多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化理沖生髓飲的醇提工藝

王艷宏，趙娟萍，尚冬雪，趙雪，田苗，韓鳳娟

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多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化理沖生髓飲的醇提工藝

王艷宏1，趙娟萍1，尚冬雪1，趙雪1，田苗2，韓鳳娟2

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040

目的 優(yōu)選理沖生髓飲的最佳醇提工藝。方法 采用L9（34）正交試驗(yàn)法，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率和干膏得率為指標(biāo)，通過綜合評分法，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、溶媒用量對理沖生髓飲醇提工藝的影響。結(jié)果 最佳提取工藝為：10倍量60%乙醇浸泡2 h后，加熱回流提取2次，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度80 ℃。結(jié)論 該工藝提取率高，工藝穩(wěn)定、可行，可為理沖生髓飲的進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)。

理沖生髓飲；正交試驗(yàn)；多指標(biāo)；醇提工藝

理沖生髓飲是國家級(jí)老中醫(yī)、黑龍江省名中醫(yī)王秀霞教授在理沖丸的基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床實(shí)踐總結(jié)出的有效防治卵巢腫瘤的中藥復(fù)方制劑?，F(xiàn)代研究表明其可提高卵巢癌患者的免疫功能[1]，對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外生長有抑制作用，可阻斷Bcl-2癌基因蛋白表達(dá)[2-3]，對化學(xué)致癌因子誘發(fā)的大鼠卵巢腫瘤有抑制和阻斷作用[4]，對P53基因蛋白、血管內(nèi)皮生長因子基因蛋白、Casp-8和CXCL2基因的過度表達(dá)有調(diào)節(jié)作用[5-7]。理沖生髓飲具有破血消癥、軟堅(jiān)散結(jié)、補(bǔ)氣養(yǎng)血、填精益髓之功。方中所含有效成分種類眾多，包括揮發(fā)油類、皂苷類、黃酮類、多糖類等。其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd和黃芪甲苷等成分具有抗腫瘤、提高免疫功能等活性[8-14]。本研究采用正交試驗(yàn)法，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、溶媒用量對上述成分轉(zhuǎn)移率和干膏得率等多指標(biāo)的影響，優(yōu)選理沖生髓飲的醇提工藝，以期為理沖生髓飲的進(jìn)一步深入研究提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

SFE220-40-100超臨界萃取裝置（江蘇溫奧機(jī)械設(shè)備有限公司），AK-400B中藥粉碎機(jī)（泰州金誠制藥機(jī)械有限公司），DZF-6050真空干燥箱（北京北方利輝試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司），KDM-1000調(diào)溫電熱套（江蘇杰瑞爾電器有限公司），TGL-16G高速離心機(jī)（北京佳源興業(yè)科技有限公司），F(xiàn)A2104A電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司），LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），BenchTop K真空冷凍干燥機(jī)（美國VIRTIS公司），WFZUV-4802H紫外分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司），N1100-OSB- 2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

理沖生髓飲方中各藥（人參、黃芪、淫羊藿、莪術(shù)等）均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫慧峰教授鑒定均符合2015年版《中華人民共和國藥典》各藥項(xiàng)下規(guī)定。對照品人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201128）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-201424）、人參皂苷Re（批號(hào)110754- 201324）、黃芪甲苷（批號(hào)110781-201314）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201304）、淫羊藿苷（批號(hào)110737-200415）、寶藿苷Ⅰ（批號(hào)111852-201102），中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rd（批號(hào)MUST- 11041212），成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈（GR級(jí)，美國迪馬科技有限公司），磷酸（GR級(jí)，天津賽孚瑞科技有限公司），HPLC所用水為屈臣氏蒸餾水，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 理沖生髓飲的制備

取處方量飲片，以超臨界流體萃取法（SCFE）萃取，獲得萃取物；藥渣繼續(xù)以適宜濃度乙醇回流提取，提取液回收乙醇后濃縮至適量；藥渣揮盡溶劑后，繼續(xù)以水回流提取，水提液濃縮后，與上述濃縮液合并，加入萃取物，攪勻，即得。本研究采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化其中的醇提工藝。

2.2 干膏得率測定

取1/10正交試驗(yàn)獲得的提取液，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置105 ℃烘箱中干燥至恒重，在干燥器中冷卻30 min，精密稱定，計(jì)算干膏得率。

2.3 黃酮類和皂苷類成分檢測

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg毛蕊異黃酮葡萄糖苷、1.00 mg淫羊藿苷、0.50 mg寶藿苷Ⅰ的混合對照品貯備液。精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd和黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg人參皂苷Rg1、2.0 mg人參皂苷Re、1.0 mg人參皂苷Rb1、1.0 mg人參皂苷Rd和1.0 mg黃芪甲苷的混合對照品貯備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 正交試驗(yàn)獲得的提取液，減壓回收乙醇后加水分散，然后用乙酸乙酯萃取至無色，合并乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯后，加甲醇溶解，過濾，即得。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 分別按處方比例稱取除黃芪、淫羊藿，除黃芪、人參之外的其余藥味，按“2.1”項(xiàng)下方法制備缺黃芪、淫羊藿陰性對照溶液和缺黃芪、人參陰性對照溶液。

2.3.4 色譜條件 采用Dikma Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（見表1），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長為270 nm（黃酮類成分）、203 nm（皂苷類成分）。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件（%）

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液和空白甲醇，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖1、圖2）。各主要色譜峰與其左右峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于7000。

注：S1.空白溶劑；S2.對照品；S3.缺黃芪陰性對照； S4.缺淫羊藿陰性對照；S5.供試品； 1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.淫羊藿苷；3.寶藿苷Ⅰ

注：S1.空白溶劑；S2.對照品；S3.缺人參陰性對照；S4.缺黃芪陰性對照； S5.供試品；1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1； 4.黃芪甲苷；5.人參皂苷Rd

2.3.6 線性關(guān)系考察 按逐級(jí)稀釋法，分別精密吸取適量混合對照品溶液于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得混合對照品系列溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積（）對質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程。毛蕊異黃酮葡萄糖苷：＝5.0E+7－984 485，＝0.999 9，在0.25～2.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；淫羊藿苷：＝3.0E+7＋45 106，＝0.999 8，在1.0～10.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；寶藿苷Ⅰ：＝7.0E+7＋69 274，＝0.999 8，在0.5～5.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。人參皂苷Rg1：＝1.0E+7－35 999，＝0.999 6，在1.0～10.0 μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好；人參皂苷Re：＝1.0E+7＋47 082，＝0.999 7，在2.0～20.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb1：＝1.0E+7＋112 642，＝0.999 7，在1.0～10.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；人參皂苷Rd：＝1.0E+7－88 267，＝0.999 7，在1.0～10.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃芪甲苷：＝1.0E+7－10 578，＝0.999 8，在1.0～10.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 醇提工藝優(yōu)化

2.4.1 提取次數(shù) 取處方量藥材，考察提取次數(shù)對醇提工藝的影響。結(jié)果表明，提取次數(shù)對醇提工藝的影響較大。提取2次與提取1次相比，各成分轉(zhuǎn)移率及干膏得率均較高，當(dāng)提取次數(shù)增加至3次時(shí)，各成分轉(zhuǎn)移率無明顯變化，見表2。為減少溶劑的消耗，節(jié)省提取時(shí)間，故選擇提取次數(shù)為2次。

表2 不同提取次數(shù)對干膏得率及各成分轉(zhuǎn)移率的影響（%）

2.4.2 正交試驗(yàn) 以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、溶媒用量（D）作為自變量因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以多指標(biāo)綜合加權(quán)評分方法確定最佳醇提工藝。設(shè)定滿分為100分，干膏得率及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的權(quán)重系數(shù)為10，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的權(quán)重系數(shù)為12。綜合評分＝10×干膏得率ib＋10×毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率ib＋10×淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率ib＋10×寶藿苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率ib＋12×人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)移率ib＋12×人參皂苷Re轉(zhuǎn)移率ib＋12×人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率ib＋12×人參皂苷Rd轉(zhuǎn)移率ib＋12×黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率ib。其中i＝1，2，3，…，9；指標(biāo)ib為以各指標(biāo)的最大值作為參照對該指標(biāo)各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值，即指標(biāo)ib＝指標(biāo)i÷指標(biāo)max。正交試驗(yàn)因素水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4、表5，方差分析見表6。

直觀分析結(jié)果表明，4個(gè)影響因素的主次順序?yàn)镈（溶媒用量）＞C（提取溫度）＞A（乙醇濃度）＞B（提取時(shí)間），最佳工藝A1B2C3D3。方差分析結(jié)果表明，取離均差平方和最小項(xiàng)（B）作為誤差估計(jì)，用以檢驗(yàn)其他因素作用的顯著性。結(jié)果表明，4個(gè)影響因素的主次順序仍為D（溶媒用量）＞C（提取溫度）＞A（乙醇濃度）＞B（提取時(shí)間），其中，因素D有極顯著影響（＜0.01），因素C和A有顯著影響（＜0.05）。最終確定理沖生髓飲的最佳工藝為A1B2C3D3，即：加入10倍量60%乙醇浸泡2 h，加熱回流提取2次，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度80 ℃。

2.4.3 最佳工藝驗(yàn)證 取處方量藥材，按“2.4.2”項(xiàng)下最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，分別測定理沖生髓飲干膏得率及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，該工藝各指標(biāo)成分提取均較完全，且重復(fù)性好、可行性高。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

表4 正交試驗(yàn)干膏收率和各成分轉(zhuǎn)移率（%）

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：0.05（2，2）＝19，0.01（2，2）＝9

表7 最佳工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)（%，n＝3）

3 討論

理沖生髓飲由人參、黃芪、淫羊藿、莪術(shù)等8味中藥組成。2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）人參、黃芪、淫羊藿藥材項(xiàng)下分別以人參皂苷Rg1、Re、Rb1及黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷為含量測定指標(biāo)[15]?，F(xiàn)代研究亦表明，上述成分均具有不同程度的抑制腫瘤作用[8-13]。此外，人參皂苷Rd具有顯著的抗癌活性[14]。故本研究采用毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率和干膏得率為指標(biāo)，并采用綜合加權(quán)評分法，根據(jù)各有效成分對腫瘤抑制作用的貢獻(xiàn)大小，進(jìn)行綜合評分，使其可以更合理、更客觀、更全面地評價(jià)理沖生髓飲的醇提工藝。

本試驗(yàn)參考2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）人參、黃芪、淫羊藿藥材項(xiàng)下含量測定方法[15]和文獻(xiàn)中報(bào)道的HPLC分析方法[16-17]，通過預(yù)試驗(yàn)考察了不同供試品制備方法、不同流動(dòng)相組成、不同檢測波長等對理沖生髓飲醇提液分析效果的影響，最后確定供試品用乙酸乙酯處理，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈，檢測波長為270 nm（黃酮類成分）、203 nm（皂苷類成分）。該方法不僅能同時(shí)測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ這3種黃酮類成分，還能同時(shí)測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd及黃芪甲苷這5種皂苷類成分，并采用同一PDA檢測器實(shí)現(xiàn)了3種黃酮類和5種皂苷類成分的同時(shí)測定，從而為進(jìn)一步建立理沖生髓飲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

單因素試驗(yàn)表明，在相同的提取工藝條件下，提取次數(shù)為2次以上，黃酮類和皂苷類成分含量變化不明顯，故選擇提取次數(shù)2次。以乙醇濃度、乙醇用量、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素為自變量，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以綜合加權(quán)評分法為評價(jià)基礎(chǔ)，最終確定醇提最佳工藝，即：將SCFE萃取后的藥渣加60%乙醇浸泡2 h，80 ℃加熱回流提取1.5 h，提取2次，合并提取液減壓濃縮至適量。該工藝具有提取率高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

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Optimization of Ethanol Extraction Technology ofDecoction by Multi-index Orthogonal Test

WANG Yan-hong1, ZHAO Juan-ping1, SHANG Dong-xue1, ZHAO Xue1, TIAN Miao2, HAN Feng-juan2

Objective To optimize the ethanol extraction technology ofDecoction. Methods An L9(34) orthogonal test was used in the study. The extraction rates of calycosin glycoside, icariin, baohuoside Ⅰ, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, astragaloside, and ginsenoside Rd were set as indexes. The influence of ethanol concentration, extraction time, extraction temperature, and amount of ethanol on the yield ofDecoction were detected by comprehensive scoring method. Results The optimal ethanol extraction technology forDecoction was soaking for 2 h with ten times of 60% ethanol and then reflux extracting for two times; extraction time was 1.5 h each time at 80 ℃. Conclusion The optimal extraction technology is efficient, stable and feasible, which can provides data for the further study ofDecoction.

Decoction; orthogonal test; multi-index; ethanol extraction technology

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.018

R283.5

A

1005-5304(2017)07-0076-05

國家自然科學(xué)基金（81273788、81473717）

韓鳳娟，E-mail：hanfengjuan2004@163.com

（2016-09-08）

（2016-09-21；編輯：陳靜）