慢性牙周炎基礎(chǔ)治療前后齦溝液中MMP-3和TIMP-2水平的變化①

朱建華,賈會(huì)敏,劉繼光,李佳薇,苗藝?yán)_

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002)

慢性牙周炎基礎(chǔ)治療前后齦溝液中MMP-3和TIMP-2水平的變化①

朱建華,賈會(huì)敏,劉繼光,李佳薇,苗藝?yán)_

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討根據(jù)檢測(cè)慢性牙周炎基礎(chǔ)治療前后GCF中MMP-3的水平以及TIMP-2的水平和MMP-3/TIMP-2的比值。方法：選取15例經(jīng)臨床確診的慢性牙周炎患者口腔內(nèi)20顆重度牙周病的患牙的齦溝液(GCF)樣本，同時(shí)選取15例健康對(duì)照組患者口腔內(nèi)的20個(gè)牙位的GCF樣本，采用ELISA實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)患牙齦溝液中MMP-3和TIMP-2的含量，MMP-3/TIMP-2比值。在開(kāi)始治療前采集被選患者的GCF，同時(shí)也要對(duì)臨床相關(guān)的指標(biāo)詳細(xì)探查，并在系統(tǒng)治療完成后以1個(gè)月時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)取樣。結(jié)果：牙周基礎(chǔ)治療結(jié)束后MMP-3和TIMP-2的總量與治療前相比顯著下降(P<0.05),治療前后MMP-3與TIMP-2的總量與對(duì)照組相比有顯著差別(P<0.05),治療結(jié)束后MMP-3與TIMP-2的比值與治療前相比顯著下降，并高于正常對(duì)照組MMP-3與TIMP-2的比值。MMP-3的含量與TIMP-2的含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論:慢性牙周病患者GCF中MMP-3和TIMP-2的水平以及MMP-3與TIMP-2的比值可用作監(jiān)測(cè)慢性牙周炎病情的敏感指標(biāo)。

慢性牙周炎；齦下刮治術(shù)；根面平整術(shù)；齦溝液；MMP-3；TIMP-2；ELISA

口腔病變對(duì)人類健康造成的危害已得到充分證實(shí)，其中一種疾病是在人類口腔中最常見(jiàn)的牙周病，近年來(lái)該疾病由于在全球范圍內(nèi)不斷上升的發(fā)病率而引起更多學(xué)者的深入研究。此前，牙周病變被認(rèn)為是引起牙周組織缺損以及造成牙齒缺失的確定性病因，因此，對(duì)牙周病的致病因素，進(jìn)展以及臨床治療的探究發(fā)揮十分重要的意義。在牙周病不斷進(jìn)展的過(guò)程中，特別是一些炎性因子逐漸的對(duì)牙周組織進(jìn)行破壞和分解，而MMPs及其抑制因子(TIMPs)作為能導(dǎo)致牙周病發(fā)生的蛋白水解酶起著重要作用。研究表明，在機(jī)體正常狀況下，MMPs與TIMPs二者間維持著動(dòng)態(tài)均衡的關(guān)系，兩者間的動(dòng)態(tài)均衡維護(hù)了牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和正常的功能。而在某些刺激因子的作用下，MMPs與TIMPs的比重超出正常范圍引起MMPs的過(guò)多分泌，促使細(xì)胞外基質(zhì)降解增多，因此在牙周病中二者之間的平衡關(guān)系被打破，表現(xiàn)在牙周方面的破壞成為造成牙周病發(fā)生的原因之一[1]。齦溝液檢測(cè)樣本的收集簡(jiǎn)單快捷方便，患者易于接受，適用人群范圍很廣。本課題通過(guò)測(cè)定齦溝液中MMP-3和TIMP-2的水平，研究二者之間的水平以及它們之間的平衡與慢性牙周炎的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)MMP-3和TIMP-2的水平來(lái)監(jiān)控病情，分析療效，二者含量的失衡有可能參與慢性牙周炎的病情發(fā)展，并將MMP-3與TIMP-2的比值作為新的因素進(jìn)行比較分析。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源：選取2016-01～2016-03來(lái)本醫(yī)院牙周黏膜病科就診并確診的慢性牙周病患者(根據(jù)1999年美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)的分類標(biāo)準(zhǔn))。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)任何全身系統(tǒng)性疾??；(2)至少在6個(gè)月之內(nèi)不曾使用抗生素或至少在3個(gè)月之內(nèi)未使用過(guò)非淄體類抗炎藥；(3)1年之內(nèi)無(wú)任何牙周病治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或者哺乳期的婦女；(2)吸煙的患者；(3)口腔內(nèi)的余留牙不足20顆；(4)有過(guò)正畸治療史。從完全適合以上標(biāo)準(zhǔn)的患者的口腔內(nèi)選擇1～2顆重度的牙周病患牙(牙周袋深度在6mm以上，附著喪失在5mm以上，牙槽骨在X線片上面顯示吸收程度在根長(zhǎng)的1/2以上甚至接近根長(zhǎng)的2/3)為試驗(yàn)牙，從15位患者口腔中選擇20顆試驗(yàn)牙，選中男9例，女6例，年齡20～60歲。

1.1.2 齦溝液樣本的采集：本研究采取濾紙條稱重法采集齦溝液，將濾紙條放入符合標(biāo)準(zhǔn)的受試牙牙周袋內(nèi)采集齦溝液，30s后取出，間隔2min在相同受試牙位置重復(fù)采集齦溝液，將樣本置于1.5mLEppendorf管中，立即稱重并記錄結(jié)果，隨后將收集的樣本存放于-20℃的冰箱中直到樣本收集完畢檢測(cè)MMP-3和TIMP-2的含量。

1.2 主要儀器和試劑

MMP-3ELISA試劑盒,TIMP-2ELISA試劑盒, 酶標(biāo)儀,MMP-3酶標(biāo)板,TIMP-2酶標(biāo)板, 低溫冰箱, 高速離心機(jī)。

1.3 方法

依據(jù)ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)齦溝液中的MMP-3和TIMP-2。按照ELISA的試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，將全部收集到存放于冰箱內(nèi)的樣本取出放于室溫下一次性解凍，加入約250μLPBS緩沖液(pH=7.4)，使用振蕩器恒溫震蕩1h，之后使用400r的高速離心機(jī)以10000r/min的速率離心10min，以去除多余的雜質(zhì)。取上清液分別裝入之前準(zhǔn)備好的兩只干凈離心管內(nèi)，用MMP-3和TIMP-2試劑盒測(cè)定MMP-3和TIMP-2的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

牙周基礎(chǔ)治療前后與正常對(duì)照組間齦溝液的量均有顯著差異(P<0.05)。牙周基礎(chǔ)治療完成后MMP-3，TIMP-2的總量與治療前相比顯著降低(P<0.05)，治療前后MMP-3，TIMP-2的總量與正常對(duì)照組MMP-3，TIMP-2的總量對(duì)比有顯著差異(P<0.05)。

牙周基礎(chǔ)治療結(jié)束后MMP-3與TIMP-2的比值與治療前對(duì)比下降(P<0.05)，治療結(jié)束后MMP-3與TIMP-2的比值高于正常對(duì)照組MMP-3與TIMP-2的比值(P<0.05)。MMP-3與TIMP-2在GCF中的含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01),見(jiàn)表1～3。

表1 牙周基礎(chǔ)治療前后與正常對(duì)照組間齦溝液量的對(duì)比

表2 牙周基礎(chǔ)治療前后與正常對(duì)照組之間齦溝液量的對(duì)比±s,n=20,ng/μL)

表3 牙周基礎(chǔ)治療前后以及正常對(duì)照組MMP-3和TIMP-2的含量

3 討論

牙周病是由于炎癥因子的刺激而以破壞牙周組織為主的慢性進(jìn)行性變病，在牙周組織逐漸受損的過(guò)程中，MMPs發(fā)揮非常重要的作用[2]。近年來(lái)很多研究采取收集患牙的齦溝液來(lái)探討慢性牙周炎與MMPs水平之間的關(guān)系，在正常的情況下，有大量的菌斑微生物存在于齦溝內(nèi)，齦溝內(nèi)的滲透梯度處于不斷的變化中，故齦溝內(nèi)會(huì)存在少量的齦溝液，當(dāng)牙周組織由于刺激而發(fā)生炎癥時(shí)，齦溝以及結(jié)締組織發(fā)生水腫，同時(shí)齦溝液的總量會(huì)明顯增加[3]。而本實(shí)驗(yàn)表明：牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液的量與正常對(duì)照組齦溝液的量均有顯著差異(P<0.05)。而MMP-3是一種基質(zhì)溶解素，可以激活不同類型的MMPs，使它們由最初的酶原形式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腗MPs，從而導(dǎo)致牙周骨質(zhì)的降解和改建，對(duì)于加重牙周組織炎癥起到很關(guān)鍵的作用[4，5]。MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)參與人體內(nèi)結(jié)締組織的降解，重建，一些炎癥反應(yīng)等生理病理過(guò)程[6]。然而TIMPs在體內(nèi)對(duì)MMPs起到一定的抑制作用[7]，目前TIMPs家族包括4種：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，它們?cè)隗w液和組織內(nèi)分布非常廣泛，TIMPs能夠結(jié)合MMPs的催化部位，對(duì)MMPs降解ECM進(jìn)行抑制，MMPs和TIMPs在體內(nèi)維持著ECM降解和分泌的平衡[8]。有研究報(bào)道，有不同種類的基因?qū)MPs，TIMPs的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，而TIMPs的表達(dá)同樣受到MMPs的影響，從而構(gòu)成十分錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在機(jī)體組織發(fā)生炎癥時(shí)，MMPs的表達(dá)與TIMPs的表達(dá)相比呈增高的趨勢(shì)，因此，這種情況導(dǎo)致破壞，降解機(jī)體的炎癥組織。同時(shí)，在牙周組織發(fā)生重度的炎癥時(shí)，組織中會(huì)存在許多炎性細(xì)胞，包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等能夠生成TIMPs，而當(dāng)牙周組織的炎癥得到有效的控制后，隨之組織中的炎性細(xì)胞會(huì)相對(duì)減少，產(chǎn)生TIMPs的量同時(shí)也會(huì)對(duì)應(yīng)減少[9，10]。在人體正常組織中MMPs與TIMPs的合成與降解存在一定的比例關(guān)系，當(dāng)人體組織由于某種刺激而發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MMPs的分泌增多，造成ECM和基底膜發(fā)生降解，同時(shí)其抑制因子TIMPs的含量會(huì)相應(yīng)升高對(duì)機(jī)體起到保護(hù)的作用。本研究結(jié)果顯示：牙周基礎(chǔ)治療結(jié)束后，MMP-3，TIMP-2的總量與治療前對(duì)比明顯降低，治療前后MMP-3，TIMP-2的總量與正常對(duì)照組MMP-3，TIMP-2的總量對(duì)比有明顯差異。同時(shí)，本研究表明：牙周基礎(chǔ)治療完成后，MMP-3和TIMP-2的比值與治療前對(duì)比明顯降低，治療結(jié)束后MMP-3與TIMP-2的比值高于正常對(duì)照組MMP-3與TIMP-2的比值。而本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)：在系統(tǒng)的牙周基礎(chǔ)治療完成后，MMP-3和TIMP-2的含量與治療前對(duì)比顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

本研究通過(guò)檢測(cè)慢性牙周炎患者牙周基礎(chǔ)治療前后GCF中MMP-3和TIMP-2的含量以及MMP-3與TIMP-2的比值與正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢性牙周病患者牙周基礎(chǔ)治療前后GCF中MMP-3，TIMP-2的含量以及MMP-3與TIMP-2的比值有顯著差異(P<0.05)。因此，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MMP-3與TIMP-2的比值可以用來(lái)客觀評(píng)價(jià)牙周組織的健康狀況和疾病狀態(tài)，牙周病變的治療效果以及監(jiān)控慢性牙周病的病情發(fā)展。

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Changes of MMP-3 and TIMP-2 levels in gingival crevicular fluid before and after treatment in patients with chronic periodontitis

ZHUJian-hua,JIAHui-min,LIUJi-guang,LIJia-wei,MIAOYi-bin

(The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective: To explore the basis through the detection of chronic periodontitis before and after treatment in gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase factor -3 (MMP-3) and the level of matrix metalloproteinase inhibitor -2 (TIMP-2) and the ratio of MMP-3/TIMP-2. Methods: GCF selected 15 teeth with clinically diagnosed patients with chronic periodontitis oral 30 severe tooth the week's disease (GCF) samples, and 15 cases of healthy control group GCF samples of 30 teeth in the oral cavity of the patient who suffered from MMP-3 and TIMP-2, were detected in gingival crevicular fluid by ELISA assay, The ratio of MMP-3/TIMP-2. The GCF was collected and the clinical examination should be at the end of treatment and 4 weeks after treatment. Results: after basic periodontal treatment and treatment of total MMP-3 and TIMP-2 decreased significantly than before (P<0.05),andtheamountofTIMP-2MMP-3beforeandaftertreatmentcomparedwiththecontrolgroupweresignificantlydifferent(P<0.05),treatmentaftertreatmentwithTIMP-2andMMP-3ratiothanbeforesignificantlydecreased,andhigherthanthatinthenormalcontrolgroupandMMP-3.MMP-3ratioofTIMP-2andthecontentofTIMP-2wassignificantly.Conclusion: MMP-3 and TIMP-2 levels in patients with chronic periodontitis (P<0.01)andtheratioofMMP-3toTIMP-2maybeusedasasensitiveindexformonitoringtheconditionofchronicperiodontitis(GCF).

chronic periodontitis；subgingival scaling and root planing；gingival crevicular fluid；MMP-3；TIMP-2；ELISA

佳木斯大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016 078。

朱建華(1959～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

劉繼光(1961～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:13633645349@163.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0065-03

2016-11-12)