60Co-γ對(duì)海州常山扦插過(guò)程內(nèi)源激素含量的變化影響

何 嶺，張瑩婷，王良桂，華雅潔，胡 蝶，王 欣，陳 敏，楊秀蓮

（南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

海州常山（Clerodendrum trichotomum），別名臭梧桐、泡火桐、追骨風(fēng)等。產(chǎn)遼寧、甘肅、陜西以及華北、中南、西南各地，常出現(xiàn)在海拔2400m以下的灌叢中。朝鮮、日本及菲律賓北部也有分布[1]。海州常山不僅是有待開(kāi)發(fā)的觀賞木本花卉，也是有生物油用和藥用的經(jīng)濟(jì)作物[2]。近年來(lái)，海州常山關(guān)于海州常山的研究逐漸豐富，但目前關(guān)于海州常山育種研究罕見(jiàn)報(bào)道，這會(huì)制約海州常山大面積地開(kāi)發(fā)及推廣。

60Co-γ輻射是最廣泛使用的輻射方法，射線的高能量誘導(dǎo)生物的遺傳物質(zhì)變異，并重新組合得到有利的突變體[3]。趙云龍[4]用60Coγ對(duì)大白杜鵑進(jìn)行輻射處理，吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)含量降低，脫落酸(ABA)含量增加，較高含量的脫落酸使大白杜鵑產(chǎn)生矮化現(xiàn)象。劉春貴等[5]使用60Coγ射線輻射路易斯安那鳶尾種子,發(fā)現(xiàn)100 Gy輻射處理會(huì)促進(jìn)種子萌發(fā)率和成苗率,可用于種苗生產(chǎn)。60Coγ輻射誘變材料主要有種子、胚、組培苗、愈傷組織、枝條 、幼苗等，枝條輻射后常嫁接嫁接于母株上，輻射后扦插較為少見(jiàn)。近年來(lái)，史玉敏等[6]研究60Co-γ輻射對(duì)桂花插穗的影響，結(jié)果表明桂花根形態(tài)特征、新生葉的可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)。

插穗內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化與生根有密切關(guān)系[7]。增加60Co-γ輻射劑量會(huì)提高植株的變異率，同時(shí)也會(huì)提高植株死亡率。筆者在試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，非過(guò)高劑量的60Co-γ輻射并不會(huì)明顯降低死亡率，而是延緩插穗物候期，導(dǎo)致生根前插穗內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡死亡。本研究用不同劑量60Co-γ射線輻射海州常山枝條，測(cè)定插穗萌發(fā)過(guò)程中ABA、GA3、ZR、IAA 4種內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化和比值大小，旨在研究60Co-γ輻射后插穗生根與內(nèi)源激素含量之間的關(guān)系，為今后輻射育種、施用外源激素方法以提高成活率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在2017年3月6日，于南京林業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地采取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害一年生休眠枝條（芽鱗開(kāi)始松動(dòng)）為試驗(yàn)材料。將枝條剪成長(zhǎng)度為10cm左右的插穗，切口上平下斜，上切口離最上芽為1cm，下切口離下芽為0.5cm，脫脂棉包裹保濕。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻射處理與扦插試驗(yàn)

于2017年3月7日，經(jīng)江蘇省農(nóng)業(yè)原子能農(nóng)業(yè)利用研究所進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理，劑量15Gy，劑量率為1.1 Gy.min-1。同時(shí)設(shè)未經(jīng)輻射處理的為對(duì)照（CK），每處理60根插穗，3個(gè)重復(fù)。扦插前，用400mg/LNAA溶液浸泡插穗基部1h[8]，后插于基質(zhì)中，基質(zhì)配方為V泥炭：V珍珠巖：V蛭石：V河沙=1：1：1：2，基質(zhì)經(jīng) 800 倍多菌靈溶液消毒。 后日常養(yǎng)護(hù)管理。

1.2.2 內(nèi)源激素的測(cè)定

考慮到物候及輻射效應(yīng)，于扦插之日起，分別隔 40d、47d、54d、64d、74d、84d、104d 于每個(gè)處理組中隨機(jī)選擇10根插穗，洗凈擦干，削取插穗基部1～2cm皮部，稱(chēng)量分裝后存放于-80℃冰箱中備用，最后委托中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心統(tǒng)一測(cè)定。各時(shí)期樣品測(cè)定的內(nèi)源激素含量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），激素具體包括吲哚乙酸 （IAA）、赤霉素(GA3)、玉米素核苷（ZR）和脫落酸（ABA）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003軟件數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ對(duì)扦插生根過(guò)程中激素含量變化的影響

2.1.1 生長(zhǎng)素（IAA）

由圖1表明，扦插后60Co-γ射線15Gy輻射的插穗IAA含量呈現(xiàn)先下降再上升最后再下降的趨勢(shì)。對(duì)照處理的插穗扦插40-47d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，后于47-54d時(shí)，上升至125.99ng.g-1，扦插54d后不定根逐漸伸長(zhǎng)，對(duì)照處理的IAA含量逐漸下降。而60Co-γ射線處理的插穗IAA含量在扦插40-54d緩慢上升；54-64d為輻射處理插穗愈傷組織分化成根原基，IAA含量下降；64-104d隨著根尖的生長(zhǎng)素的合成，IAA含量呈上升的變化趨勢(shì)。輻射處理插穗IAA含量谷值比對(duì)照延遲17d，兩者IAA含量分別為 107.93ng.g-1、91.31ng.g-1。

2.1.2 細(xì)胞分裂素（玉米素ZR）

由圖1可見(jiàn)，ZR在海州常山插穗生根過(guò)程中總體呈下降上升的趨勢(shì)。對(duì)于對(duì)照處理的插穗在不定根誘導(dǎo)期40-64d時(shí)，ZR含量下降，扦插64d后，隨著不定根的伸長(zhǎng)，ZR含量上升后又趨于穩(wěn)定；經(jīng)輻射處理的插穗，40-74d為不定根誘導(dǎo)期，ZR含量在74d達(dá)到最低值，后不定根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，ZR含量逐漸上升，其中輻射處理ZR含量的最低值出現(xiàn)期比對(duì)照處理組晚10d。

2.1.3 赤霉素（GA3）

海州常山插穗扦插過(guò)程中，GA3含量變化趨勢(shì)為先上升后降低。在扦插前期40-47d，GA3含量無(wú)明顯變化，且對(duì)照組與處理組無(wú)明顯差距，扦插后47-54d，GA3含量均急劇上升，對(duì)照與處理水平GA3含量分別達(dá)到22.22ng.g-1和17.62ng.g-1。64d后GA3含量又降至扦插初期水平，且對(duì)照組比處理組變化幅度大。試驗(yàn)中，輻射處理組與對(duì)照組不定根形成時(shí)間不同，但GA3峰值出現(xiàn)在相同的時(shí)間段。

2.1.4 脫落酸（ABA）

根據(jù)圖1可知處理組和對(duì)照組插穗的ABA含量總體呈下降趨勢(shì)。40-64d不定根誘導(dǎo)期間對(duì)照組ABA含量持續(xù)降低，最低值為117.44ng.g-1；64-104d插穗內(nèi)ABA含量有一定的上升。60Co-γ射線輻射處理的插穗ABA含量在40-64d差異不大，可能是輻射引起的脅迫作用使得ABA含量處于一個(gè)較高的穩(wěn)定水平；64-74d時(shí)，愈傷組織形成不定根ABA含量下降，隨后下降幅度有所減緩，84d后ABA含量再次降低，根系持續(xù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

圖1 60Co-γ射線輻射后不同內(nèi)源激素含量的變化Fig.1 Variations of different endogenous hormones content treated by 60Co-γradiation

2.2 60Co-γ對(duì)扦插生根過(guò)程激素的比值變化

2.2.1 生長(zhǎng)素與脫落酸（IAA/ABA)

如圖2所示，60Co-γ射線輻射處理的插穗IAA/ABA比值呈先上升再下降最后再上升的趨勢(shì)，而對(duì)照組表現(xiàn)出先上升再下降的變化趨勢(shì)。輻射處理的IAA/ABA比值在40-54d呈上升趨勢(shì)，在這可能是不定根誘導(dǎo)期IAA含量升高和ABA含量降低引起的，隨著不定根的出現(xiàn)比值隨IAA含量降低而降低；64-104d，IAA/ABA比值呈上升的趨勢(shì)。對(duì)照處理組插穗IAA/ABA含量在40-54d呈上升變化趨勢(shì)，最高達(dá)0.96ng.g-1；54d后比值逐漸降至扦插前期水平。取樣期間，輻射處理組插穗IAA/ABA比值多低于對(duì)照組處理水平。

2.2.2 赤霉素與脫落酸（GA3/ABA)

由圖2可見(jiàn)，海州常山插穗GA3/ABA比值變化趨勢(shì)基本相同，GA3/ABA在插穗生根過(guò)程中呈先上升后降低的趨勢(shì)。GA3/ABA比值在扦插40-47d差距不大，但在54d輻射組和對(duì)照組插穗GA3/ABA比值同時(shí)急劇上升，分別達(dá)到0.17ng.g-1和0.11ng.g-1。扦插64d，比值下降至扦插前期水平；74-104d，處理組比值呈緩慢上升趨勢(shì)，而對(duì)照組變化趨勢(shì)與其相反。

圖2 60Co-γ射線輻射后IAA/ABA,GA3/ABA和ZR/ABA的變化Fig.1 Variations of IAA/ABA,GA3/ABA and ZR/ABA treated by60Co-γradiation

2.2.3 細(xì)胞分裂素與脫落酸（ZR/ABA）

由圖2分析可知，輻射組比值ZR/ABA呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，對(duì)照組比值變化趨勢(shì)由上升到下降再至上升最后下降的變化趨勢(shì)。在不定根伸長(zhǎng)前，40～64d內(nèi)ZR/ABA比值下降，在64d降至最低0.049ng.g-1，之后一直呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組ZR/ABA比值于扦插后40～54d內(nèi)逐漸升高，達(dá)到0.076ng.g-1，此時(shí)正值不定根形成時(shí)期。扦插54d-64d比值急劇下降，隨著不定根的發(fā)育，比值上升繼而下降至扦插前期水平。

3 結(jié)論與討論

60Co-γ射線輻射會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生有益的突變效應(yīng)，同時(shí)也會(huì)對(duì)植物DNA、生物膜系統(tǒng)、酶系統(tǒng)產(chǎn)生傷害。楊振等[9]以庫(kù)爾勒香梨為試驗(yàn)材料，采用60Coγ射線進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)輻射會(huì)抑制枝條的萌發(fā)和生長(zhǎng)，但隨著輻射效應(yīng)的降低，庫(kù)爾勒香梨枝條會(huì)恢復(fù)正常生長(zhǎng)。同時(shí)，在扶芳藤[10]荔枝[11]的研究中也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，輻射影響激素的產(chǎn)生，這與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的關(guān)系[12]。本研究中，海州常山插穗經(jīng)15Gy的60Co-γ射線輻射后，不定根的生長(zhǎng)較對(duì)照組延遲了10d。在輻射育種過(guò)程中，插穗生根前應(yīng)加強(qiáng)日常養(yǎng)護(hù)管理，提供充足的水肥，以保證輻射材料的成活率。

前人的研究多證明生長(zhǎng)素是促進(jìn)生根的因子[13-16]。本研究顯示，在海州常山插穗生根過(guò)程中，激素與扦插生根關(guān)系密切，不定根形成前內(nèi)源IAA含量下降。不定根形成后IAA含量上升。不定根形成前根原基的誘導(dǎo)消耗大量?jī)?nèi)源IAA，不定根形成后隨著根尖合成新的IAA，IAA含量上升以保持根系的生長(zhǎng)。對(duì)照組和輻射處理組在IAA含量谷值上差距17d，輻射處理傷害了插穗定芽合成IAA的功能，從而延緩插穗的物候期。

ZR屬于細(xì)胞分裂素，對(duì)細(xì)胞分裂有促進(jìn)效應(yīng)，也可以延緩細(xì)胞衰老、解除頂端優(yōu)勢(shì)等[17]。一些研究表明，高濃度細(xì)胞分裂素會(huì)抑制插穗不定根的生成，而低水平有利于生根[18]。本試驗(yàn)中，海州常山插穗生根在不定根誘導(dǎo)及生長(zhǎng)初期ZR含量低，表明內(nèi)源ZR的降低有利于不定根的形成。隨著根系的生長(zhǎng)，ZR含量的上升促進(jìn)不定根分化。60Co-γ射線輻射延長(zhǎng)了內(nèi)源ZR含量變化趨勢(shì)，表明輻射延緩了插穗不定根的形成。

赤霉素可以促進(jìn)植物節(jié)間伸長(zhǎng)與種子萌發(fā)，并且與植物開(kāi)花結(jié)果密切相關(guān)。目前內(nèi)源GA3含量與插穗生根關(guān)系尚未有明確定論。前人在樹(shù)牽牛[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3可顯著提高植株生根率，促進(jìn)根系生長(zhǎng)。但閆文濤等[20、21]認(rèn)為內(nèi)源GA3活性降低有利于插穗不定根原基的誘導(dǎo)，低水平GA3能促進(jìn)植物根尖發(fā)育。本試驗(yàn)中，插穗不定根形成前，GA3含量均有個(gè)驟升過(guò)程，這代表不定根的形成需要內(nèi)源GA3的促進(jìn)。

經(jīng)過(guò)60Co-γ處理后，海州常山扦插生根過(guò)程中輻射處理插穗ABA含量高于對(duì)照值。ABA含量的降低表明低含量的ABA有助于插穗生根，這與前人[22、23]的研究結(jié)論相似。輻射易引起ABA含量上升，內(nèi)源ABA會(huì)通過(guò)影響生長(zhǎng)素在插穗內(nèi)的分布和含量，進(jìn)而影響根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂，從而抑制不定根伸長(zhǎng)[24]。

植物扦插過(guò)程中，不同內(nèi)源激素的含量和變化的動(dòng)態(tài)平衡是插穗生根機(jī)理，內(nèi)源激素含量比值與不定根生成的難易程度密切相關(guān)[25-27]。一般認(rèn)為I-AA/ABA高，有助于根原基誘導(dǎo)分化[25,28]。本研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射處理插穗的 IAA/ABA，GA3/A-BA,ZR/ABA比值在不定根誘導(dǎo)分化期均低于對(duì)照值，多在扦插54d比值達(dá)到峰值，于64d達(dá)到谷值以利于不定根生成，這與楊雪萌等[29]對(duì)菊花品種天墜玉露及楊霄霞[27]對(duì)香椿的研究結(jié)論相似。3者比值變化趨勢(shì)與扦插生根趨勢(shì)大體吻合，內(nèi)源激素變化節(jié)奏與生根機(jī)理之間是協(xié)同的，但輻射會(huì)降低插穗內(nèi)促進(jìn)生根激素的含量，刺激抑制激素的生成，從而延緩生根。

綜上所述，60CO-γ射線輻射會(huì)通過(guò)調(diào)控幾種激素含量和比值的變化來(lái)抑制海州常山插穗生根。在今后的研究工作中，使用合適的促進(jìn)生根激素對(duì)海州常山插穗進(jìn)行處理，可提高輻射育種材料的成活率。

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