牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法的建立

王彩霞林祥梅吳紹強*徐賡

（1.中國檢驗檢疫科學研究院北京100029；2.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局）

牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法的建立

王彩霞1林祥梅1吳紹強1*徐賡2

（1.中國檢驗檢疫科學研究院北京100029；2.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局）

選擇肝片吸蟲保守的核糖體DNA ITS-2區(qū)域設計引物和TaqMan探針，通過對反應體系和反應條件進行優(yōu)化，建立了實時熒光定量PCR檢測肝片吸蟲的方法。所構(gòu)建方法檢測質(zhì)粒模板DNA的動態(tài)范圍為1×100-1×106拷貝，敏感度可檢測到1拷貝質(zhì)粒DNA，而且與華支睪吸蟲、姜片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲無交叉反應，特異性良好。以所建立的方法檢測蟲卵可以檢測到2個肝片吸蟲卵囊。結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的牛羊肝片吸蟲病實時熒光PCR檢測方法具有快速、靈敏和特異等優(yōu)點，可滿足養(yǎng)殖場和口岸牛羊及其肉制品肝片吸蟲的檢測需要。

肝片吸蟲；實時熒光PCR；敏感性；特異性；檢測

1 前言

肝片吸蟲是危害牛羊等反芻動物最主要的寄生蟲之一，屬扁形動物門（Platyhelminthes）、吸蟲綱（Trematoda）、復殖目（Digenea）、片形科（Fascilolidea）、片形屬（Fasciola）。蟲體主要寄生于黃牛、水牛、綿羊、山羊、鹿和駱駝等反芻動物的肝臟膽管中，也寄生于豬和馬屬動物，還可感染貓、狗、豬、兔等多種野生動物[1]。因此，肝片吸蟲病是家畜及多種食草動物和野生動物的寄生蟲病，亦可感染人，屬人畜共患寄生蟲病。該病在世界各地均有發(fā)生，在我國的32個省市自治區(qū)都有發(fā)生，尤以畜牧業(yè)發(fā)達的內(nèi)蒙、吉林、青海、寧夏等地區(qū)最嚴重[2]。肝片吸蟲病是農(nóng)業(yè)部《一二三類動物疫病病種名錄》中的三類動物疫病，也列入了《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》（第〔2013〕號）中。

肝片吸蟲病的病原包括肝片吸蟲和大片吸蟲2種，在非洲、東南亞以及我國等地區(qū)這兩種病原同時存在，而且這兩種病原危害同等嚴重，從蟲卵形態(tài)、免疫學等方面難以區(qū)分。目前，對該病的診斷只能根據(jù)流行病學資料、臨床癥狀、病理變化及糞便檢查等進行綜合判定，常常容易造成誤診。近幾年來，隨著免疫學和分子生物學技術的發(fā)展，不少學者在免疫學診斷和分子生物學檢測等方面開展了大量研究，使得對該病的診斷有了新的進展[3]。實時熒光定量PCR技術將熒光染料或熒光探針加入到PCR反應體系中，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR反應進程，具有操作簡便、快速高效、高通量、高敏感性等特點，目前已成為動物病原檢測的重要方法[4]。本研究擬建立牛羊肝片吸蟲基因組DNA的熒光定量PCR檢測方法，用于牛羊肝片吸蟲病的檢測以及蟲卵的鑒別診斷。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣本

新鮮肝片吸蟲：由廣西大學陳漢忠教授惠贈；對照樣品：華支睪吸蟲（clonorchis sinensis）由上海出入境檢驗檢疫局李樹清贈送，姜片吸蟲（fasciolopsis）、衛(wèi)氏并殖吸蟲（paragonimus westermani）由本實驗室保存。

2.1.2 試劑

DNA提取試劑盒：購自QIAGEN公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒：購自OMEGA公司；DNA擴增試劑盒、DNA Marker、克隆載體pMD18-T、JM109感受態(tài)細胞、Dilution Buffer：均購自TaKaRa公司。

2.2 方法

2.2.1 肝片吸蟲陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2.1.1 蟲體基因組DNA的提取

取肝片吸蟲蟲體25 mg，按DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.2 引物設計與合成

選取肝片吸蟲核糖體DNA序列中比較保守的ITS-2區(qū)域，利用軟件Primer5設計1對普通PCR擴增引物，F(xiàn)asITS2U：5’-ATAAACTATCACGACGCC CAAA-3’和FasITS2L：5’-AGCATCAGACACATGA CCAAG-3’，預期擴增片段長度為322 bp，用于構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，同時利用軟件Beacon Designer7.0設計1對熒光PCR引物和探針，F(xiàn)asITS-F：5’-ACCCTTGTCTTGGCAGAAAGC-3’，F(xiàn)asITS-R：5’-CAAACACACTGACAACTGAGTAC-C-3’，F(xiàn)asITSQ：5’-FAM-ACCCGATTATTAAACCACGATTCCGC CACT-ECLIPSE-3’，預期擴增片段長度為89 bp。引物合成后（Invitrogen），均稀釋為10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.3 基因克隆及陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

以肝片吸蟲蟲體基因組DNA為模板，采用引物FasITS2U和FasITS2L進行PCR，擴增完畢，取PCR產(chǎn)物電泳并切膠回收（OMEGA，D2500-01）目的條帶克隆到pMD18-T載體（TaKaRa，D6011），轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞（TaKaRa，D9052），經(jīng)藍白斑篩選、PCR鑒定獲得含目的基因片段的重組質(zhì)粒，純化（OMEGA，D6943-01）后測濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法的建立

2.2.2.1 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法的反應體系與反應條件

以肝片吸蟲陽性克隆質(zhì)粒DNA為模板，建立肝片吸蟲熒光PCR檢測方法，反應體系組成為（25 μL）：DNA模板1 μL，F(xiàn)asITS-F 1 μL，F(xiàn)asITS-R 1 μL，F(xiàn)asITS-Q 1 μL，2×preMix 12.5 μL，滅菌ddH2O補充至25 μL。

熒光PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，57℃退火30 s，擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)的第二步反應結(jié)束時檢測熒光。

2.2.2.2 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法敏感性確定

用Dilution Buffer（TaKaRa，9160）依次將質(zhì)粒DNA進行10倍梯度稀釋至1.0×106、105、104、103、102、101、100拷貝/μL，檢測所建立肝片吸蟲熒光PCR方法的敏感性。

2.2.2.3 肝片吸蟲實時熒光PCR檢測方法特異性的檢測

以肝片吸蟲蟲體基因組DNA為陽性對照，分別以華支睪吸蟲DNA、姜片吸蟲DNA、衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA作對照，同時以滅菌蒸餾水作為陰性對照，檢測所建立肝片吸蟲熒光PCR方法的特異性。

2.2.3 肝片吸蟲蟲卵的實時熒光PCR檢測

新鮮肝片吸蟲成蟲用生理鹽水沖洗后置于酒精中固定，待蟲體變直后，取出剪開卵巢，收集肝片吸蟲蟲卵，采用文獻[5]中介紹的方法分離單卵囊，然后分別取1、2、3、4、5個卵囊，經(jīng)95℃煮沸10 min處理后，以肝片吸蟲熒光PCR方法進行檢測，同時設蒸餾水作為陰性對照、陽性質(zhì)粒DNA作為陽性對照。

3 結(jié)果

3.1 陽性克隆的構(gòu)建及測序結(jié)果

以蟲體DNA為模板，以引物FasITS2U和FasITS2L進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見322 bp的目的條帶（圖1）。切膠回收目的條帶，插入到載體pMD18-T中構(gòu)建成重組質(zhì)粒，陽性克隆質(zhì)粒送北京華大基因研究中心有限公司測序，結(jié)果經(jīng)在線Blast分析，與肝片吸蟲（Fasciola hapetita和Fasciola gigantic）相關基因的序列一致性達100%。提取質(zhì)粒，用核酸蛋白測定儀（NanoDrop ND-100）測定濃度，計算拷貝數(shù)為1.0×1010拷貝/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 肝片吸蟲PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

3.2 肝片吸蟲熒光PCR檢測標準曲線的繪制及敏感性和特異性試驗

以臨界循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）為y軸，對應的質(zhì)粒DNA標準品拷貝數(shù)的對數(shù)為x軸，制作標準曲線（圖2），得到的標準曲線擴增效率為112.2%，斜率為-3.060，反應的相關系數(shù)為0.995，基本符合理論要求。由敏感性試驗（圖3）可知，熒光定量PCR反應檢測的靈敏度為1拷貝的質(zhì)粒DNA，其對應的Ct值為37.82，且擴增曲線為典型的S型曲線。特異性試驗表明，本研究所建立的肝片吸蟲熒光PCR檢測方法與試驗采用的其他寄生蟲基因組DNA無交叉反應（圖4），表明所設計的引物及TaqMan探針能夠滿足肝片吸蟲特異性檢測的需要。

E=112.2%；R2=0.995；slope=-3.060圖2肝片吸蟲熒光PCR檢測方法標準曲線

圖3 熒光PCR檢測肝片吸蟲質(zhì)粒模板DNA的標準曲線

圖4 肝片吸蟲熒光PCR檢測方法特異性試驗

3.3 肝片吸蟲蟲卵的熒光PCR檢測

以肝片吸蟲熒光PCR方法檢測1、2、3、4、5個卵囊，檢測結(jié)果如圖5所示，底限為2個卵囊。

圖5 肝片吸蟲蟲卵的熒光PCR檢測結(jié)果

4 討論

在預防和治療牛羊肝片吸蟲時，早期診斷至關重要，此時的治療成本低，患畜恢復快[6]。近年來，隨著科學研究技術的發(fā)展，國內(nèi)外學者在免疫法、血清酶診斷法、分子生物學檢測法等方面進行了大量的研究與應用，使該病的診斷得到不斷改進和提高。研究者一致認為酶聯(lián)免疫吸附試驗對診斷牛羊肝片吸蟲病具有敏感性強、特異性高、操作簡便的特點，是適合于早期診斷的一種檢測方法[3]。但是當根據(jù)流行病學或臨床癥狀檢測發(fā)現(xiàn)少量蟲卵時，由于肝片吸蟲蟲卵與姜片吸蟲等其他吸蟲屬蟲卵很難從形態(tài)上區(qū)別[7-9]，單純從形態(tài)上來鑒定，常常容易造成誤診，因此需借助分子生物學手段來判定[10-11]。此外，分子生物學方法還可用于牛羊肉等加工制品肝片吸蟲攜帶情況的調(diào)查與監(jiān)測。

5 結(jié)論

本研究選擇肝片吸蟲保守的核糖體DNA ITS-2區(qū)域設計引物和TaqMan探針，建立了肝片吸蟲實時熒光定量PCR檢測方法。方法檢測敏感性高，最低檢測限可達到1拷貝質(zhì)粒DNA，而且特異性良好，與華支睪吸蟲、姜片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲無交叉反應；檢測蟲卵可以檢測到2個肝片吸蟲卵囊。本方法以其快速、靈敏和特異的優(yōu)點，適用于牛羊肝臟等動物產(chǎn)品中肝片吸蟲的檢疫以及牛羊養(yǎng)殖場肝片吸蟲病的流行病學調(diào)查和監(jiān)測。

[1]徐懷英，朱瑞良，趙宏坤.肝片吸蟲病診斷與防治研究進展[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2000，8（4）：49-51.

[2]李曉娟.肝片吸蟲重組GST、CatL蛋白及其DNA核酸聯(lián)合免疫初步研究[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2009年：1-4.

[3]何博.牛、羊肝片吸蟲病診斷方法概述[J].畜牧業(yè)，2010，（2）：74-76.

[4]周曉麗，朱國坡，李雪華，等.實時熒光定量PCR技術原理與應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：87-89.

[5]龔振興，劉毅，劉增再，等.雞球蟲單卵囊分離技術與雛雞感染試驗[J].動物醫(yī)學進展，2006，27（3）：72-75.

[6]高海英.牛羊肝片吸蟲病及其防控[J].畜牧與飼料科學，2015，36（10）：125-126.

[7]許世鍔，陸秀君，李緒瓊，等.肝片形吸蟲、布氏姜片吸蟲和日本血吸蟲毛蚴體表結(jié)構(gòu)的比較觀察[J].汕頭大學學報，1988，3（2）：47-52.

[8]劉立恒，郭海寧，吳家斌.肝片吸蟲生活史各階段形態(tài)變化觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，（24）：33-34.

[9]許鵬如.布氏姜片吸蟲Fasciolopsis buski（Lankester，1857）Odhner，1902生活史的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，1962，5（2）：143-162.

[10]Le T H，Nguyen K T，Doan H T，et al.Development and Evaluation of a Single-Step Duplex PCR for Simultaneous Detection of Fasciola hepatica and Fasciola gigantic（Family Fasciolidae，Class Trematoda，Phylum Platyhelminthes）[J].J Clin Microbiol，2012，50（8）：2720-2726.

[11]Alasaad S，Soriguer R C，Abu-Madi M，et al.A TaqMan realtime PCR-based assay for the identification of Fasciola spp[J].Vet Parasitol，2011，179（1-3）：266-271.

Establishment of Real Time PCR Method for Detection of Fasciolosis in Bovine and Sheep

WANG Caixia1，LIN Xiangmei1，WU Shaoqiang1*，XU Geng2
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100029；2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan City of Shandong Province）

To facilitate rapid and sensitive diagnosis of Fasciolosis，the real time TaqMan PCR method was developed to detect Fasciolosis infection in bovine and sheep.The primers and Taqman probe were designed and chosen to amplify the conserved internal transcript spacer 2（ITS-2）segment of genus Fasciolosis ribosomal DNA.The sensitivity and specificity of the developed method were examined using the plasmid containing the targeted ITS-2 fragment as template.The primers and probe were specific enough to distinguish Fasciolosis from clonorchis sinensis，fasciolopsis and paragonimus westermani.The dynamic range of the developed method was between 1×100and 1×106copies，meaning that the target DNA could be reliably detected and quantified for plasmid template DNA at a concentration as low as one copy.Two fasciola oocysts could be detected by this real time PCR method.In conclusion，the real time PCR method is rapid，sensitive and specific for Fasciolosis，and can be used to inspect Fasciolosis in the farm and for quarantine use.

Fasciolosis；Real-time PCR；Sensitivity；Specificity；Detection

Q789

E-mail：friday128@sina.com；*通信作者E-mail：sqwu@sina.com

“十二五”國家科技支撐計劃課題（2012BAK11B04）、（2013BAD12B01）

2016-10-20