聯(lián)合檢測(cè)EZH2、Ki67在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性①

馮亞靜，田 寅，陳高輝，曹玉杰，周 昱

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

聯(lián)合檢測(cè)EZH2、Ki67在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性①

馮亞靜，田 寅，陳高輝，曹玉杰，周 昱

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物 2(Enhancerofzestehomolog2，EZH2)和增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)在人乳腺癌中的表達(dá)及二者表達(dá)的相關(guān)性。方法：對(duì)50例乳腺癌石蠟包埋的組織標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)EZH2、Ki-67的表達(dá)情況，分析其與臨床病理因素的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。結(jié)果：①乳腺癌EZH2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率分別為78%、62%，明顯高于癌旁正常組織的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②二者的表達(dá)與患者發(fā)病年齡、絕經(jīng)情況無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③乳腺癌中二者呈正相關(guān)表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 ：乳腺癌中EZH2、Ki-67的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，二者表達(dá)呈正相關(guān)。

乳腺癌;EZH2;Ki-67;聯(lián)合監(jiān)測(cè);相關(guān)性

隨著時(shí)代的發(fā)展，乳腺癌儼然已成為一種嚴(yán)重威脅女性健康,隨著飲食習(xí)慣及環(huán)境變化和人們生活水平的提高發(fā)病率逐年升高的惡性腫瘤之一[1]。EZH2是在PCG基因家族中起著核心作用的一個(gè)成員，它被研究發(fā)現(xiàn)歸屬轉(zhuǎn)錄抑制因子的一種，高表達(dá)于各種癌組織中[2]，密切相關(guān)于增殖腫瘤細(xì)胞。Ki-67是一種核抗原，高表達(dá)于增殖期細(xì)胞中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其可作為細(xì)胞增殖活性的反映。國(guó)內(nèi)外研究顯示，許多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后均與EZH2 和Ki67 的異常表達(dá)息息相關(guān)。但聯(lián)合檢測(cè)EZH2與Ki67 在乳腺癌中的相關(guān)研究鮮有論述。

1 材料與方法

1.1 材料

選取50例2014～2016年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科的乳腺癌手術(shù)患者的包埋石蠟標(biāo)本及50例乳腺癌旁組織包埋的蠟塊標(biāo)本。選取標(biāo)準(zhǔn)：選取患者術(shù)前均沒(méi)有行內(nèi)分泌口服治療、卵巢去勢(shì)治療、靶向治療、放化療及其他治療方法。選取標(biāo)本均經(jīng)本院病理組織學(xué)檢查證實(shí)。

標(biāo)本處理:福爾馬林緩沖溶液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，石蠟切片(3μm)，后貼于載玻片上，烘片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 主要試劑

濃縮型鼠抗人EZH2單克隆抗體(CellSignalingTech-nology，USA)、濃縮型鼠抗人Ki-67單克隆抗體(CellSignalingTech-nology，USA),免疫組織化學(xué)試劑盒、顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

采用Envision免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)EZH2和Ki-67的表達(dá)，操作嚴(yán)格依照購(gòu)置試劑盒說(shuō)明書(shū)，用PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。脫蠟至水，陽(yáng)性對(duì)照組為已知陽(yáng)性乳腺癌組織。抗原修復(fù)，滴加一抗4℃過(guò)夜，二抗孵育，顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

結(jié)果判定:EZH2和Ki-67二者均主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色為顯微鏡下胞核見(jiàn)黃色顆粒沉淀，陰性即不染色。染色結(jié)果采取雙盲法觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)觀察高倍視野(×400)5個(gè)，對(duì)各個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)、細(xì)胞總個(gè)數(shù)行計(jì)數(shù)。最后結(jié)果采取半定量積分法來(lái)分析。按文獻(xiàn)參照染色強(qiáng)度評(píng)分[3]：0分、1分、2分、3分分別為不顯色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。百分比評(píng)分(陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例)：0分、1分、2分、3分、4分，分別為陰性、陽(yáng)性細(xì)胞<25%、25%～50%、50%～75%、>75%。總體評(píng)分值=評(píng)分(染色強(qiáng)度)×評(píng)分(陽(yáng)性細(xì)胞比例)，判定：陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)分別為總分≤3 分、>3分且≤5分、>5分且≤7分、>7 分。

坐落在揚(yáng)州的江蘇虎豹集團(tuán)，創(chuàng)建于1989年。集團(tuán)擁有15家分公司，涉及服裝、商貿(mào)、旅游、房地產(chǎn)、金融等行業(yè)，現(xiàn)有職工12000多人，實(shí)現(xiàn)年銷(xiāo)售40億元人民幣，其中內(nèi)外銷(xiāo)服裝銷(xiāo)售25億元以上，主導(dǎo)產(chǎn)品“虎豹”牌襯衫、西服、休閑服等，憑借其卓越的品質(zhì)，遠(yuǎn)銷(xiāo)全國(guó)及歐美、日韓等國(guó)家。先后榮獲中國(guó)十大名牌、中國(guó)服裝行業(yè)首批“中國(guó)馳名商標(biāo)”、“中國(guó)最具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力品牌”和“中國(guó)500最具價(jià)值品牌”等國(guó)家大獎(jiǎng)，為創(chuàng)立享譽(yù)世界的“虎豹”品牌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 ，樣本陽(yáng)性率用χ2檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EZH2表達(dá)

EZH2陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞核。EZH2在乳腺癌中、癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78%、30%，在乳腺癌及癌旁正常組織中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 23.19，P<0.05),見(jiàn)表 1。

表1 乳腺癌及乳腺癌旁正常組織中EZH2的表達(dá)(例數(shù))

2.2Ki-67表達(dá)

Ki-67陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞核。Ki-67在乳腺癌中、癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62%、34%，Ki-67在乳腺癌及癌旁正常組織中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.85，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌及乳腺癌旁正常組織中Ki-67的表達(dá)

2.3EZH2與臨床病理因素的關(guān)系

見(jiàn)表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EZH2的表達(dá)與組織分化、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與年齡、絕經(jīng)情況無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 EZH2與臨床病理因素的關(guān)系

2.4Ki-67與臨床病理因素的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Ki-67的表達(dá)與組織分化、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與年齡、絕經(jīng)情況無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 Ki-67與臨床病理因素的關(guān)系

2.5EZH2與Ki-67二者的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EZH2與Ki-67表達(dá)成正相關(guān)(χ2=3.93，P<0.05) ，見(jiàn)表 5。

表5 乳腺癌中EZH2 與 Ki-67的相關(guān)性

3 討論

EZH2在PCG基因家族中扮演著重要角色,細(xì)胞的生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)與其相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖主要是抑制染色質(zhì)中的靶點(diǎn)基因,增殖細(xì)胞進(jìn)入S期與其高表達(dá)相關(guān)。原代細(xì)胞的生長(zhǎng)能力增強(qiáng),EZH2在多種原發(fā)腫瘤中表達(dá),密切相關(guān)于腫瘤的形成和生長(zhǎng)[4]。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子之一的EZH2蛋白，多種基因的活性可被其抑制,尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,即EZH2一定程度上能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。姚凡等[6]采用免疫組化法檢測(cè)EZH2在乳腺癌(共105例)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中EZH2陽(yáng)性表達(dá)率為 69.5%，并分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤惡性程度與其表達(dá)水平有正相關(guān)性，ER表達(dá)和乳腺癌預(yù)后與其表達(dá)有負(fù)相關(guān)性，由此發(fā)現(xiàn)乳腺癌惡性細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與EZH2的表達(dá)密切相關(guān)。

作為位于細(xì)胞核內(nèi)[7]的一種大分子蛋白質(zhì)，細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原Ki67蛋白簡(jiǎn)稱Ki67。Gerdes[8]等發(fā)現(xiàn)Ki67 除外G0期不表達(dá)，其他G1、G2、S、M期均表達(dá)。后又有發(fā)現(xiàn)Ki67[9]在活躍增值組織高度表達(dá)，低表達(dá)于靜止細(xì)胞中，二者研究均吻合，其他國(guó)內(nèi)外研究亦驗(yàn)證了這一結(jié)論，有許多學(xué)者已將其作為細(xì)胞增殖度的標(biāo)志之一[10]。隨著生物醫(yī)學(xué)發(fā)展，另有證明存在Ki67 對(duì)乳腺癌預(yù)后判斷也有參考意義的依據(jù)。

目前,EZH2和Ki67蛋白聯(lián)合監(jiān)測(cè)的表達(dá)在膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胃癌中的表達(dá)研究較多。EZH2、Ki67在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、胃癌中的表達(dá)明顯增高,而且和未轉(zhuǎn)移者相比預(yù)后較差。二者可作為腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測(cè)結(jié)腸癌、胃癌的演變。目前在國(guó)外關(guān)于兩種蛋白EZH2和Ki67聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,而在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究試圖采用免疫組化方法,通過(guò)對(duì)EZH2和Ki67兩種蛋白在癌旁正常組織及乳腺癌組織中表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè),在探討其與乳腺癌各臨床病理參數(shù)的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步探討二者表達(dá)的相關(guān)性及此種相關(guān)性可能蘊(yùn)含的臨床意義，即與診斷、治療以及預(yù)后的關(guān)系。

[1]王新，韓麗麗，趙海豐，等．PDCD4、mTOR在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J]． 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2016，39(1):82-86

[2]包合新,李建國(guó),邢桂濱．EZH2和Bmi-1基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J]． 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37(1) :10-12

[3]周穎，曾林波，李喆．甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者肝功能生化指標(biāo)的測(cè)定及其臨床意義 [J]．標(biāo)記免疫分析與臨床，2010，17(2)：115-116

[4]ChenH,RossiterC,AntonorakisSE.CloningofahumanhomologoftheDrosophilaenhancerofzestegene(EZH2)thatmapstochromosome21q22.2 [J].Genomics,1996,38:30

[5]HillierLW,FultonLA.TheDNAsequenceofhumanchromosome7[J]．Nature,2003,424:157

[6]姚凡, 劉崇,房月,等.EZH2在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 25(2):143-146

[7]DowsettM,SmithIE,EbbsSR,etal.PrognosticvalueofKi67expressionaftershort-termpresurgicalendocrinetherapyforprimarybreastcancer[J].JNatlCancerInst, 2007, 99(13):167-170

[8]GerdesJ，SchwabU，LemkeH.ProductionofamousemonoclonalantibodyreactivewithahumannuclearantigenassociatedwithcellProliferation[J]．IntJCancer,1983，31：13-20

[9]AnderUrruticoechea，IanESmith，MitchDowsett,etal．ProliferationmarkerKi-67inEarlybreastcancer[J]．Nature,2005，23(28)：7212-7220

[10]XuT,ZhuY,XiongY,etal.Ki67suppressestumorigenicityandregulatesG1/Stransitionofhumanhepatocellularcarcinomacells[J].Hepatology, 2009, 50(1):113-121

佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016-061。

馮亞靜(1989～)女，河南新鄭人，在讀碩士研究生。

周昱(1969～)男，黑龍江雙鴨山人，學(xué)士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：zhouyu731@126.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0080-02

2016-08-20)