所需試劑耗材和標(biāo)物是否滿足檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的要求等。例如：檢測(cè)人員是否經(jīng)過(guò)有效培訓(xùn)、熟練掌握標(biāo)準(zhǔn)方法、具備相關(guān)的知識(shí)和能力，應(yīng)提供培訓(xùn)考核記錄；檢測(cè)所需的參考標(biāo)準(zhǔn)和參考物質(zhì)是否配備齊全，儀器設(shè)備（含輔助設(shè)備）的選用是否符合標(biāo)準(zhǔn)方法的要求，是否制定了總體的校準(zhǔn)計(jì)劃，是否經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)和確認(rèn)，且有證明記錄；設(shè)施和環(huán)境條件是否符合標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的要求，影響檢測(cè)結(jié)果的環(huán)境條件技術(shù)要求是否已文件化，并有驗(yàn)證記錄；檢測(cè)所需的記錄表格是否齊全、規(guī)范、適用，必要時(shí)，是否編制了作業(yè)指導(dǎo)書；標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的各項(xiàng)特性指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室能否實(shí)現(xiàn)，能否提供相關(guān)檢測(cè)的典型報(bào)告和不確定度評(píng)定報(bào)告；是否制定了質(zhì)量控制計(jì)劃，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等技術(shù)手段驗(yàn)證能否持續(xù)滿足標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的要求等。總之，實(shí)驗(yàn)室在將方法引入檢測(cè)之前，應(yīng)從“人”、“機(jī)”、“料”、“法”、“環(huán)”等方面驗(yàn)證其有能力按照標(biāo)準(zhǔn)方法開展檢測(cè)活動(dòng)。

在滿足了“人”、“機(jī)”、“料”、“環(huán)”的硬件要求后，還應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，如標(biāo)準(zhǔn)給出的精密度、線性范圍、定性檢測(cè)限和定量檢測(cè)限等方法特性指標(biāo)，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)或參加能力驗(yàn)證?！胺ā?，即標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的各項(xiàng)特性指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室能否實(shí)現(xiàn)，就成為了方法驗(yàn)證中最重要的技術(shù)內(nèi)容，也是實(shí)驗(yàn)室最應(yīng)著力驗(yàn)證的目標(biāo)。

由歐盟聯(lián)合研究中心（JRC）歐盟網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室（ENGL）方法驗(yàn)證工作組編制的《JRC科學(xué)技術(shù)報(bào)告-已經(jīng)確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)分析方法的驗(yàn)證》（Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods）[2]，由JRC作為指南性文件發(fā)布。該文件中詳細(xì)規(guī)定了如何對(duì)轉(zhuǎn)基因方法的特性指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。本文按照該指南要求，以SN/T1204-2003《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法》[3]為實(shí)例，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了方法驗(yàn)證，驗(yàn)證了該方法的DNA提取效率、重復(fù)性、相對(duì)檢測(cè)限3個(gè)特性指標(biāo)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

DNA提取試劑盒：QIAGENDNeasy?Plant Mini Kit；DEPC水：生工Sangon Biotech；PCR反應(yīng)預(yù)混液：AB TaqMan?Gene Expression Master Mix；引物、探針：生工生物工程公司合成；濃度為100%的GA21品系陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC），編號(hào)AOCS0407-B；玉米渣：超市購(gòu)買。

2.1.2 主要儀器

紫外分光光度儀：BECKMAN COULTER DU 800；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：ABI 7900；高速冷凍離心機(jī)：eppendorf Centrifuge 5810R；臺(tái)式小型離心機(jī)：eppendorf Centrifuge 5424；漩渦振蕩器：IKA MS2；PCR反應(yīng)管：Axygen；微量進(jìn)樣器：10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL，eppendorf。

2.2 方法

2.2.1 提取DNA

使用DNA提取試劑盒對(duì)濃度100%的GA21品系陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和超市購(gòu)買的純玉米渣進(jìn)行DNA提取。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取產(chǎn)物梯度稀釋為5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%濃度的工作液。

2.2.2 DNA提取質(zhì)量驗(yàn)收

對(duì)純玉米渣樣品每次同時(shí)進(jìn)行2份平行提取，連續(xù)3次進(jìn)行。2個(gè)平行提取的DNA進(jìn)行4倍梯度稀釋（1∶1、1∶4、1∶16、1∶64和1∶256），并對(duì)5個(gè)梯度稀釋點(diǎn)的ZEIN基因（玉米內(nèi)源基因）進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3 引物和探針合成

引物探針序列按照SN/T1204-2003標(biāo)準(zhǔn)中ZEIN基因（玉米內(nèi)源基因）和NOS基因（GA21品系結(jié)構(gòu)特異性基因）的序列合成，見表1。

表1 引物和探針序列

3 結(jié)果

3.1 DNA提取質(zhì)量驗(yàn)收

3次檢測(cè)結(jié)果見表2-表4、圖1-圖3。為了評(píng)估抑制劑的存在，4個(gè)稀釋度的樣品的Ct值用線性回歸計(jì)算得到一個(gè)等式。從線性回歸推算出“未稀釋”樣品的Ct值與同一個(gè)樣品的測(cè)量Ct值進(jìn)行對(duì)比。JRC指南中規(guī)定，當(dāng)同時(shí)滿足回歸線的斜率在-3.6到-3.1之間、判定系數(shù)（R2）≥0.98、工作液測(cè)量Ct和推算Ct的差＜0.5這3個(gè)條件時(shí)，證明該提取方法適宜，提取產(chǎn)物中不含抑制劑。其中，未稀釋濃度的推導(dǎo)Ct值用Excel函數(shù)中INTERCEPT求得。

表2 第一次試驗(yàn)

圖1 第一次試驗(yàn)斜率R2

表3 第二次試驗(yàn)

圖2 第二次試驗(yàn)斜率R2

表4 第三次試驗(yàn)

圖3 第三次試驗(yàn)斜率R2

結(jié)果顯示，3次試驗(yàn)的ΔCt分別為0.01、-0.21、-0.10，線性回歸方程的斜率分別為-3.26、-3.39、-3.49，R2系數(shù)分別為0.983、0.986、0.999，結(jié)果同時(shí)滿足JRC指南中規(guī)定的3個(gè)條件，證明使用QIAGENDNeasy?Plant Mini Kit試劑盒提取的產(chǎn)物中不含抑制劑，提取質(zhì)量合格，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 重復(fù)性驗(yàn)證

重復(fù)性（Repeatability）是使用相同方法和正確操作情況下，由同一操作人員、在同一試驗(yàn)室、使用同一儀器并在短期內(nèi)，作多個(gè)單次測(cè)試結(jié)果，在一定概率水平（一般指95%）兩個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的最大差值。使用可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（Repeatability standard deviation，RSDr）來(lái)衡量重復(fù)性的優(yōu)劣。

重復(fù)性適用于所有轉(zhuǎn)基因水平的測(cè)試，檢測(cè)條件（反應(yīng)量、PCR儀等）和日常檢測(cè)一致，至少要得到16個(gè)獨(dú)立測(cè)量結(jié)果。檢測(cè)的設(shè)計(jì)實(shí)例見圖4，每次對(duì)不同轉(zhuǎn)基因含量水平的兩個(gè)平行提取的DNA分別進(jìn)行4個(gè)擴(kuò)增，進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)。當(dāng)相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤25%時(shí)，證明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。選取5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%這5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，且含有接近檢測(cè)限的水平，檢測(cè)結(jié)果見表5、表6。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出的相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差見表7。

圖4 重復(fù)性、檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)例

表5 PCR Plate 1不同轉(zhuǎn)基因水平提取物檢測(cè)結(jié)果

表6 PCR Plate 2不同轉(zhuǎn)基因水平提取物檢測(cè)結(jié)果

表7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差

表7結(jié)果顯示，0.1%轉(zhuǎn)基因水平未全部檢出Ct值，其他4個(gè)濃度均全部檢出，且相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.154%、0.989%、1.226%、2.785%，均＜25%，證明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好。

3.3 相對(duì)檢測(cè)限

按照指南要求，還應(yīng)驗(yàn)證方法的相對(duì)檢測(cè)限（Relative LOD，LODrel），即以轉(zhuǎn)基因成分含量百分?jǐn)?shù)來(lái)表示的檢測(cè)限。

驗(yàn)證一個(gè)方法的LODrel可用一個(gè)低轉(zhuǎn)基因濃度陽(yáng)性對(duì)照樣品至少10次PCR平行來(lái)測(cè)量。如果所有平行結(jié)果都是陽(yáng)性，這表示LODrel低于或等于該陽(yáng)性對(duì)照水平。表7給出的5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量水平的16個(gè)檢測(cè)結(jié)果顯示，0.2%轉(zhuǎn)基因水平是16個(gè)平行全部檢出的最低濃度，故該標(biāo)準(zhǔn)方法的LODrel為0.2%。

4 討論

《JRC科學(xué)技術(shù)報(bào)告-已經(jīng)確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)分析方法的驗(yàn)證》適用于包括食品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)在內(nèi)的所有分子生物學(xué)檢測(cè)，充分考慮到了分子生物學(xué)檢測(cè)中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，并科學(xué)細(xì)化了驗(yàn)證步驟。盡管關(guān)注的是PCR方法的驗(yàn)證，但是DNA提取方法的評(píng)估是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樵谑称忿D(zhuǎn)基因檢測(cè)中DNA提取的質(zhì)量對(duì)最終結(jié)果有重要影響。該指南性文件在此指標(biāo)上給出了詳細(xì)規(guī)定，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，證明其具有良好的可操作性，便于實(shí)驗(yàn)室在日常引入新方法及方法發(fā)生變更時(shí)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)參考使用。

通過(guò)本文的實(shí)驗(yàn)研究可以看出，該指南性文件可用于指導(dǎo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室開展轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法驗(yàn)證工作，特別對(duì)分子生物學(xué)定量檢測(cè)的方法驗(yàn)證具有指導(dǎo)意義。

本文僅對(duì)分子生物學(xué)定性檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，后續(xù)可將該指南文件應(yīng)用于分子生物學(xué)定量檢測(cè)的方法驗(yàn)證中，實(shí)驗(yàn)室可以更好地對(duì)定量分子生物學(xué)方法進(jìn)行質(zhì)量控制。

5 結(jié)論

本文依據(jù)JRC指南性文件對(duì)SN/T1204-2003《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法》進(jìn)行了方法驗(yàn)證。驗(yàn)證了使用DNA提取試劑盒提取產(chǎn)物不含抑制劑；該方法重復(fù)性良好；該方法的相對(duì)檢測(cè)限為0.2%轉(zhuǎn)基因濃度水平。證明我實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)過(guò)程和結(jié)果能夠滿足SN/T1204-2003行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)需求，本文可作為實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證的實(shí)例參考使用，具有良好的可行性和適用性。

[1]ISO/IEC 17025檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求[S].

[2]JRC Scientific and Technical Reports-Verification of analytical methodsforGMOtestingwhenimplementinginterlaboratory validatedmethods.GuidancedocumentfromtheEuropean Network of GMO laboratories（ENGL）[S].

[3]SN/T1204-2003植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法[S].

The Study of Verification of the Qualitative Method for GMO Foods

HAN Yue，GUO Zhenglei，LI Wei，XU Shan
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026）

According to the requirements of Guidance document from the European Network of GMO laboratories（ENGL），weverificated＜SN/T1204-2003Protocolofthereal-timePCRfordetecting geneticallymodifiedplantsandtheirderivedproducts＞，includingDNAextraction，repeatabilityand LODrel.Results showed that DNA extraction kit is qualified.RSDr＜25%and LODrel is 0.2%GMO content.The guidance is applicable for laboratory to do verification when introduce new method and when the method changes.

GMO Testing in Foods；Qualitative Testing；Method Verification

Q789

E-mail：hany@bjciq.gov.cn

國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2015RB048）

2016-10-09