ROC曲線對ECLIA法預(yù)測HCV感染的最佳S/CO值的確定和分析*

楊 澤,黎明新

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧沈陽 110000

丙型病毒性肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一,并以血源性感染最為常見[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,丙型肝炎病毒(HCV)在全球范圍內(nèi)的感染率約為2.8%,約有1.85億人感染HCV[2-3]。因此,對丙型病毒性肝炎的早期檢查、及時預(yù)防尤為必要。目前,臨床上常用的初篩方法就是檢測HCV抗體,因其有較高的靈敏度和特異度,而且操作簡便、成本低,因此被廣泛應(yīng)用于各大采血機(jī)構(gòu)及臨床實(shí)驗(yàn)室。研究表明,HCV抗體在早期感染時會存在長達(dá)2個月的“窗口期”,但幸運(yùn)的是這段“窗口期”能隨著檢測方法靈敏度的提高而縮短,使就診患者得以早期發(fā)現(xiàn)及治療。正因如此,眾多臨床實(shí)驗(yàn)室逐漸應(yīng)用了靈敏度高、反應(yīng)速度快的電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)法,但該方法在提高靈敏度的同時,特異度會有所降低,方法學(xué)上也就不可避免地出現(xiàn)假陽性的結(jié)果,為了保證HCV檢測的有效性及準(zhǔn)確性,本研究主要針對初篩抗體為有反應(yīng)性的標(biāo)本(尤其是弱陽性的標(biāo)本)進(jìn)行更特異的補(bǔ)充確證試驗(yàn),以得出更準(zhǔn)確的初篩臨界值來完善檢測報告,協(xié)助臨床診斷工作。有研究表明,全國不同地區(qū)的HCV感染率有一定差異,以長江為界,北方人群明顯高于南方人群[4-5],因此各所實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該有符合當(dāng)?shù)厝巳旱囊粋€標(biāo)準(zhǔn)初篩臨界值。本研究主要目的為完善和確定沈陽地區(qū)人群的丙型病毒性肝炎診斷數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2017年2月至2018年6月本院門診和住院患者經(jīng)過ECLIA法初篩檢測HCV抗體有反應(yīng)性標(biāo)本(S/CO≥1)167份,陰性標(biāo)本(S/CO<1)10份,以上標(biāo)本的收集均按照2004年發(fā)布的《丙型病毒性肝炎防治指南》[6]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。本研究方案經(jīng)過本院倫理委員會的批準(zhǔn)同意,并且已獲得受試者的知情同意書。

1.2儀器與試劑 HCV抗體檢測采用羅氏Cobas e 602分析儀(ECLIA法)及配套的HCV抗體檢測試劑盒(Anti-HCVⅡ)。HCV RNA檢測采用美國伯樂公司的CFX 96 Touch分析儀,試劑為達(dá)安基因公司HCV RNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)。重組免疫印跡試驗(yàn)(RIBA)檢測采用重組免疫印跡HCV IgG檢測試劑條(MIKROGEN DISGNOSTIK)。

ECLIA法陽性判定:按照羅氏說明書進(jìn)行判斷,S/CO≥1為有反應(yīng)性。HCV RNA檢測:線性范圍為1.0×103～1.0 ×107IU/mL,該試劑的靈敏度為250 IU/mL。RIBA法陽性判定:通過顯色條帶以判定陰、陽性。滿足以下任意一條即為陽性,Core 1和Core 2 ≥Cut-off值；Core 1和另一個抗原≥Cut-off值；Core 2和另一個抗原≥Cut-off值；任意3個抗原≥Cut-off值。

1.3方法 將HCV抗體初篩的177份標(biāo)本根據(jù)抗體檢測值的高低分為5組,分別是陰性組(S/CO<1)、低值組(1≤S/CO<10)、中值組(10≤S/CO<20)、高值組(20≤S/CO<30)和超高值組(S/CO≥30),將每組依次進(jìn)行HCV RNA檢測,若檢測結(jié)果為陽性的標(biāo)本,則診斷為HCV陽性,若HCV RNA為陰性的患者再進(jìn)行下一步RIBA的補(bǔ)充確證試驗(yàn),根據(jù)顯色帶的情況進(jìn)行陽性和陰性的結(jié)果判讀,若為不確定性的患者可采取定期隨訪,暫不參與數(shù)據(jù)分析。若HCV RNA和RIBA補(bǔ)充試驗(yàn)都為陰性的標(biāo)本,臨床上則考慮很大可能為假陽性的標(biāo)本,通過此方法來確證出真陽性及假陽性的患者,通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,最終可以得到一個HCV抗體最佳的S/CO值，分析相應(yīng)的臨床診斷意義。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Medcalc軟件進(jìn)行受試者工作特征(ROC)曲線的數(shù)據(jù)分析,計算最佳ROC曲線下面積(AUC),以及相應(yīng)的靈敏度、特異度、約登指數(shù)、最佳臨界值等。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HCV抗體的數(shù)據(jù)收集及結(jié)果分析 通過ECLIA法初篩后,檢測到有反應(yīng)性(S/CO≥1)的標(biāo)本167份,在確證試驗(yàn)時,發(fā)現(xiàn)有4份標(biāo)本HCV RNA檢測為陰性的同時,RIBA補(bǔ)充試驗(yàn)也顯示為不確定性,因此將不確定的4份標(biāo)本暫不納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計,對患者采取定期隨訪的措施。而本次有效的反應(yīng)性標(biāo)本應(yīng)為163份,與非反應(yīng)性標(biāo)本10份,共計173份。

結(jié)果為陰性(S/CO<1)的10份標(biāo)本經(jīng)HCV RNA及RIBA檢測后均為真陰性。有反應(yīng)性的163份標(biāo)本經(jīng)HCV RNA檢測可確證的真陽性標(biāo)本有85份,之后將HCV RNA檢測為陰性的標(biāo)本進(jìn)一步做RIBA補(bǔ)充試驗(yàn)檢測,又檢測出45份HCV陽性標(biāo)本,最終可確診的血清有130份,約占總標(biāo)本的75.1%,見表1。

表1 HCV抗體經(jīng)確證試驗(yàn)后的統(tǒng)計分析

2.2HCV初篩分組結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計 當(dāng)1≤S/CO<10時,收集到50份有意義的標(biāo)本,經(jīng)過確證為真陽性的標(biāo)本有17份；剩余的33份均為陰性,因此考慮1≤S/CO<10區(qū)間存在很大一部分假陽性的問題,統(tǒng)計結(jié)果見表2。

當(dāng)HCV初篩的S/CO≥10時,共收集113份標(biāo)本,經(jīng)HCV RNA檢測后確證有81份為真陽性,其余標(biāo)本進(jìn)一步做RIBA檢測,又檢測出32份陽性標(biāo)本,最終可確診的血清有113份,陽性率幾乎可達(dá)到100.0%。

表2 低值組初篩抗體經(jīng)確證試驗(yàn)后的數(shù)據(jù)分析

2.3HCV初篩最佳診斷臨界值的統(tǒng)計結(jié)果 經(jīng)ROC曲線分析,得到AUC為0.971,最佳診斷臨界值為8.83,此時最佳約登指數(shù)為0.861,靈敏度為86%,特異度為100%。見圖1。

圖1 ROC曲線

3 討 論

HCV抗體檢測由于靈敏度和特異度均較高，且標(biāo)本易獲得，操作方法簡便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，被臨床作為丙型病毒性肝炎篩查的首選方法。在臨床工作中,對于“高值組”的標(biāo)本診斷結(jié)果較為明確,但對于“低值組”的弱陽性標(biāo)本,即處于“診斷灰區(qū)”的標(biāo)本,診斷較為困難，也是臨床上造成誤診的主要原因之一。而在臨床中,弱陽性標(biāo)本并不少見,一些自身免疫性疾病或者妊娠的干擾都會導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本的出現(xiàn)。沈陽地區(qū)的許多醫(yī)院都曾出現(xiàn)過丙型病毒性肝炎患者檢測結(jié)果假陽性的問題,甚至導(dǎo)致醫(yī)患糾紛的發(fā)生。目前，針對HCV抗體檢測假陽性的研究相對較少,并且由于不同醫(yī)院應(yīng)用的方法及儀器設(shè)備不同,因此無法強(qiáng)行統(tǒng)一弱陽性標(biāo)本的診斷臨界值,只能通過大量臨床標(biāo)本的分析確定適合當(dāng)?shù)厝巳旱淖罴言\斷臨界值。確定適合當(dāng)?shù)厝巳旱淖罴言\斷臨界值的意義在于既可以增加檢驗(yàn)人員審核HCV檢測報告的準(zhǔn)確性,又能減少因“診斷灰區(qū)”帶來的臨床誤診率及醫(yī)患糾紛。

本研究收集了10份(S/CO<1)HCV陰性標(biāo)本,經(jīng)HCV RNA及RIBA檢測后,10份標(biāo)本均為陰性。由此考慮羅氏Cobas e 602分析儀在檢測陰性標(biāo)本中的特異度較高。但對于S/CO≥1的臨床標(biāo)本,卻收集到了33份假陽性標(biāo)本,約占低值組的66%,由于ECLIA法的高靈敏度，使其能夠檢測到體內(nèi)極其微量的抗體,但靈敏度的提高勢必也會導(dǎo)致特異度的下降,而特異度的降低必然會造成誤診率的升高,從而不可避免地出現(xiàn)臨床上的假陽性患者,臨床不得不考慮兩者之間的平衡問題。

本研究結(jié)果顯示,當(dāng)S/CO≥10時,HCV抗體的真陽性率幾乎可以達(dá)到100.0%,當(dāng)1≤S/CO<10時,此區(qū)間的真陽性率僅為34.0%,說明在低值組(1≤S/CO<10)中存在相當(dāng)一部分假陽性患者,而目前來看此區(qū)間的陽性率與抗體值的大小并不呈正比，其中1≤S/CO<5的分布最為密集,在36份標(biāo)本中經(jīng)過確證發(fā)現(xiàn)有26份為陰性,其假陽性率為72%,因此,在檢測過程中應(yīng)格外注意1

本研究將收集到的163份有反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)統(tǒng)計分析后得到ROC曲線,可知AUC為0.971,說明該初篩試驗(yàn)的診斷效果非常好,具有較高的臨床診斷價值；在該曲線下,得到最佳S/CO值為8.83,在該點(diǎn)中能夠同時確保靈敏度和特異度的平衡；最佳約登指數(shù)為0.861,具有說服性。若將本研究得出的最佳診斷臨界值應(yīng)用于臨床工作當(dāng)中,不僅減少了低值組(1≤S/CO<10)的假陽性率,還更具有臨床指導(dǎo)意義。

經(jīng)過統(tǒng)計分析后得知,低值組的數(shù)據(jù)中不乏眾多“假陽性的標(biāo)本”,若單憑抗體初篩的結(jié)果進(jìn)行診斷治療,會給臨床工作帶來很大困擾?？紤]到假陽性被檢者的體內(nèi)HCV RNA實(shí)際為陰性,屬于未患病人群,更不需要用藥，因此,應(yīng)提高報告單的準(zhǔn)確性與實(shí)用性,通過利用最終的初篩臨界值進(jìn)行更為具體的討論,并以注釋的形式體現(xiàn)在報告單當(dāng)中,使檢驗(yàn)的工作更準(zhǔn)確、更完善。對于1≤S/CO≤8.83的標(biāo)本,建議報告為“有反應(yīng)性標(biāo)本”(既不建議報告陽性結(jié)果,也不排除有假陽性的可能),并注以該標(biāo)本的陽性預(yù)測值≤95%,建議患者1個月后復(fù)查或進(jìn)行HCV RNA檢測,根據(jù)核酸定量結(jié)果,判斷是否為現(xiàn)癥感染。

在臨床工作中,完善的病毒學(xué)檢測是對于HCV感染診斷和治療的基礎(chǔ),2018年11月發(fā)布的《丙型病毒性肝炎診斷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定,以HCV RNA結(jié)果作為丙型病毒性肝炎臨床檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。同時有數(shù)據(jù)顯示HCV陽性患者每天大約可產(chǎn)生1012copy病毒,因此,可以通過HCV核酸檢測以確定是否為現(xiàn)癥感染。當(dāng)HCV抗體檢測的值越高,其 HCV RNA檢測出的可能性就越大[8-9]。有少數(shù)免疫功能抑制的患者體內(nèi)缺乏HCV抗體,但HCV RNA檢測為陽性,基于以上因素,臨床上常將定量PCR作為治療監(jiān)測、療效判斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

由于RIBA試劑盒的價格昂貴，且不能快速得出結(jié)果,目前并不適宜國內(nèi)普遍應(yīng)用,但考慮其較高的特異度,因此本研究將RIBA作為補(bǔ)充試驗(yàn),不僅有益于ECLIA法在臨床上的初篩，也能對比出不同實(shí)驗(yàn)室PCR的靈敏度及檢測下限,從而做出調(diào)整,以達(dá)到符合當(dāng)?shù)厝巳阂蟮臋z測水平。

2011年我國疾控中心發(fā)布的《丙型病毒性肝炎檢測技術(shù)規(guī)范》中有提到,實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)最佳S/CO值來決定標(biāo)本是否應(yīng)進(jìn)一步補(bǔ)充確證,但由于RIBA的試劑盒成本較高,我國目前對實(shí)驗(yàn)室的HCV檢測結(jié)果并不強(qiáng)行確證。而在實(shí)際工作中,考慮到RIBA在特異度上又極具優(yōu)勢,因此本課題小組正在探討是否應(yīng)該給予個別弱陽性患者進(jìn)行臨床上的補(bǔ)充確證,以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與完善性。同時,在丙型病毒性肝炎診斷的過程中,除了憑借初篩

抗體檢測及核酸定量結(jié)果以外,還應(yīng)多參考免疫、生化等其他指標(biāo),為丙型病毒性肝炎患者的早期診斷、及時治療及預(yù)后評估提供更好的臨床證據(jù)。

目前,國內(nèi)對丙型病毒性肝炎患者的抗病毒治療目標(biāo)是清除HCV,減輕相關(guān)損傷,使就診患者獲得治愈，或提高患者的長期生存率及生活質(zhì)量,同時預(yù)防病毒的傳播[10]。因此,對于丙型病毒性肝炎的盡早發(fā)現(xiàn)、明確診斷和及時治療尤為重要。根據(jù)我國社會發(fā)展情況,不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的方法學(xué)及試劑有所不同,S/CO參考值也會存在差異,所以還應(yīng)該積極探討適合于資源有限地區(qū)的最佳S/CO值來更好地輔助臨床診斷工作。