PTEN、PDGF-B及TGF-β1在UUO大鼠腎臟的表達(dá)①

朱章龍, 康曉明, 楊占雙, 張雅麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科,黑龍江 佳木斯 154003)

PTEN、PDGF-B及TGF-β1在UUO大鼠腎臟的表達(dá)①

朱章龍, 康曉明, 楊占雙, 張雅麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)、血小板衍化生長(zhǎng)因子B(PDGF-B)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠與假手術(shù)(Sham)大鼠腎間質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化及它們的相關(guān)性。方法：將48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)造成UUO模型，Sham組大鼠假手術(shù)處理。在手術(shù)后的第3、7、14天分批處死，取左腎石蠟包埋，行HE染色、Masson染色，免疫組化檢測(cè)各組大鼠上述因子的表達(dá)。結(jié)果：與Sham組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，UUO模型組腎小管間質(zhì)損傷和纖維化程度加重，PDGF-B、TGF-β1表達(dá)逐漸增多，PTEN表達(dá)逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PTEN表達(dá)與PDGF-B、TGF-β1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論：PTEN參與了腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的過(guò)程，可能是一種抗腎臟纖維化的內(nèi)源性保護(hù)因子，且PDGF-B、TGF-β1下調(diào)PTEN的表達(dá)可能是它們發(fā)揮促腎間質(zhì)纖維化作用的部分機(jī)制。

PTEN；PDGF-B；腎間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是在各種細(xì)胞因子作用下，間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡失衡、胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積，逐漸導(dǎo)致正常腎臟結(jié)構(gòu)及功能喪失的病理過(guò)程，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)。磷酸酶和張力蛋白同源物的基因(phosphataseandtensinhomolog；pten)在促進(jìn)胚胎發(fā)育、維持干細(xì)胞功能、細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動(dòng)中都起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是重要性僅次于p53的抑癌基因。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)pten表達(dá)的PTEN蛋白在特發(fā)性肺纖維化、肝臟纖維化、心肌纖維化及心室重構(gòu)、口腔黏膜下纖維化[1]等纖維化病理改變的疾病中發(fā)揮著重要作用，但其對(duì)RIF的影響尚不清楚。本研究旨在探討UUO大鼠模型腎組織中PTEN的表達(dá)對(duì)RIF的影響以及PDGF-B、TGF-β1與PTEN的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物的分組與模型建立

健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠48只，體重140～180g，適應(yīng)喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為2組(Sham組、UUO組)。大鼠均腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后，以俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮后常規(guī)消毒鋪巾，在肋腰點(diǎn)，脊柱左側(cè)旁開(kāi)1cm處切口，逐層切開(kāi)皮膚、肌肉及腹壁各層，將左側(cè)輸尿管結(jié)扎后離斷。Sham組僅切開(kāi)腹腔并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷。兩組大鼠在術(shù)后第3、7、14天分批處死8只。處死前一天收集24h尿液。處死當(dāng)天麻醉后采血，留取左腎置10%中性甲醛固定。

1.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

將采集的尿液分別進(jìn)行尿素氮(BUN) 、肌酐(Scr)檢測(cè)，尿液行尿蛋白定量(24hPro)檢測(cè)。將腎組織石蠟包埋、切片，分別行常規(guī)HE染色和改良Masson染色[2]。參考TaalMW[3]的方法，每張切片隨機(jī)選10個(gè)不含腎小球的視野(×400)，半定量分析腎小管及間質(zhì)的損傷情況，加權(quán)平均為腎小管及間質(zhì)損傷評(píng)分(TLS)，總分0～9分。Masson染色則每例切片隨機(jī)記錄10個(gè)連續(xù)不重疊的視野(×200)，以藍(lán)染纖維面積與整個(gè)視野總面積的百分比作為RIF指數(shù)，兩組切片分別加權(quán)平均得該組的RIF指數(shù)，對(duì)纖維化程度評(píng)估。免疫組化采用SABC法，每次染色均用0.01mol/LPBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每例切片在(×400)光鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)腎小管及間質(zhì)區(qū)域，利用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算兩組腎組織陽(yáng)性染色(棕黃色顆粒)的平均光密度(AOD)，即積分光密度與視野內(nèi)腎間質(zhì)面積比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠尿液和生化分析

UUO組BUN、Scr、24hPro與Sham組比較，三者濃度隨時(shí)間逐漸增加，提示UUO組大鼠腎功能受損逐漸加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，表明造模成功。見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠腎組織學(xué)變化

HE染色顯示Sham組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎臟在光鏡下觀察結(jié)構(gòu)正常。UUO組術(shù)后3d腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；7d近曲小管及遠(yuǎn)曲小管明顯囊性擴(kuò)張，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)腎小管萎縮；14d腎皮髓質(zhì)萎縮，部分腎小管萎縮，腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分小管上皮細(xì)胞壞死、脫落或消失，間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化較前明顯；偶見(jiàn)管型。兩組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TLS評(píng)分差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Masson染色見(jiàn)UUO組隨術(shù)后輸尿管梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，3d、7d、14d的腎小管變性、壞死逐漸加重，代之以間質(zhì)纖維，藍(lán)染面積逐漸增多。與Sham組相比，UUO組大鼠腎小管損傷、腎間質(zhì)炎癥和纖維化程度進(jìn)行性地加重。見(jiàn)表2。

表1 兩組大鼠腎功能指標(biāo)的比較±s，n=8)

兩組比較，P<0.05。

表2 兩組大鼠TLS評(píng)分、RIF指數(shù)的比較

注：P<0.05。

2.3 蛋白表達(dá)情況

Sham組腎小管上皮細(xì)胞胞漿偶可見(jiàn)PDGF、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)；UUO組腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)PDGF、TGF-β1蛋白表達(dá)明顯，且隨時(shí)間進(jìn)展表達(dá)量逐漸增多，與正常組同時(shí)間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Sham組相比，UUO組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿的PTEN蛋白表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，且PTEN蛋白表達(dá)與PDGF-B、TGF-β1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎組織各時(shí)間點(diǎn)三種蛋白AOD值±s，×10-2)

注：兩組同一時(shí)間點(diǎn)比較，▲P<0.05，#r值：PTEN與PDGF-B相關(guān)系數(shù)；##r值：PTEN與TGF-β1相關(guān)系數(shù)。

3 討論

RIF是包括腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)、成纖維細(xì)胞增殖與凋亡失常、-ECM分泌與降解失衡等導(dǎo)致的不良修復(fù)[4]。PTEN也可稱為T(mén)GF-β調(diào)節(jié)的上皮細(xì)胞的富含磷酸酶1(TEP1)，由1209個(gè)核苷酸編碼的403個(gè)氨基酸組成，肽鏈氨基端為雙重特異性磷酸酶核心區(qū)，即蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)序列和末端的PIP2結(jié)合序列，后者能特異性地切割磷脂酰肌醇-3,4,5三磷酸(PIP3)，去磷酸化為磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)。PIP3作為胞內(nèi)第二信使，能激蛋白激酶B(AKT)和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)等多種底物，故PTEN能下調(diào)AKT、PDK1來(lái)調(diào)節(jié)下游多條通路的生物效應(yīng)[5]。PTP序列則能使絲/蘇氨酸、酪氨酸殘基脫磷酸化。PDGF-B是酪氨酸受體激酶家族的一員，TGF-β1屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，它們對(duì)PI3K/PDK1/AKT等信號(hào)通路的激活是纖維化疾病的部分機(jī)制。TangWW[6]較早發(fā)現(xiàn)將PDGF-B注入大鼠體內(nèi)，結(jié)果誘導(dǎo)了腎小管間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的增生和間質(zhì)纖維化，并認(rèn)為腎間質(zhì)細(xì)胞是PDGF在腎臟的主要效應(yīng)細(xì)胞。PDGF-B有兩種受體PDGFR-α和PDGF-β，ChenYT[7]用伊馬替尼干預(yù)實(shí)驗(yàn)表明兩種PDGFR都激活周細(xì)胞、肌成纖維化細(xì)胞增殖參與RIF。YilmazO[8]在以PDGFR抑制劑達(dá)沙替尼減弱博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，發(fā)現(xiàn)其逆轉(zhuǎn)肺纖維化作用與上調(diào)PTEN的表達(dá)來(lái)減弱PDGF激活的胞內(nèi)信號(hào)通路有關(guān)。LiuZ[9]發(fā)現(xiàn)微小RNA21(miR-21)下調(diào)PTEN來(lái)升高AKT的表達(dá)；而使用AKT特異阻滯劑時(shí)，能抑制TGF-β1/miR-21誘導(dǎo)的肝細(xì)胞纖維化。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中PTEN表達(dá)減弱與腎小管上皮細(xì)胞凋亡和EMT增加呈正相關(guān)，而與PDGF

-B和TGF-β1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，故我們推測(cè)PDGF-B和TGF-β1的過(guò)度表達(dá)下調(diào)了PTEN的表達(dá)，進(jìn)而減弱PTEN對(duì)PI3K/AKT等下游底物的去磷酸化作用，減弱PTEN維持腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)和對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。隨著PTEN參與纖維化機(jī)制的深入研究，有望為RIF的治療提供新的思路和依據(jù)。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016_057。

朱章龍(1989～)男，廣東韶關(guān)人，在讀碩士研究生。

康曉明(1961～)女,黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：kanglaoshi@163.com。

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1008-0104(2017)03-0092-02

2017-03-07)