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    JNK通路參與Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程①

    2017-07-03 15:31:17王國輝王麗華秦麗紅高鳳榮王昆祥
    黑龍江醫(yī)藥科學(xué) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞孵育磷酸化

    王國輝,王麗華,秦麗紅,王 璇,高鳳榮,王昆祥

    (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

    JNK通路參與Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程①

    王國輝,王麗華,秦麗紅,王 璇,高鳳榮,王昆祥

    (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

    目的:探討在Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程中JNK通路的作用。方法:應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h對海馬神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響;在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入JNK阻斷劑SP600125(10μM)共同孵育12h、24h和48h,應(yīng)用Hoehest33342染色和MTT法檢測SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用后對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:在不同時間點(diǎn),JNK磷酸化水平均增加,24h表達(dá)最顯著(P<0.01);給予SP600125后可使Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡明顯減輕。結(jié)論:Aβ1-40激活JNK通路后促進(jìn)了海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。

    Aβ1-40;JNK;凋亡

    c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)超家族的成員之一。JNK通路常存在于多種生命過程中,如細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡等[1],是一條與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。有文獻(xiàn)報道,JNK通路可被多種凋亡刺激因素所激活,而且當(dāng)JNK活性降低或JNK通路被抑制時,可在一定程度上對神經(jīng)細(xì)胞的死亡起到保護(hù)作用[2]。而大量研究證實(shí),阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是由β-淀粉樣多肽(Aβ)聚集誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至凋亡所致[3,4]。因此,對JNK通路的研究有助于為揭示AD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-40和SP600125為施加因素,觀察JNK通路在Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用,為探究AD的發(fā)病機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h),雌雄均可,購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

    1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品

    Aβ1-40購于Biosouxee公司,MTT、Hoechst33342、TEA購于Sigma公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1Westernblot技術(shù)

    將細(xì)胞經(jīng)裂解液處理后提取蛋白樣品,取50μg蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉1h,一抗孵育并4℃過夜,TBS-T溶液洗膜后孵育二抗1h,TBS-T溶液洗膜后進(jìn)行ECL顯影,掃片及數(shù)據(jù)處理分析。

    1.3.2MTT法

    在神經(jīng)干細(xì)胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),置37℃培養(yǎng)4h,吸去培養(yǎng)液后加入150μL二甲基亞砜(DMSO),低速振蕩10min,酶標(biāo)儀OD570nm處檢測各孔吸光值。

    1.3.3Hoechst33342法

    在細(xì)胞中加入4%多聚甲醛,與培養(yǎng)液以1:3混合,固定細(xì)胞10min。去除固定液,在各組細(xì)胞中加入Hoechst33342,37℃孵育15min。吸除染色液并洗滌后,直接在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1Aβ1-40慢性孵育對海馬神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響

    Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后,應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Aβ1-40對海馬神經(jīng)干細(xì)胞中JNK的影響。結(jié)果顯示,在不同時間點(diǎn),JNK磷酸化水平均增加,24h表達(dá)最顯著(n=3,P<0.05)。見圖1。

    圖1 Aβ1-40慢性孵育對海馬神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響

    *P<0.05

    2.2SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響

    在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM),與Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h,應(yīng)用MTT法觀察其對海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示,SP600125可明顯減輕Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡,使細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)。見圖2。

    圖2 SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響

    (與對照組相比#P<0.01;與Aβ1-40組相比*P<0.01)

    在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM),與Aβ1-40共同孵育48h,應(yīng)用Hoehest33342染色觀察其對海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡發(fā)生率的影響。結(jié)果顯示,SP600125可明顯降低Aβ1-40所引起的細(xì)胞凋亡發(fā)生率,由(18.2±1.7)%降至(8.1±06)%(P<0.01)。

    3 討論

    AD是一種與衰老相關(guān)并以記憶和認(rèn)知功能障礙為主要特征的退行性腦病,其主要病理特征為新皮層、海馬等處出現(xiàn)Aβ沉積形成的高度老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元的減少等[5]。其中,Aβ沉積形成老年斑進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至凋亡是AD發(fā)病的核心因素,因此,探究Aβ導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程是非常有必要的,它可為明確Aβ的毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。近年來有大量相關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo),JNK通路是一條與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)的常見信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6,7],因此,可以做進(jìn)一步研究以明確JNK通路是否參與了Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程,這對于揭示AD的發(fā)病機(jī)制有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-40和SP600125為施加因素,觀察了SP600125在Aβ1-40所

    誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用,結(jié)果顯示,Aβ1-40可增加JNK磷酸化水平的蛋白表達(dá);給予SP600125后可使Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡明顯減輕。這些結(jié)果表明,JNK通路的激活參與了Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程,即,Aβ1-40激活JNK通路后引起了海馬神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。在前期工作中發(fā)現(xiàn)延遲整流鉀通道也參與了Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程,那么,JNK通路與延遲整流鉀通道在Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程是否存在一定的聯(lián)系呢?在今后的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步研究,以更加明確Aβ1-40誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程的機(jī)制。

    [1]IpYT,DavisRJ.Signaltransductionbythec-JunN-terminalkinase(JNK)-frominflammationtodevelopment[J].CurrOpinCellBiol, 1998, 10:205-219

    [2]CarolMTroy,SylviaARabacchi,ZhihengXu,etal.β-Amyloid-inducedneuronalapoptosisrequiresc-JunN-terminalkinaseactivation[J].J-Neurochem, 2001, 77(1):157-164

    [3]田嘉瑩,盛寶英,齊志國.β1-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率及Caspase-3的活性變化[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(1):111-112

    [4]張金波,王淑秋,張虎,等.靈芝孢子粉對戊四氮活化海馬神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(4):34-35

    [5]VillafloresOB,ChenYJ,ChenCP,etal.Curcuminoidsandresveratrolasanti-Alzheimeragents[J].Taiwanesejournalofobstetrics&gynecology, 2012,51(4):515-525

    [6]DonnaBozyczko-Coyne,TeresaMO’Kane,Zhi-LiangWu,etal.CEP-1347/KT- 7515,aninhibitorofSAPK/JNKpathwayactivation,promotessurvivalandblocksmultipleeventsassociatedwithAβ-inducedcorticalneuronapoptosis[J].JournalofNeurochemistry, 2001, 77:849-863

    [7]欒倩,劉蕾,劉君星,等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經(jīng)元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(2):1-3

    黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目,編號:12521569。

    王國輝(1971~)男,黑龍江佳木斯人,碩士,副主任醫(yī)師。

    Q342+

    A

    1008-0104(2017)03-0008-02

    2017-03-18)

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