化橘紅對(duì)糖尿病心肌病心肌細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的干預(yù)作用

楊 澄，劉歷威肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校內(nèi)科，廣東 肇慶 56060；南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 508

化橘紅對(duì)糖尿病心肌病心肌細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的干預(yù)作用

楊 澄1，劉歷威21肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校內(nèi)科，廣東 肇慶 526060；2南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510282

目的觀察化橘紅對(duì)糖尿病心肌?。―CM）大鼠心肌細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的干預(yù)作用。方法（1）構(gòu)建DCM大鼠模型，將40只大鼠用鏈脈佐菌素處理后，15只血糖濃度＜16.7 mmol/L的大鼠納入空白對(duì)照組，剩余的25只血糖濃度＞16.7 mmol/L的大鼠隨機(jī)分為DCM組（n=11）與化橘紅組（n=14）。化橘紅組大鼠給予化橘紅400 mg/(kg·d)灌胃，DCM組和對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。測(cè)量各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖（1、8、16、22周）；測(cè)量心功能相關(guān)指標(biāo)；光鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)改變，電鏡下心肌纖維化定量分析；測(cè)定心肌膠原總量；免疫組化測(cè)定心肌膠原；Western印跡檢測(cè)心肌細(xì)胞TGF-β1、Smad、MMP-9、MMP-2、TIMP-1等蛋白含量；RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1等蛋白的mRNA表達(dá)。（2）構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞增殖模型，隨機(jī)分為兩組，化橘紅預(yù)處理組為血清培養(yǎng)基加0.5 mmol/L化橘紅，而對(duì)照組為等量血清培養(yǎng)基。檢測(cè)兩組一氧化氮變化、TGF-β1蛋白、c-fos蛋白、p27蛋白，iNOS蛋白、Cyclin D蛋白表達(dá)情況。結(jié)果化橘紅組的大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖、心肌纖維化、心肌膠原總量及各型膠原較DCM組顯著下降，心收縮、舒張功能明顯改善（P＜0.05），TGF-β1、Smad、MMP-9、MMP-2、TIMP-1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)也明顯抑制（P＜0.05）。化橘紅預(yù)處理組一氧化氮、TGF-β1蛋白、cfos蛋白、p27蛋白，iNOS蛋白、Cyclin D蛋白表達(dá)情況較對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論化橘紅對(duì)DCM中TGF-β1/Smad通路起到了抑制作用，從而調(diào)控其下游的MMPs/TIMPs等通路，改善DCM的心肌纖維化進(jìn)程，抑制心肌肥厚，減少心肌的損傷。

化橘紅；糖尿病心肌??；TGF-β1；Smad

糖尿病心肌?。―CM）是一種獨(dú)立的糖尿病心血管并發(fā)癥[1]，與糖尿病患者的高心力衰竭發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)?，F(xiàn)已明確參與糖尿病心肌纖維化的調(diào)控因素有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、內(nèi)皮素、一氧化氮、糖基化終末產(chǎn)物、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、TGF-β1等[2]?；偌t是我國(guó)廣東化州特有的藥材[3]，其中柚皮苷是其主要成分，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示了化橘紅對(duì)DCM大鼠有積極影響。Jung等[4]發(fā)現(xiàn)化橘紅能有效改善DCM大鼠的糖脂代謝，梁建光等[5]研究發(fā)現(xiàn)化橘紅通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB通路對(duì)DCM大鼠起到心肌保護(hù)作用。TGF-β1/Smad作為DCM形成的關(guān)鍵通路，化橘紅對(duì)其作用少有報(bào)道。作者通過(guò)建立DCM動(dòng)物模型和心肌成纖維細(xì)胞增殖模型，旨在觀察化橘紅對(duì)DCM心肌細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的干預(yù)作用以及心肌間質(zhì)纖維化以及心功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wister大鼠40只，雄性，體質(zhì)量250～300 g（合格證號(hào)體粵2006-0015）。飼養(yǎng)條件為恒溫24±2 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求。

1.2 主要試劑與藥物

試劑：化橘紅藥液（濃度100%）；鏈脲佐菌素；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心）。濃縮型I型膠原一抗、濃縮型Ⅲ型膠原一抗、濃縮型TGF-β1一抗（均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）；多聚賴氨酸，PBS緩沖液, DAB顯色試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司ED1022）。

儀器：MA110型電子分析天平（上海第二天平儀器廠生產(chǎn)），BIOFUGE13型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)BERRA），UV-1206型分光光度計(jì)（德國(guó)ZAISS），顯微圖象分析儀（MetaMorph/DP10/BX51型-美國(guó)通用圖象公司），數(shù)碼照相機(jī)（Olympus），顯微鏡（BX51, 日本）。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立與標(biāo)本采集

1.3.1.1 DCM模型的建立與標(biāo)本采集 雄性大鼠40只室溫飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料。正常飼養(yǎng)1周后，禁食12 h，將鏈脈佐菌素用0.1 mmol/L、pH4.2的檸檬酸緩沖液新鮮配制，參照張春虹等的方法按55 mg/kg腹腔注射，后予5%葡萄糖溶液進(jìn)水，48 h后換用自來(lái)水飲用。大鼠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)12周后（自鏈脈佐菌素注射起），將血糖＞16.7 mmol/L且具有多飲、多食、多尿的大鼠25只納入實(shí)驗(yàn)組，其余列為空白對(duì)照組。將納入實(shí)驗(yàn)組的大鼠隨機(jī)分為DCM組、化橘紅組。化橘紅組大鼠給予化橘紅400 mg/（kg·d）灌胃，DCM組和空白對(duì)照組（NC組）給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)至22周，分別在1、8、16、22周測(cè)量血糖。實(shí)驗(yàn)?zāi)鹘M大鼠麻醉后，測(cè)量左室收縮壓、左室舒張末壓、左室腔內(nèi)壓力變化率最大值（±dp/dtmax）。將3組大鼠處死后心臟制備成約4～5 mm的組織塊若干塊，按常規(guī)方法將組織塊進(jìn)行處理。

1.3.1.2 心肌成纖維細(xì)胞增殖模型（CFb）的建立 取出生后1～3 d齡的大鼠，無(wú)菌開(kāi)胸取心臟，D-Hank’s液清洗，剪成1 mm3大小的碎片，0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化（37 ℃水浴，8 min/次），分別收集各次消化上清液，離心（1000 r/min，5 min）棄上清，用含10%血清的IMDM培養(yǎng)基重懸沉淀制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用反復(fù)差速貼壁法去除內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)采用第3～5代細(xì)胞。分為兩組，化橘紅預(yù)處理組為血清培養(yǎng)基加0.5 mmol/L化橘紅藥液，而對(duì)照組為等量血清培養(yǎng)基。

1.3.2 心功能測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)?組大鼠用3%戊巴比妥鈉按l mL/kg腹腔注射麻醉后，將心導(dǎo)管插入左心室，測(cè)量左室收縮壓、左室舒張末壓、左室腔內(nèi)壓力變化率最大值，觀察化橘紅對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響。

1.3.3 病理組織學(xué)檢查 將4%多聚甲醛固定后的大鼠心臟制備成約4～5 mm的組織塊，按常規(guī)方法將組織塊進(jìn)行脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋。將包埋的組織蠟塊分別連續(xù)切片，切片厚5 mm，于60 ℃恒溫箱中烤片6 h，用Masson染色后采用LEICA數(shù)字圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每例切片心肌間質(zhì)綠染面積占整個(gè)視野的百分比，在光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 測(cè)定心肌膠原總量 稱(chēng)取左心室心肌組織100 mg，制粉末后置于HCL液中酸解，用NaOH液滴定至pH為7，離心后取上清液加檸檬酸緩沖液、氯胺，混勻后氧化6 min，加過(guò)氯酸后混勻放置5 min，再加10%對(duì)二氨苯甲醛，于l80 ℃水浴中放置6 min，取出后冰水浴中放置30 min，UV-1206型分光光度計(jì)560 nm處比色測(cè)定。同時(shí)用1～10 μg的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按上述相同步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得羥氨酸含量，然后換算成每克心肌組織中羥脯氨酸含量，再乘以7.46即得心肌膠原總含量。

1.3.5 心?、?、Ⅲ型膠原免疫組化

1.3.5.1 免疫組化觀察 NC組中Ⅰ型膠原呈索條狀，平行或波浪形排列，分布于間質(zhì)。在小血管周?chē)什贿B續(xù)分布，Ⅲ型膠原呈細(xì)纖維狀或網(wǎng)狀排列，與Ⅰ型膠原分布相一致。DCM組中見(jiàn)Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增多，排列紊亂，以炎細(xì)胞浸潤(rùn)的血管旁增多更為明顯?；偌t組介于兩者之間，接近NC組。

1.3.5.2 Ⅰ、Ⅲ型膠原含量 提取心肌組織，運(yùn)用免疫組化ABC法（親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法）檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量[6]。結(jié)果判定：組織中棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果，采用圖像分析軟件對(duì)染色陽(yáng)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定灰度均值和陽(yáng)性面積百分比，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)以免疫組化陽(yáng)性指數(shù)（灰度均值×陽(yáng)性面積百分比）表示。

1.3.6 Western印跡檢測(cè) 提取心肌組織（細(xì)胞）總蛋白，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白為內(nèi)參照，以目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量[7]。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。測(cè)量TGF-β1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1、Smad、c-fos等蛋白含量。

1.3.7 CFb的免疫組化分析、Western印跡檢測(cè) 取第3代CFb制成細(xì)胞懸液，給予細(xì)胞不同處理，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法[4]檢測(cè)iNOS蛋白、Cyclin D蛋白的表達(dá)、檢測(cè)上清液中一氧化氮的變化、流式細(xì)胞儀（FCM ）檢測(cè)p27蛋白表達(dá)，Western印跡測(cè)量TGF-β1蛋白的含量，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白為內(nèi)參照，以目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.3.8 心肌組織 (細(xì)胞) 總RNA的提取和RT-PCR 取心肌組織約100 mg，放入勻漿器中，立即加入Trizol1 mL，在冰浴條件下用眼科剪將組織剪碎，用勻漿器將組織勻漿。棄上清，在冰浴中加入DEPC 20～30 μL, 輕彈管底，使DNA溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆?。合成cDNA，設(shè)計(jì)與合成相應(yīng)引物，進(jìn)行RT-PCR。測(cè)量相應(yīng)蛋白mRNA表達(dá)情況。以標(biāo)準(zhǔn)mRNA為內(nèi)參照，以目的mRNA條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 化橘紅干預(yù)后對(duì)血糖和心功能的影響

造模后的1、8、16、22周，化橘紅組大鼠的血糖比DCM組顯著降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，化橘紅組的左室收縮壓、左室腔內(nèi)壓力變化率最大值明顯高于DCM組（P＜0.05）；化橘紅組的左室舒張末壓與DCM組相比不同程度下降（P＜0.05，表1）。

表1 化橘紅干預(yù)后對(duì)血糖和心功能的影響（）

表1 化橘紅干預(yù)后對(duì)血糖和心功能的影響（）

組別n 左室腔內(nèi)壓力變化率最大值（±dp/dt max）1周8周16周22周血糖（mmol/L） 左室收縮壓（mmHg）左室舒張末壓（mmHg）化橘紅組145.53±0.596.61±1.078.83±1.2410.75±2.1613.82±3.186.28±2.044.29±1.39 DCM組118.72±1.3710.28±2.3614.47±4.1919.28±6.039.52±2.049.19±3.232.37±0.68 t-1.532-2.416-3.313-3.9122.621-2.1281.372 P 0.0410.0230.0190.0080.0170.0320.048

2.2 光鏡下心肌形態(tài)學(xué)改變

從心肌組織切片看，NC組大部分心肌纖維形態(tài)均勻，排列成束，肌束內(nèi)見(jiàn)少量結(jié)締組織及豐富的毛細(xì)血管，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞及纖維化。DCM組可見(jiàn)大部分心肌纖維腫脹、肥大、疏松，排列紊亂，有的可見(jiàn)肌纖維斷裂、肥大，排列紊亂，甚至空泡變，細(xì)胞核固縮、裂解，細(xì)胞外間質(zhì)增加，局灶性纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)?；偌t組心肌纖維排列整齊，但是仍可見(jiàn)少部分區(qū)域肌纖維腫脹，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況

實(shí)驗(yàn)?zāi)┪覀儗?組大鼠的心肌組織標(biāo)本處理后分別對(duì)其各型膠原含量、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質(zhì)纖維化%相比較。①與DCM組比較，化橘紅組Ⅰ型膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質(zhì)纖維化%均有不同程度的下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。②DCM組與NC組比較，Ⅰ型膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值、心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原總含量、心肌間質(zhì)纖維化%均有顯著的上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表2）。

2.3 化橘紅干預(yù)對(duì)信號(hào)通路的影響

實(shí)驗(yàn)?zāi)?，化橘紅組的TGF-β1蛋白及mRNA、MMP-9、MMP-2、TIMP-1蛋白、c-fos蛋白及mRNA、Smad2蛋白和Smad7蛋白的表達(dá)與DCM組相比顯著下調(diào)（P＜0.05，表3）。

2.4 化橘紅對(duì)CFb增殖的影響

在實(shí)驗(yàn)?zāi)〤Fb模型中，與對(duì)照組相比，化橘紅預(yù)處理組的TGF-β1蛋白、iNOS蛋白、一氧化氮、p27蛋白、p27蛋白、Cyclin D蛋白表達(dá)均有顯著地上調(diào)（P＜0.05，表4）。

3 討論

DCM主要的病理表現(xiàn)為心肌肥大，心室質(zhì)量/體質(zhì)量比（心臟質(zhì)量指數(shù)）增加，局灶性心肌壞死，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，心肌纖維化[8]。DCM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的異常[9]、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活[10]、葡萄糖代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載[11]以及心肌間質(zhì)纖維化[12]有關(guān)。在心肌組織的整個(gè)膠原網(wǎng)絡(luò)中，Ⅰ/Ⅲ型膠原起主要作用，I型膠原決定心肌的僵硬度，而Ⅲ型膠原則決定心肌的順應(yīng)性[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高俊杰等[14]研究相同，DCM組的大鼠與NC組相比較，其Ⅰ型膠原和Ⅰ/Ⅲ型膠原比值顯著增高，且心功能下降、心肌纖維化明顯。這反映了心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維沉積及纖維化是臨床上引起DCM的重要因素。柚皮苷是化橘紅中重要的活性物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外研究顯示，柚皮苷可有效改善糖尿病時(shí)的糖代謝，降低血糖[4]，同時(shí)減少心肌損傷，保護(hù)心肌，改善心功能[15]。在本次實(shí)驗(yàn)中，化橘紅組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的血糖，與DCM組相比，均明顯下降；其心收縮、舒張功能有不同程度的改善。綜合病理形態(tài)學(xué)結(jié)果也證實(shí)化橘紅確實(shí)能改善DCM大鼠的糖代謝，對(duì)大鼠心肌有確切的保護(hù)作用。

表2 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況（）

表2 3組大鼠心肌各型膠原含量與心肌纖維化情況（）

*P＜0.05 vs DCM組;#P＜0.05 vs NC組.

組別nⅠ型膠原含量(*103)Ⅰ/Ⅲ型膠原比值 心肌羥脯氨酸含量（μg/mg） 心肌膠原總含量（μg/mg） 心肌間質(zhì)纖維化（%）化橘紅組14104.52±43.23*1.14±0.22*0.57±0.24*4.38±0.79*19.37±9.16*DCM組11126.27±53.71#1.52±0.31#0.87±0.39#6.93±1.75#37.26±16.03#NC組1583.63±32.160.84±0.220.36±0.173.52±0.252.21±0.35

表3 化橘紅干預(yù)對(duì)信號(hào)通路的影響（，%）

表3 化橘紅干預(yù)對(duì)信號(hào)通路的影響（，%）

組別nTGF-β1 mRNATGF-β1MMP-9MMP-2TIMP-1Smad2Smad7c-fosc-fos mRNA化橘紅組1446.38±22.7134.29±10.3725.38±8.1625.94±15.4823.73±7.0426.34±9.1921.47±7.1225.78±11.4834.79±16.38 DCM組1171.23±39.1963.12±21.47 49.29±17.3753.28±31.4745.81±15.1051.28±19.1643.19±18.3844.39±20.1953.28±23.29 t-8.192-6.729-5.3813.192-5.102-5.729-4.982-5.720-6.182 P 0.0000.0020.0080.0310.0130.0110.0190.0150.006

表4 化橘紅對(duì)CFb增殖的影響（，%）

表4 化橘紅對(duì)CFb增殖的影響（，%）

組別nTGF-β1iNOS一氧化氮p27Cyclin D對(duì)照組1431.28±16.2621.84±11.7412.28±6.813.14±1.0524.12±9.64化橘紅預(yù)處理組1149.19±23.8330.17±15.1220.16±8.185.92±2.13 37.29±16.12 t-5.917-3.117-2.921-1.883-4.039 P 0.0080.0210.0350.0420.009

研究表明，TGF-β1/Smad通路是DCM炎癥反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)[16-17]。TGF-β1可以增加大鼠心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原和誘導(dǎo)其分化為心肌成纖維細(xì)胞能力，使膠原蛋白增加，加劇心肌纖維化[14]。而Smads作為T(mén)GF-β1受體胞內(nèi)激活底物, 除可介導(dǎo)TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還可介導(dǎo)其下游致心肌纖維化和心肌肥厚的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化橘紅組的大鼠較DCM組，其TGF-β1蛋白與mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，Smad2、7蛋白的表達(dá)也明顯降低。在心肌成纖維細(xì)胞模型中，化橘紅預(yù)處理組的TGF-β1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組。表明化橘紅能有效通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路，抑制DCM大鼠的心肌纖維化進(jìn)程。

心肌MMPs是基質(zhì)降解的主要調(diào)節(jié)因子，其活性增強(qiáng)見(jiàn)于DCM中[19]，同時(shí)伴隨組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1蛋白表達(dá)的上調(diào)，MMPs/TIMPs系統(tǒng)與膠原的降解有重要關(guān)系[20]。在本研究中，化橘紅組與DCM組相比，TGF-β1和MMPs蛋白的表達(dá)均有所下調(diào)，該結(jié)果與Siena[21]的研究類(lèi)似。TGF-β作為MMPs/TIMPs系統(tǒng)重要的調(diào)控因子，本實(shí)驗(yàn)顯示化橘紅通過(guò)對(duì)其表達(dá)的抑制，調(diào)控MMPs/TIMPs，改善心肌膠原的降解作用，從而改善心肌纖維化進(jìn)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，用化橘紅干預(yù)過(guò)的大鼠、心肌成纖維細(xì)胞，其氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)也下降，如c-fos蛋白[22]、一氧化氮[23]、iNOS蛋白、p27蛋白[24]、Cyclin D蛋白[25]等。這些結(jié)果提示化橘紅調(diào)控DCM的心肌纖維化進(jìn)程可能還與多種通路相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示化橘紅對(duì)DCM有明顯的積極作用，尤其能調(diào)控其心肌纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)化橘紅進(jìn)一步提純應(yīng)用于DCM治療用藥有參考意義。同時(shí)，明確化橘紅對(duì)TGF-β1/Smad通路的調(diào)控作用能進(jìn)一步完善其藥理機(jī)制，使其應(yīng)用在更多疾病的治療中。因此，化橘紅對(duì)DCM中TGF-β1/Smad通路起到了抑制作用，從而調(diào)控其下游的MMPs/TIMPs等通路，改善DCM的心肌纖維化進(jìn)程，抑制心肌肥厚，減少心肌的損傷。而化橘紅對(duì)于DCM心肌纖維化的抑制作用是否還存著其他重要通路，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

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Effect of exocarpium on TGF-β1/Smad signal pathway in diabetic cardiomyopathy rat myocardial cells

YANG Cheng1, LIU Liwei21Department of Internal Medicine, Zhaoqing Medical College, Zhaoqing 526060, China;2the Second Clinical College, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China

ObjectiveTo observe the effect of exocarpium on TGF-β1/Smad signal pathway in diabetic cardiomyopathy (DCM)rat myocardial cells.Methods1) To construct the model of DCM rats, 40 rats were treated with streptozotocin, 15 rats with blood glucose ＜16.7 mmol/L were in blank control group. The remaining 25 rats with blood glucose ＞16.7 mmol/L were randomly divided into diabetic cardiomyopathy group (DCM group, n=11) and exocarpium group (n=14). Rats of exocarpium group were given exocarpium [400 mg/(kg·d)], DCM group and control group were given normal saline. Different time of blood glucose (1, 8, 16, 22 weeks) were measured.Heart function index measurement, myocardial morphological changes were observed under light microscope.Quantitative analysis of myocardial fibrosis was performed by electron microscopy.Myocardial collagen amount, myocardial collagen content was determined by immunohistochemistry. Western blot detection of myocardial protein of TGF-β1, Smad, MMP-9, MMP-2, TIMP-1 and RT-PCR detection of mRNA of TGF-β1, MMP-9, MMP-2,TIMP-1.2) To construct the myocardial fibroblast proliferation model.All were randomly divided into two groups, there is serum medium with 0.5 mmol L-1 exocarpium in exocarpium pretreatment group, while the control group with serum medium. To detect two groups of NO changes, TGF-β1 protein, c-fos protein, p27 protein, iNOS protein, the expression of Cyclin D protein.ResultsCompared with DCM group, each time point of blood glucose, myocardial fibrosis, myocardial collagen and the total collagen were significantly decreased and systolic, diastolic function improved significantly In exocarpium groups (P＜0.05). TGF-β1, Smad, MMP-9, MMP-2, TIMP-1 protein expression were significantly reduced in exocarpium groups (P＜0.05). Protein mRNA expression was significantly inhibited in exocarpium groups (P＜0.05). Compared with control group, NO, TGF-β1 protein, c-fos protein, p27 protein, iNOS protein, Cyclin D protein decreased significantly in pretreatment group (P＜0.05).ConclusionExocarpium on TGF-β1/Smad pathway in diabetic cardiomyopathy performs an effect of inhibitory. It regulates downstream MMPs/TIMPs pathway, improve myocardial fibrosis, inhibit myocardial hypertrophy and reduce myocardial injury.

exocarpium; diabetic cardiomyopathy; TGF- β1; smad

2017-03-14

肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校創(chuàng)新強(qiáng)校工程建設(shè)項(xiàng)目（20140412）

楊 澄，醫(yī)師，博士，E-mail： zqmcyc@126.com；