• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法的建立

    2017-07-05 13:55:07王彩霞林祥梅吳紹強徐賡
    質量安全與檢驗檢測 2017年1期
    關鍵詞:檢測方法

    王彩霞林祥梅吳紹強*徐賡

    (1.中國檢驗檢疫科學研究院北京100029;2.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局)

    牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法的建立

    王彩霞1林祥梅1吳紹強1*徐賡2

    (1.中國檢驗檢疫科學研究院北京100029;2.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局)

    選擇肝片吸蟲保守的核糖體DNA ITS-2區(qū)域設計引物和TaqMan探針,通過對反應體系和反應條件進行優(yōu)化,建立了實時熒光定量PCR檢測肝片吸蟲的方法。所構建方法檢測質粒模板DNA的動態(tài)范圍為1×100-1×106拷貝,敏感度可檢測到1拷貝質粒DNA,而且與華支睪吸蟲、姜片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲無交叉反應,特異性良好。以所建立的方法檢測蟲卵可以檢測到2個肝片吸蟲卵囊。結果表明,本研究所構建的牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法具有快速、靈敏和特異等優(yōu)點,可滿足養(yǎng)殖場和口岸牛羊及其肉制品肝片吸蟲的檢測需要。

    肝片吸蟲;實時熒光PCR;敏感性;特異性;檢測

    1 前言

    肝片吸蟲是危害牛羊等反芻動物最主要的寄生蟲之一,屬扁形動物門(Platyhelminthes)、吸蟲綱(Trematoda)、復殖目(Digenea)、片形科(Fascilolidea)、片形屬(Fasciola)。蟲體主要寄生于黃牛、水牛、綿羊、山羊、鹿和駱駝等反芻動物的肝臟膽管中,也寄生于豬和馬屬動物,還可感染貓、狗、豬、兔等多種野生動物[1]。因此,肝片吸蟲病是家畜及多種食草動物和野生動物的寄生蟲病,亦可感染人,屬人畜共患寄生蟲病。該病在世界各地均有發(fā)生,在我國的32個省市自治區(qū)都有發(fā)生,尤以畜牧業(yè)發(fā)達的內蒙、吉林、青海、寧夏等地區(qū)最嚴重[2]。肝片吸蟲病是農業(yè)部《一二三類動物疫病病種名錄》中的三類動物疫病,也列入了《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》(第〔2013〕號)中。

    肝片吸蟲病的病原包括肝片吸蟲和大片吸蟲2種,在非洲、東南亞以及我國等地區(qū)這兩種病原同時存在,而且這兩種病原危害同等嚴重,從蟲卵形態(tài)、免疫學等方面難以區(qū)分。目前,對該病的診斷只能根據流行病學資料、臨床癥狀、病理變化及糞便檢查等進行綜合判定,常常容易造成誤診。近幾年來,隨著免疫學和分子生物學技術的發(fā)展,不少學者在免疫學診斷和分子生物學檢測等方面開展了大量研究,使得對該病的診斷有了新的進展[3]。實時熒光定量PCR技術將熒光染料或熒光探針加入到PCR反應體系中,利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR反應進程,具有操作簡便、快速高效、高通量、高敏感性等特點,目前已成為動物病原檢測的重要方法[4]。本研究擬建立牛羊肝片吸蟲基因組DNA的熒光定量PCR檢測方法,用于牛羊肝片吸蟲病的檢測以及蟲卵的鑒別診斷。

    2 材料與方法

    2.1 材料

    2.1.1 試驗樣本

    新鮮肝片吸蟲:由廣西大學陳漢忠教授惠贈;對照樣品:華支睪吸蟲(clonorchis sinensis)由上海出入境檢驗檢疫局李樹清贈送,姜片吸蟲(fasciolopsis)、衛(wèi)氏并殖吸蟲(paragonimus westermani)由本實驗室保存。

    2.1.2 試劑

    DNA提取試劑盒:購自QIAGEN公司;PCR產物膠回收試劑盒:購自OMEGA公司;DNA擴增試劑盒、DNA Marker、克隆載體pMD18-T、JM109感受態(tài)細胞、Dilution Buffer:均購自TaKaRa公司。

    2.2 方法

    2.2.1 肝片吸蟲陽性克隆質粒的構建

    2.2.1.1 蟲體基因組DNA的提取

    取肝片吸蟲蟲體25 mg,按DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.1.2 引物設計與合成

    選取肝片吸蟲核糖體DNA序列中比較保守的ITS-2區(qū)域,利用軟件Primer5設計1對普通PCR擴增引物,FasITS2U:5’-ATAAACTATCACGACGCC CAAA-3’和FasITS2L:5’-AGCATCAGACACATGA CCAAG-3’,預期擴增片段長度為322 bp,用于構建重組克隆質粒,同時利用軟件Beacon Designer7.0設計1對熒光PCR引物和探針,FasITS-F:5’-ACCCTTGTCTTGGCAGAAAGC-3’,FasITS-R:5’-CAAACACACTGACAACTGAGTAC-C-3’,FasITSQ:5’-FAM-ACCCGATTATTAAACCACGATTCCGC CACT-ECLIPSE-3’,預期擴增片段長度為89 bp。引物合成后(Invitrogen),均稀釋為10 μmol/L,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.1.3 基因克隆及陽性質粒的構建

    以肝片吸蟲蟲體基因組DNA為模板,采用引物FasITS2U和FasITS2L進行PCR,擴增完畢,取PCR產物電泳并切膠回收(OMEGA,D2500-01)目的條帶克隆到pMD18-T載體(TaKaRa,D6011),轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(TaKaRa,D9052),經藍白斑篩選、PCR鑒定獲得含目的基因片段的重組質粒,純化(OMEGA,D6943-01)后測濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.2 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法的建立

    2.2.2.1 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法的反應體系與反應條件

    以肝片吸蟲陽性克隆質粒DNA為模板,建立肝片吸蟲熒光PCR檢測方法,反應體系組成為(25 μL):DNA模板1 μL,FasITS-F 1 μL,FasITS-R 1 μL,FasITS-Q 1 μL,2×preMix 12.5 μL,滅菌ddH2O補充至25 μL。

    熒光PCR反應條件為:95℃預變性5 min;95℃變性15 s,57℃退火30 s,擴增40個循環(huán),每個循環(huán)的第二步反應結束時檢測熒光。

    2.2.2.2 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法敏感性確定

    用Dilution Buffer(TaKaRa,9160)依次將質粒DNA進行10倍梯度稀釋至1.0×106、105、104、103、102、101、100拷貝/μL,檢測所建立肝片吸蟲熒光PCR方法的敏感性。

    2.2.2.3 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法特異性的檢測

    以肝片吸蟲蟲體基因組DNA為陽性對照,分別以華支睪吸蟲DNA、姜片吸蟲DNA、衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA作對照,同時以滅菌蒸餾水作為陰性對照,檢測所建立肝片吸蟲熒光PCR方法的特異性。

    2.2.3 肝片吸蟲蟲卵的實時熒光PCR檢測

    新鮮肝片吸蟲成蟲用生理鹽水沖洗后置于酒精中固定,待蟲體變直后,取出剪開卵巢,收集肝片吸蟲蟲卵,采用文獻[5]中介紹的方法分離單卵囊,然后分別取1、2、3、4、5個卵囊,經95℃煮沸10 min處理后,以肝片吸蟲熒光PCR方法進行檢測,同時設蒸餾水作為陰性對照、陽性質粒DNA作為陽性對照。

    3 結果

    3.1 陽性克隆的構建及測序結果

    以蟲體DNA為模板,以引物FasITS2U和FasITS2L進行PCR擴增,PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,可見322 bp的目的條帶(圖1)。切膠回收目的條帶,插入到載體pMD18-T中構建成重組質粒,陽性克隆質粒送北京華大基因研究中心有限公司測序,結果經在線Blast分析,與肝片吸蟲(Fasciola hapetita和Fasciola gigantic)相關基因的序列一致性達100%。提取質粒,用核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-100)測定濃度,計算拷貝數為1.0×1010拷貝/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    圖1 肝片吸蟲PCR產物電泳檢測結果

    3.2 肝片吸蟲熒光PCR檢測標準曲線的繪制及敏感性和特異性試驗

    以臨界循環(huán)數(Threshold cycle,Ct)為y軸,對應的質粒DNA標準品拷貝數的對數為x軸,制作標準曲線(圖2),得到的標準曲線擴增效率為112.2%,斜率為-3.060,反應的相關系數為0.995,基本符合理論要求。由敏感性試驗(圖3)可知,熒光定量PCR反應檢測的靈敏度為1拷貝的質粒DNA,其對應的Ct值為37.82,且擴增曲線為典型的S型曲線。特異性試驗表明,本研究所建立的肝片吸蟲熒光PCR檢測方法與試驗采用的其他寄生蟲基因組DNA無交叉反應(圖4),表明所設計的引物及TaqMan探針能夠滿足肝片吸蟲特異性檢測的需要。

    E=112.2%;R2=0.995;slope=-3.060圖2肝片吸蟲熒光PCR檢測方法標準曲線

    圖3 熒光PCR檢測肝片吸蟲質粒模板DNA的標準曲線

    圖4 肝片吸蟲熒光PCR檢測方法特異性試驗

    3.3 肝片吸蟲蟲卵的熒光PCR檢測

    以肝片吸蟲熒光PCR方法檢測1、2、3、4、5個卵囊,檢測結果如圖5所示,底限為2個卵囊。

    圖5 肝片吸蟲蟲卵的熒光PCR檢測結果

    4 討論

    在預防和治療牛羊肝片吸蟲時,早期診斷至關重要,此時的治療成本低,患畜恢復快[6]。近年來,隨著科學研究技術的發(fā)展,國內外學者在免疫法、血清酶診斷法、分子生物學檢測法等方面進行了大量的研究與應用,使該病的診斷得到不斷改進和提高。研究者一致認為酶聯(lián)免疫吸附試驗對診斷牛羊肝片吸蟲病具有敏感性強、特異性高、操作簡便的特點,是適合于早期診斷的一種檢測方法[3]。但是當根據流行病學或臨床癥狀檢測發(fā)現少量蟲卵時,由于肝片吸蟲蟲卵與姜片吸蟲等其他吸蟲屬蟲卵很難從形態(tài)上區(qū)別[7-9],單純從形態(tài)上來鑒定,常常容易造成誤診,因此需借助分子生物學手段來判定[10-11]。此外,分子生物學方法還可用于牛羊肉等加工制品肝片吸蟲攜帶情況的調查與監(jiān)測。

    5 結論

    本研究選擇肝片吸蟲保守的核糖體DNA ITS-2區(qū)域設計引物和TaqMan探針,建立了肝片吸蟲實時熒光定量PCR檢測方法。方法檢測敏感性高,最低檢測限可達到1拷貝質粒DNA,而且特異性良好,與華支睪吸蟲、姜片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲無交叉反應;檢測蟲卵可以檢測到2個肝片吸蟲卵囊。本方法以其快速、靈敏和特異的優(yōu)點,適用于牛羊肝臟等動物產品中肝片吸蟲的檢疫以及牛羊養(yǎng)殖場肝片吸蟲病的流行病學調查和監(jiān)測。

    [1]徐懷英,朱瑞良,趙宏坤.肝片吸蟲病診斷與防治研究進展[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病,2000,8(4):49-51.

    [2]李曉娟.肝片吸蟲重組GST、CatL蛋白及其DNA核酸聯(lián)合免疫初步研究[D].大慶:黑龍江八一農墾大學,2009年:1-4.

    [3]何博.牛、羊肝片吸蟲病診斷方法概述[J].畜牧業(yè),2010,(2):74-76.

    [4]周曉麗,朱國坡,李雪華,等.實時熒光定量PCR技術原理與應用[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(2):87-89.

    [5]龔振興,劉毅,劉增再,等.雞球蟲單卵囊分離技術與雛雞感染試驗[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(3):72-75.

    [6]高海英.牛羊肝片吸蟲病及其防控[J].畜牧與飼料科學,2015,36(10):125-126.

    [7]許世鍔,陸秀君,李緒瓊,等.肝片形吸蟲、布氏姜片吸蟲和日本血吸蟲毛蚴體表結構的比較觀察[J].汕頭大學學報,1988,3(2):47-52.

    [8]劉立恒,郭海寧,吳家斌.肝片吸蟲生活史各階段形態(tài)變化觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013,(24):33-34.

    [9]許鵬如.布氏姜片吸蟲Fasciolopsis buski(Lankester,1857)Odhner,1902生活史的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,1962,5(2):143-162.

    [10]Le T H,Nguyen K T,Doan H T,et al.Development and Evaluation of a Single-Step Duplex PCR for Simultaneous Detection of Fasciola hepatica and Fasciola gigantic(Family Fasciolidae,Class Trematoda,Phylum Platyhelminthes)[J].J Clin Microbiol,2012,50(8):2720-2726.

    [11]Alasaad S,Soriguer R C,Abu-Madi M,et al.A TaqMan realtime PCR-based assay for the identification of Fasciola spp[J].Vet Parasitol,2011,179(1-3):266-271.

    Establishment of Real Time PCR Method for Detection of Fasciolosis in Bovine and Sheep

    WANG Caixia1,LIN Xiangmei1,WU Shaoqiang1*,XU Geng2
    (1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing,100029;2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan City of Shandong Province)

    To facilitate rapid and sensitive diagnosis of Fasciolosis,the real time TaqMan PCR method was developed to detect Fasciolosis infection in bovine and sheep.The primers and Taqman probe were designed and chosen to amplify the conserved internal transcript spacer 2(ITS-2)segment of genus Fasciolosis ribosomal DNA.The sensitivity and specificity of the developed method were examined using the plasmid containing the targeted ITS-2 fragment as template.The primers and probe were specific enough to distinguish Fasciolosis from clonorchis sinensis,fasciolopsis and paragonimus westermani.The dynamic range of the developed method was between 1×100and 1×106copies,meaning that the target DNA could be reliably detected and quantified for plasmid template DNA at a concentration as low as one copy.Two fasciola oocysts could be detected by this real time PCR method.In conclusion,the real time PCR method is rapid,sensitive and specific for Fasciolosis,and can be used to inspect Fasciolosis in the farm and for quarantine use.

    Fasciolosis;Real-time PCR;Sensitivity;Specificity;Detection

    Q789

    E-mail:friday128@sina.com;*通信作者E-mail:sqwu@sina.com

    “十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAK11B04)、(2013BAD12B01)

    2016-10-20

    猜你喜歡
    檢測方法
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    學習方法
    可能是方法不對
    小波變換在PCB缺陷檢測中的應用
    用對方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    七月丁香在线播放| 一二三四在线观看免费中文在| 韩国av在线不卡| 久久久久久人人人人人| 1024香蕉在线观看| 日本av免费视频播放| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲国产精品成人久久小说| tube8黄色片| 精品酒店卫生间| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产精品一区三区| 久久精品久久久久久久性| 久热这里只有精品99| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 在线观看三级黄色| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品嫩草影院av在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久午夜福利片| 999久久久国产精品视频| 在线精品无人区一区二区三| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品少妇内射三级| 在线观看人妻少妇| 国产男女超爽视频在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品在线美女| 黄色一级大片看看| 少妇人妻久久综合中文| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久狼人影院| 这个男人来自地球电影免费观看 | 九色亚洲精品在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区二区激情短视频 | 极品人妻少妇av视频| 人人妻人人澡人人看| xxx大片免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 我的亚洲天堂| 国产成人av激情在线播放| av一本久久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲综合精品二区| 国产精品熟女久久久久浪| 下体分泌物呈黄色| 黄色毛片三级朝国网站| 国产1区2区3区精品| 婷婷色综合www| a 毛片基地| 老汉色∧v一级毛片| 国产在线一区二区三区精| 91成人精品电影| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲国产看品久久| 18禁国产床啪视频网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老司机亚洲免费影院| 久久精品久久久久久久性| 老女人水多毛片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| av网站免费在线观看视频| 伊人亚洲综合成人网| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美精品av麻豆av| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧洲日产国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美成人午夜免费资源| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲男人天堂网一区| 免费大片黄手机在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜日本视频在线| 观看av在线不卡| 最黄视频免费看| 中文字幕色久视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 如何舔出高潮| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲欧美一区二区三区国产| 少妇的逼水好多| 国产黄色免费在线视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲三区欧美一区| 99re6热这里在线精品视频| 日韩伦理黄色片| 大片免费播放器 马上看| 国产野战对白在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久久久久免费视频了| 高清在线视频一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 夫妻午夜视频| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 午夜久久久在线观看| 99热全是精品| 国产男女超爽视频在线观看| 一级毛片电影观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲情色 制服丝袜| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲中文av在线| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美黄色片欧美黄色片| 女人精品久久久久毛片| 国产精品免费视频内射| 国产不卡av网站在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 中国国产av一级| 久热久热在线精品观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区三区激情视频| 香蕉丝袜av| 有码 亚洲区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产探花极品一区二区| 精品久久蜜臀av无| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 满18在线观看网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产乱人偷精品视频| 国产成人精品久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 丝袜人妻中文字幕| 精品国产国语对白av| 成年动漫av网址| 青草久久国产| 久久精品国产综合久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩中字成人| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av.av天堂| 午夜激情av网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 老司机影院毛片| 国产成人精品婷婷| 国产一级毛片在线| 边亲边吃奶的免费视频| 久久 成人 亚洲| 一级爰片在线观看| av在线观看视频网站免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久亚洲中文字幕| av免费观看日本| av电影中文网址| 午夜免费观看性视频| 日本av免费视频播放| videossex国产| 精品人妻在线不人妻| 午夜av观看不卡| 我要看黄色一级片免费的| 宅男免费午夜| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av免费在线看不卡| 国产精品久久久久久精品古装| 99国产综合亚洲精品| 丰满乱子伦码专区| 91成人精品电影| 只有这里有精品99| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| 午夜日本视频在线| 黄片播放在线免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久久人人人人人| 性色av一级| 精品一区二区三卡| 国产在线免费精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久 成人 亚洲| 日韩电影二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产综合久久久| h视频一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 有码 亚洲区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩av不卡免费在线播放| 青草久久国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲国产av新网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲,一卡二卡三卡| av国产久精品久网站免费入址| 婷婷色综合www| 97人妻天天添夜夜摸| 久久久久久久国产电影| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 黄片小视频在线播放| 不卡视频在线观看欧美| 香蕉丝袜av| 只有这里有精品99| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品久久蜜臀av无| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日日爽夜夜爽网站| 精品久久久精品久久久| 国产精品免费视频内射| 一级毛片 在线播放| 国产成人精品婷婷| 国产一区二区 视频在线| 热re99久久国产66热| 一级a爱视频在线免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 在线观看免费视频网站a站| 成人免费观看视频高清| av在线观看视频网站免费| 在线观看三级黄色| 丰满迷人的少妇在线观看| 丰满少妇做爰视频| 久久精品夜色国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩电影二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品欧美亚洲77777| 国产1区2区3区精品| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美在线黄色| 尾随美女入室| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 日本wwww免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 97在线人人人人妻| 亚洲第一青青草原| 免费观看av网站的网址| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人精品婷婷| 美女福利国产在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲图色成人| 1024香蕉在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美bdsm另类| 男女高潮啪啪啪动态图| 婷婷色综合www| 99久久人妻综合| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 搡老乐熟女国产| 在现免费观看毛片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产毛片在线视频| 永久网站在线| 久久这里只有精品19| 2018国产大陆天天弄谢| 国产免费一区二区三区四区乱码| 999精品在线视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 精品福利永久在线观看| 性少妇av在线| 我的亚洲天堂| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲第一青青草原| 久久99一区二区三区| 性少妇av在线| 毛片一级片免费看久久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99re6热这里在线精品视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品第一国产精品| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲,欧美精品.| 成人毛片60女人毛片免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 天堂8中文在线网| 热99国产精品久久久久久7| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲欧美精品自产自拍| 视频区图区小说| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲第一青青草原| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 丝袜人妻中文字幕| 色哟哟·www| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久人妻| 国产欧美亚洲国产| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看国产h片| 日韩一区二区三区影片| 久久这里有精品视频免费| 大陆偷拍与自拍| 国产麻豆69| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久av美女十八| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 美国免费a级毛片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人精品福利久久| a 毛片基地| 婷婷色av中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产成人欧美| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久免费观看电影| 97在线视频观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 免费少妇av软件| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久久久伊人网av| 丰满少妇做爰视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美bdsm另类| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品国产av蜜桃| 捣出白浆h1v1| 亚洲天堂av无毛| 亚洲 欧美一区二区三区| 美女视频免费永久观看网站| 国产在线免费精品| 成人黄色视频免费在线看| 制服人妻中文乱码| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一区二区三区精品91| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 精品久久蜜臀av无| 男人爽女人下面视频在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 1024视频免费在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费看av在线观看网站| av有码第一页| 欧美日韩一级在线毛片| av卡一久久| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲综合色惰| 高清欧美精品videossex| 国产精品久久久av美女十八| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 蜜桃在线观看..| 一区在线观看完整版| 日本av手机在线免费观看| 中文字幕亚洲精品专区| 成人亚洲欧美一区二区av| 中国三级夫妇交换| 国产黄色视频一区二区在线观看| kizo精华| 99香蕉大伊视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产xxxxx性猛交| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日韩欧美精品免费久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人av激情在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 免费av中文字幕在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品.久久久| 久久这里只有精品19| 国产成人aa在线观看| 五月开心婷婷网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 婷婷成人精品国产| 国产成人精品在线电影| 精品久久蜜臀av无| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产成人av激情在线播放| 999久久久国产精品视频| 成人毛片60女人毛片免费| 青春草亚洲视频在线观看| 韩国av在线不卡| 九草在线视频观看| 亚洲综合色网址| 亚洲成人一二三区av| 人体艺术视频欧美日本| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲五月色婷婷综合| 免费大片黄手机在线观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产 一区精品| 免费av中文字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜福利网站1000一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产欧美亚洲国产| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 青春草亚洲视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 久久久久久久久久久久大奶| 色视频在线一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产免费一区二区三区四区乱码| 少妇的逼水好多| 亚洲伊人久久精品综合| 秋霞在线观看毛片| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品第一国产精品| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品亚洲av国产电影网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 女性生殖器流出的白浆| 一边亲一边摸免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲第一区二区三区不卡| 黄片播放在线免费| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲综合精品二区| 黄片小视频在线播放| 七月丁香在线播放| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 精品第一国产精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 香蕉国产在线看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99re6热这里在线精品视频| 日韩三级伦理在线观看| 久热久热在线精品观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 91精品伊人久久大香线蕉| 18禁国产床啪视频网站| 国产97色在线日韩免费| 另类精品久久| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲欧美一区二区三区久久| 两个人免费观看高清视频| 亚洲av.av天堂| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美精品一区二区大全| 精品国产国语对白av| 欧美人与善性xxx| www.精华液| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品一国产av| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩综合久久久久久| 国产高清国产精品国产三级| tube8黄色片| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美av亚洲av综合av国产av | 男的添女的下面高潮视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 蜜桃在线观看..| 777米奇影视久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区二区三区精品91| 曰老女人黄片| 国产精品av久久久久免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久热这里只有精品99| 精品久久蜜臀av无| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 18在线观看网站| 国产 精品1| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 两个人看的免费小视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 另类亚洲欧美激情| 欧美中文综合在线视频| 欧美av亚洲av综合av国产av | 99香蕉大伊视频| 久久久精品区二区三区| av网站免费在线观看视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人精品福利久久| 我的亚洲天堂| 18+在线观看网站| 国产精品 欧美亚洲| 免费少妇av软件| 女人精品久久久久毛片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成人手机av| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av日韩在线播放| 最近手机中文字幕大全| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲 欧美一区二区三区| 人妻一区二区av| 国产人伦9x9x在线观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品无大码| 国产精品一二三区在线看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲三区欧美一区| 黄片无遮挡物在线观看| 妹子高潮喷水视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美成人午夜精品| 1024视频免费在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 综合色丁香网| 伦精品一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久久视频综合| 一个人免费看片子| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 97在线人人人人妻| 国产成人91sexporn| 亚洲国产精品国产精品| 日本wwww免费看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产乱人偷精品视频| 少妇人妻久久综合中文| 高清在线视频一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 97在线人人人人妻| 亚洲av.av天堂| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲成国产人片在线观看| 国产成人精品一,二区| 久久久国产一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产亚洲最大av| 亚洲,欧美精品.| 人人澡人人妻人| 国产一区二区三区综合在线观看| 看免费av毛片| 女性生殖器流出的白浆| 午夜日韩欧美国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 热99国产精品久久久久久7| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩 亚洲 欧美在线| 超色免费av| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲伊人色综图|