環(huán)六縮酚肽抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制①

劉麗秋，王 莉，崔國利，周奎臣，辛 華，江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

環(huán)六縮酚肽抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制①

劉麗秋，王 莉，崔國利，周奎臣，辛 華，江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：分析環(huán)六縮酚肽對人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的增殖活性作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。方法：設(shè)置空白對照組(加入0.1% 二甲基亞砜)、陽性對照組(加入奧沙利鉑)和環(huán)六縮酚肽組(加入環(huán)六縮酚肽)3組，利用噻唑藍(lán)(MTT)法測定各組人PC-3細(xì)胞的增殖率，利用TUNEL法測定各組人PC-3細(xì)胞的凋亡率，利用Westernblot法測定各組人PC-3細(xì)胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的調(diào)控情況。結(jié)果：培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞增殖率為(35.8±2.78)%、(44.8±3.00)%和(32.3±1.96)%、(38.1±2.12)%，人PC-3細(xì)胞凋亡率為(45.2±3.60)%、(48.2±3.71)%和(48.3±3.07)%、(50.1±4.15)%，與空白對照組的(100.0±2.16)%、(100.0±2.61)%和(6.0±0.95)%、(6.3±1.05)%對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：環(huán)六縮酚肽具有抑制人PC-3細(xì)胞增殖及凋亡的作用，通過caspase-3和Bax可對PC-3細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)。

前列腺癌細(xì)胞；環(huán)六縮酚肽；細(xì)胞凋亡；抑制活性

生物體內(nèi)活性肽為分子聚合物，介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間，在生理學(xué)上具有重要的研究價(jià)值和意義[1]。環(huán)肽的穩(wěn)定性較線性多肽強(qiáng)，其具有多種醫(yī)藥價(jià)值和生理功能，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[2]。本研究在土壤真菌中對三種環(huán)六縮酚肽化合物進(jìn)行分離，并對環(huán)六縮酚肽抑制人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)增殖活性及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在為環(huán)肽類化合物的進(jìn)一步運(yùn)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

本研究所選用的PullularinC、PseudodestruxinC和DestruxinB三種環(huán)六縮酚肽化合物均由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室提供；RPMI1640 培養(yǎng)基由上海博升生物科技有限公司提供；噻唑藍(lán)(MTT)由上海士鋒生物科技有限公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒(顯色法)由美國MerckMillipore公司提供；Bax和β-actin抗體均由SantaCruzBiotechnology公司提供；Caspase抑制劑/凋亡抑制劑Z-VAD-FMK由上海前塵生物科技有限公司提供。人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)由中國科學(xué)院提供，在直徑100mm的培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，于5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。

1.2 方法

(1)MTT法[3]

人PC-3細(xì)胞懸浮接種于96孔板上，50μL/孔，設(shè)置空白對照組、陽性對照組、環(huán)六縮酚肽組3組，即加入0.1% 二甲基亞砜(DMSO)溶劑，加入奧沙利鉑，加入環(huán)六縮酚肽；各組設(shè)3復(fù)孔，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，各孔添加5g·L-1MTT10μL，采用酶聯(lián)免疫檢測儀對吸光度值(OD值)進(jìn)行測定，得出細(xì)胞增殖抑制率。

(2)TUNEL法[4]

人PC-3細(xì)胞懸浮接種于8孔玻片中，400μL/孔，20h后添加PullularinC(終濃度1μmol·L-1)。12h后，使用5%多聚甲醛(PFA)固定，pbs緩沖液浸洗；TritonX-100通透液通透后，根據(jù)操作說明書進(jìn)行TUNEL法檢測。隨機(jī)選取5個高倍視野，記數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞所占百分比的平均值作為細(xì)胞凋亡率。

(3)Westernblot法[5]

以2×106個細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種PC-3細(xì)胞，添加陽性對照順鉑(終濃度2μmol·L-1)和PullularinC培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，提取蛋白50μg，于SDS-PAGE電泳下分離、轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗后，洗膜并添加ECL試劑，利用膠片曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件TheSASsystem6.12處理數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人PC-3細(xì)胞的增殖

培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞增殖率降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組前列腺癌細(xì)胞增殖率的對比±s，%)

2.2 人PC-3細(xì)胞的凋亡

培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞凋亡率增加，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組前列腺癌細(xì)胞凋亡率的對比±s，%)

2.3 人PC-3細(xì)胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的調(diào)控

陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3 討論

前列腺癌是男性患者常見的惡性腫瘤，常規(guī)抗癌藥物易產(chǎn)生耐藥性，故尋求高效低毒的治療藥物成為臨床研究的重點(diǎn)，其中在自然界中尋找新的抗癌活性成分也成為臨床研究的熱點(diǎn)問題之一[6,7]。本研究對人前列腺癌進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)六縮酚酞可對人前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生一定作用，其作用明顯優(yōu)于奧沙利鉑[8]。近幾年來，多肽類物質(zhì)治療癌癥的研究越來越多，已有研究證實(shí)多肽類物質(zhì)治療癌癥的臨床療效十分明顯，其具有不良反應(yīng)少、抗癌活性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[9]。環(huán)六縮酚肽屬于小分子多肽類物質(zhì)，其表現(xiàn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與線性多肽相比，環(huán)六縮酚酞的性質(zhì)更加穩(wěn)定。在前列腺癌組培養(yǎng)液中添加環(huán)六縮酚肽，培養(yǎng)24h和48h后，環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞增殖率降低、凋亡率升高，且第三代鉑類抗癌藥奧沙利鉑與環(huán)六縮酚肽抑制前列腺癌細(xì)胞生長、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用相當(dāng)，其中環(huán)六縮酚肽的作用更加明顯?，F(xiàn)有的研究結(jié)果證實(shí)：線粒體/細(xì)胞色素C/Caspase-9/Caspase-3是人體細(xì)胞凋亡的主要途徑[10]，機(jī)體在接收外界信號后，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)的外界信號激活Caspase-3，激活Caspase-3使細(xì)胞核內(nèi)DNA剪切，從而產(chǎn)生促使細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞在凋亡過程中，機(jī)體會通過對Caspase-3活性的調(diào)節(jié)對細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控，同時通過對線粒體功能進(jìn)行調(diào)控也可對細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控。線粒體功能的調(diào)控過程中，調(diào)控蛋白bcl-2和Bax的作用十分重要，然而bcl-2和Bax的作用又是完全不同的。bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，bcl-2和Bax結(jié)合可導(dǎo)致bcl-2抗細(xì)胞凋亡作用消失，而Bax則可促使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明環(huán)六縮酚肽通過激活Caspase-3促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，與此同時通過促進(jìn)Bax表達(dá)、抑制bcl-2表達(dá)對線粒體功能進(jìn)行調(diào)控，從而起到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖活性的作用。綜上所述，環(huán)六縮酚肽具有抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性的作用，通過本研究所證實(shí)的上述途徑可促使細(xì)胞凋亡，即通過caspase- 3、Bax、bcl-2介導(dǎo)誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡；但腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生是多途徑共同作用的結(jié)果，所以環(huán)六縮酚肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號：D201225；2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號：12Z1201504。

劉麗秋(1978～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主管技師。

江清林(1964～)男，黑龍江林口人，碩士，研究員，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:jqljms@126.com。

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1008-0104(2017)03-0037-02

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