β磷酸三鈣/膠原對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性的研究①

丁 義,趙 剛

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

β磷酸三鈣/膠原對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性的研究①

丁 義,趙 剛

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

目的：研究β磷酸三鈣/膠原支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性的影響。方法：支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)組。7、14、21d分別進(jìn)行MTS、ALP檢測，與無支架材料的對照組進(jìn)行比較。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞數(shù)量都逐步增加，實(shí)驗(yàn)組數(shù)量稍多于對照組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組ALP活性都有所增強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)組較對照組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：支架材料在體外環(huán)境對細(xì)胞增殖無不利影響，且能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性。

支架材料；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨

β磷酸三鈣/膠原復(fù)合物的是一種較理想的骨質(zhì)缺損修復(fù)重建材料。EijiK[1]利用該材料充填直徑5mm的大鼠顱骨并獲得了理想的修復(fù)效果，展示了復(fù)合物支架的良好的生物相容性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在適宜的誘導(dǎo)條件下可定向分化為多種細(xì)胞，其中包括成骨細(xì)胞，在創(chuàng)傷部位植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料的復(fù)合物，被認(rèn)為是現(xiàn)今最好的修復(fù)骨缺損的方法之一[2]。β磷酸三鈣/膠原復(fù)合支架的體外研究相對較少，可能與體外實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)液的浸泡使材料的物理狀態(tài)改變有關(guān)。本文通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料復(fù)合的體外實(shí)驗(yàn)，探究支架材料對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 主要材料

4～6周齡小鼠，佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清(HyClone)，地塞米松、β一甘油磷酸鈉、維生素C(均為Gibco公司)，胰蛋白酶(HyClone)，MTS試劑盒(Boster博士德生物)，堿性磷酸酶試劑盒(購自南京建成)。β磷酸三鈣/膠原復(fù)合支架購自暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國ThermoForma)，超凈工作臺(蘇州明泰空氣凈化技術(shù)有限公司)，電子分析天平(Ohaus，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，酶標(biāo)儀(Takara，日本)。

2 方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無菌條件下分離出小鼠的股骨，剪去兩側(cè)骺端，顯露髓腔，用1mL注射器吸取培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1%雙抗，1%谷氨酰胺，88%L-DMEM)沖洗髓腔，直到骨面發(fā)白。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1500r/min離心10min，棄掉上清液，加入培養(yǎng)液5mL，混勻后接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48h后換液，去除懸浮未貼壁的細(xì)胞，以后每2天更換培養(yǎng)液。細(xì)胞達(dá)到80%融合以上時，加入0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1:2比例傳代。

2.2 細(xì)胞接種

將材料切割成5mm×5mm×2mm小長方體，紫外線照射消毒滅菌30min；使用培養(yǎng)液5mL浸泡支架10min，傾倒出培養(yǎng)液，重復(fù)3次。將5×104個骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)于24孔板，對照組不含支架材料，實(shí)驗(yàn)組與對照組均添加成骨誘導(dǎo)液(0.1μmol/L地塞米松、50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ—甘油磷酸鈉)。放入37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱，48h換液一次。

2.3MTS法檢測細(xì)胞增殖

在分別培養(yǎng)7、14、21d后，棄掉材料和培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組和對照組每孔均加入60μLMTS液，在培養(yǎng)箱中孵育4h后棄上清，每孔加入600μLDMSO液，輕輕吹打使溶液均勻并按每孔150μL將溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，利用分光光度計(jì)在波長為492nm測出吸光度值。

2.4 堿性磷酸酶活性(ALP)測定

在培養(yǎng)7、14、21d后按照ALP試劑盒操作進(jìn)行檢測。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1MTS檢測細(xì)胞增殖

由表1可見，隨著時間增加，兩組細(xì)胞數(shù)量都增加，且實(shí)驗(yàn)組數(shù)量稍多于對照組，但與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說明支架材料未影響細(xì)胞正常增殖，可能有利于細(xì)胞增殖。

表1 支架材料對BMSCs增殖的影響

3.2 堿性磷酸酶活性測定

由表2可見，隨著時間增加，兩組堿性磷酸酶活性都增加，且實(shí)驗(yàn)組較對照組增加的明顯更多，第7天組測量值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性在第14天與第21天較對照組增加顯著，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明β磷酸三鈣/膠原支架材料對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨活性促進(jìn)作用較顯著。

表2 支架材料對堿性磷酸酶活性的影響±s，n=24)

4 討論

口腔正畸中的牙齒移動一方面來源于牙骨質(zhì)本身在壓力環(huán)境中能保持不吸收，維護(hù)了牙齒的結(jié)構(gòu)完整，一方面則是牙槽骨受壓后吸收并在張力側(cè)迅速增生重建，維護(hù)了牙齒移動后的位置不變，所以骨組織工程的進(jìn)展一直是正畸醫(yī)生關(guān)注的。組織工程中，常使用三維支架支撐缺損部位，隨著支架的降解新生組織獲得再生的空間同時修復(fù)的潛能得以激發(fā)[3]。生物活性陶瓷中的磷酸三鈣具有生物活性和骨傳導(dǎo)作用, 但存在成形不理想、強(qiáng)度低、韌性差等缺點(diǎn)[4]。骨膠原常作為黏合劑與具備骨傳導(dǎo)能力的載體如磷酸三鈣合用[5]，使其與人骨接近，可提高骨修復(fù)效果。骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，體外分離培養(yǎng)較容易，且自體獲取回輸后免疫排斥反應(yīng)較小以及不受倫理限制等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是組織工程的重要種子細(xì)胞[6,7]負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成復(fù)合人工骨材料，使支架材料既具有骨傳導(dǎo)作用，又具有骨誘導(dǎo)作用[8]。近年來圍繞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究越來越多[9,10]。

國內(nèi)近幾年關(guān)于磷酸三鈣/膠原支架的研究集中于體內(nèi)研究。本實(shí)驗(yàn)在體外環(huán)境中評估支架材料對干細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞數(shù)量隨時間均有所增加，而且實(shí)驗(yàn)組的數(shù)量較對照組稍大，但兩組間各時間段細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示支架材料的應(yīng)用并不會影響細(xì)胞的正常增殖而可能有利于其生長。在ALP活性方面，實(shí)驗(yàn)組和對照組均有增加，且實(shí)驗(yàn)組測量值均大于對照組，在第7天組兩組測量值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，第14天組和第21天組實(shí)驗(yàn)組測量值顯著大于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明β磷酸三鈣/膠原支架材料的存在對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨有明確的促進(jìn)作用。需要注意的是，在實(shí)驗(yàn)過程中，個別組中支架材料變軟、結(jié)構(gòu)變得松散。一方面考慮其本身成分可降解，且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中隨著新生組織的修復(fù)而被吸收，變軟及松散是不斷降解的正?，F(xiàn)象；一方面考慮在換液操作過程中，反復(fù)的液體沖擊可能造成材料受力斷裂變形。國外的研究側(cè)重于細(xì)胞-支架系統(tǒng)機(jī)械性能改變的基礎(chǔ)研究，證實(shí)了復(fù)合物彈性模量的改變確實(shí)存在，對復(fù)合物進(jìn)入人體后強(qiáng)度的改變具有指導(dǎo)作用，目前尚沒有更多關(guān)于支架機(jī)械性能改進(jìn)的研究結(jié)果?？傊?，由單一組分的支架材料到多成分的配伍，由支架材料自身到負(fù)載細(xì)胞、基因的新組合，發(fā)展迅速的組織工程為骨缺損修復(fù)提供了很大的空間；體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均對材料的檢驗(yàn)有重要的意義，相輔相成，全面認(rèn)識材料必須是在多方面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開始的。目前，仍需要積極的臨床試驗(yàn)來確定療效以及長期效果。

[1]EijiK,JefferyL,KaoruS,etal.Biodegradationpropertyofbeta-tricalciumphosphate-collagencompositeinaccordancewithboneformation:acomparativestudywithBio-OssCollageninaratcritical-sizedefectmodel[J].ClinImplantDentRelatRes, 2014, 16(2):202-211

[2]李煥萍, 劉春蓉, 張永亮. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究與應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(28):5622-5625

[3]陳欣, 張春林. 組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究, 2010, 14(24):4486-4490

[4]陳美雄. 復(fù)合材料人工骨在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究, 2007, 11(48):9797-9800

[5]郭宜姣, 李文華. 骨缺損修復(fù)生物工程研究進(jìn)展[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2014(08):988-993

[6]KruytMC,DhertWJA,OnerFC,etal.Analysisofectopicandorthotopicboneformationincell-basedtissue-engineeredconstructsingoats[J].Biomaterials, 2007, 28(10):1798-805

[7]DePeppoGM,SjovallP,LennersM,etal.Osteogenicpotentialofhumanmesenchymalstemcellsandhumanembryonicstemcell-derivedmesodermalprogenitors:atissueengineeringperspective[J].TissueEngPartA，2010，16(11):3413-3426

[8]張志宏, 劉志禮, 高志增,等. 骨修復(fù)替代材料修復(fù)骨缺損的選擇與應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究, 2012(52):9836-9843

[9]張立超, 賀濤, 帥逸,等. 正常大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2016, 39(2):93-95

[10]趙力, 張雪松, 劉程偉,等.PDGF-B基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2005, 28(6):16-17

Effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity

DINGYi,ZHAOGang

(Orthodontic Department, The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002,China)

Objective：Purpose study effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity. Methods: The BMSCs were cultured with materials as experimental group while the control group with no materials. Tests were taken about MTS, ALP on the 7th, 14th and 21th day. The two groups were compared. Results：Cell numbers and ALPs increased in both groups while there’s no difference in math about MTS, but experimental group showed higher ALPs. Conclusion：The effect of the β-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity is positive, and no negative influence was found in cell proliferation .

materials；BMSCs；bone formation

黑龍江省自然科學(xué)基金，編號：H201487。

丁義(1990～)男，河北張家口人，在讀碩士研究生。

趙剛(1975～)男，黑龍江依蘭人，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:13504545575@126.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0012-02

2016-12-05)