性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響

李靜,石巍，魏曼

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南鄭州450052)

性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響

李靜,石巍，魏曼

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南鄭州450052)

目的分析子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡受到性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的影響。方法以30例子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對(duì)象，均給予體外培養(yǎng)，并利用不同濃度的性腺激素釋放激素激動(dòng)劑處理在位細(xì)胞和異位細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡受到性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的影響情況。結(jié)果子宮內(nèi)膜異位癥在位細(xì)胞核異位細(xì)胞生長(zhǎng)率與性腺激素釋放激素激動(dòng)劑濃度及作用時(shí)間呈反比。性腺激素釋放激素激動(dòng)劑作用24 h后，高濃度在位、異位細(xì)胞凋亡率均高于低濃度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞在性腺激素釋放激素激動(dòng)劑作用下加速凋亡，可促進(jìn)患者康復(fù)。

性腺激素釋放激素激動(dòng)劑；子宮內(nèi)膜異位癥；細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜異位癥為臨床常見病，多發(fā)于育齡期女性，內(nèi)膜異位至盆腔腹膜為主要發(fā)病部位，卵巢、輸尿管等也可發(fā)病。研究顯示，合并不孕癥的患者約占子宮內(nèi)膜異位癥患者的30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥時(shí)，多采用手術(shù)方式，而在控制病情進(jìn)展、減少術(shù)后復(fù)發(fā)方面，藥物治療具有重要作用，本研究中以收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對(duì)象，體外培養(yǎng)在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞，并給予性腺激素釋放激素激動(dòng)劑，觀察期對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料以本院2014年10月～2015年10月收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例為研究對(duì)象，年齡29～43歲，平均（36.7±2.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均給予手術(shù)治療，術(shù)前未接受激素治療，無其他婦科合并癥，經(jīng)病理學(xué)檢查明確。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)方法術(shù)中，每名患者均收治典型卵巢異位內(nèi)膜病灶、子宮在位內(nèi)膜，用于體外培養(yǎng)，培養(yǎng)方法為組織塊消化法。剪碎組織，在37℃下，利用0.1%Ⅳ型膠原酶笑話，時(shí)間為2～3 h，完成后，離心細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種，培養(yǎng)液選擇為改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（內(nèi)含胎牛血清10%、谷氨酸10 mmol/L、胰島素0.1 U/mL、青霉素及鏈霉素各100 mg/mL），培養(yǎng)時(shí)間12 h，之后利用倒置顯微鏡進(jìn)行1次細(xì)胞形態(tài)觀察，24 h后，培養(yǎng)液更換，內(nèi)膜細(xì)胞如未貼壁，直接剔除，以后培養(yǎng)液更換時(shí)間為2～3 d，細(xì)胞平的80%～90%被細(xì)胞鋪滿時(shí)，開始傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)方法內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性利用四甲胺偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)。首先，制動(dòng)單細(xì)胞懸液，同樣采用改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基進(jìn)行，內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，在96孔培養(yǎng)板中接種內(nèi)膜細(xì)胞，每孔接種密度為1×104個(gè)，完成后，于CO2培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)板，進(jìn)行24 h培養(yǎng)。其次，加入性腺激素釋放激素激動(dòng)劑，劑量濃度分別為100 ng/mL、200 ng/mL，每個(gè)濃度中，包含空白孔、對(duì)照孔、3個(gè)平行孔，培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、24 h、36 h、48 h，完成后，將20μLMTT溶液（5 mg/mL）加入到每個(gè)孔中，在37℃下，將其放置在培養(yǎng)箱中，繼續(xù)4 h，培養(yǎng)終止，孔內(nèi)上清液去除，再將二甲基亞砜150μL加入到每個(gè)孔中，振蕩10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物。最后，利用MTT比色，波長(zhǎng)570 nm，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，將各孔吸光度（A）值測(cè)定。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡檢測(cè)利用AnnexinV-FITC/PI，利用胰酶消化培養(yǎng)24 h后不同濃度的各孔中的細(xì)胞，洗滌液為磷酸緩沖液，洗滌次數(shù)2次，細(xì)胞混勻采用AnnexinV-FITC/PI與緩沖液進(jìn)行，并記錄細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/mL，將AnnexinV-FITC溶液5μL、PI溶液10μL分別加入到100μL懸浮細(xì)胞中，室溫下，進(jìn)行15 min孵育，避免光照，將磷酸緩沖液混勻細(xì)胞400μL加入，數(shù)據(jù)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料利用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果由體外培養(yǎng)結(jié)果可知，30例患者中，成功培養(yǎng)在位內(nèi)膜細(xì)胞29例，成功率96.7%；成功培養(yǎng)異位內(nèi)膜細(xì)胞24例，成功率80.0%。

2.2 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)率受性腺激素釋放激素激動(dòng)劑影響情況由細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果可知，性腺激素釋放激素激動(dòng)劑濃度越高、培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)率越低。見表1。

表1 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)率受性腺激素釋放激素激動(dòng)劑影響情況（%）

2.3 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率受性腺激素釋放激素激動(dòng)劑影響情況由細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果可知，性腺激素釋放激素激動(dòng)劑濃度為100 ng/mL時(shí)，在位、異位細(xì)胞凋亡率均低于濃度為200ng/mL時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率受性腺激素釋放激素激動(dòng)劑影響情況（%）

3 討論

近年來，人們的生活方式發(fā)生了比較大的改變，由此提高了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率。子宮內(nèi)膜異位癥多見于育齡期女性，癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)、性交痛、不孕等，對(duì)患者身體健康及生活質(zhì)量產(chǎn)生比較大的影響。臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥時(shí)，多給予患者手術(shù)治療，可將病灶組織有效的清除，并解除盆腔粘連，但深層浸潤(rùn)病灶無法清除，導(dǎo)致殘留病灶組織，提高了術(shù)后復(fù)發(fā)率，影響患者術(shù)后妊娠[2]。

隨著子宮內(nèi)膜異位癥治療水平的提升，臨床中開始較為廣泛的應(yīng)用性腺激素釋放激素激動(dòng)劑，取得了良好的治療效果。性腺激素釋放激素激動(dòng)劑在多種激素依賴性疾病中均有較好的療效，通常認(rèn)為，促性腺激素釋放激素受體在此種藥物的作用下受到調(diào)節(jié)，從而顯著降低促性腺激素以及雌激素水平，發(fā)揮間接性的療效[3]。近年研究顯示，除了下丘腦一垂體軸外，病變組織以及正常組織中也有促性腺激素釋放受體的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡中，凋亡刺激信號(hào)作用于有核細(xì)胞中，將細(xì)胞內(nèi)的死亡機(jī)制啟動(dòng)，促使細(xì)胞發(fā)生程序性的變性及壞死。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡可自發(fā)性進(jìn)行，說明內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)及功能正常，當(dāng)患者患有子宮內(nèi)膜異位癥時(shí)，內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)及功能受到影響發(fā)生異常，從而影響內(nèi)膜細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，造成患者病情進(jìn)展[4]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜中的各個(gè)調(diào)控蛋白發(fā)生變化時(shí)，在位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡特性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變[5]。子宮內(nèi)膜細(xì)胞處于增生期時(shí)，會(huì)增加Bel-2蛋白表達(dá)，與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比，Bel-2/bax蛋白比值更高，提高了內(nèi)膜細(xì)胞抵抗凋亡刺激信號(hào)的能力，降低內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率；內(nèi)膜細(xì)胞處于分泌期時(shí)，盡管會(huì)降低Bel-2蛋白表達(dá)，而且不會(huì)明顯提高Bax蛋白，但與正常分泌期內(nèi)膜細(xì)胞相比，Bel-2/bax蛋白比值依然比較高，從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。經(jīng)由本研究的結(jié)果可知，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞及異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率均會(huì)受到性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的影響，而且性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的濃度越高時(shí)，細(xì)胞凋亡率越高，這說明，性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的濃度與子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位細(xì)胞凋亡率之間成正比。綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性隨著性腺激素釋放激素激動(dòng)劑濃度及培育時(shí)間的增加而降低，細(xì)胞凋亡率則隨之升高，表示子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與性腺激素釋放激素激動(dòng)劑之間關(guān)系密切，臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥患者時(shí)，可給予患者促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑藥物，以提升治療效果。

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