柴胡分子生藥學(xué)研究進(jìn)展

韓曉偉，嚴(yán)玉平，吳蘭芳，楊加虎，鄭玉光

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柴胡分子生藥學(xué)研究進(jìn)展

韓曉偉，嚴(yán)玉平，吳蘭芳，楊加虎，鄭玉光

河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050200

分子生藥學(xué)是一門新興的以生藥為研究對(duì)象的交叉學(xué)科，其發(fā)展為傳統(tǒng)的生藥學(xué)研究提供了新的理論方法和技術(shù)，使對(duì)生藥的研究達(dá)到了基因水平。柴胡作為傳統(tǒng)中藥，在傳統(tǒng)研究方法基礎(chǔ)上，也開展了分子生藥學(xué)研究，并取得了一定成果。本文綜述了近年來采用分子生藥學(xué)手段的柴胡相關(guān)研究，并對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行了展望，以期為進(jìn)一步推動(dòng)柴胡資源及其他中藥資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供參考。

分子生藥學(xué)；基因；柴胡；分子生物技術(shù)；中藥資源

分子生藥學(xué)是生藥學(xué)和分子生物學(xué)相互融合形成的一門新興的交叉學(xué)科，由黃璐琦院士在1995年首次提出[1]。分子生藥學(xué)的提出，使生藥學(xué)研究有了新的理論方法和技術(shù)，使我國生藥學(xué)研究又邁上了一個(gè)新的臺(tái)階。經(jīng)過20多年的發(fā)展，分子生藥學(xué)在中藥分子標(biāo)識(shí)鑒定、中藥資源保護(hù)和利用、中藥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)方面都取得了很好的成果，使生藥學(xué)研究不再停留于藥用植物組織器官的層面，而是擴(kuò)展到基因的層面，為后基因組時(shí)代研究中草藥奠定了基礎(chǔ)[2]。

柴胡是我國常用的大宗中藥材之一，歷代本草典籍對(duì)其藥性都有明確記載。柴胡性味苦寒，入肝膽經(jīng)，具和解表里、疏肝、升陽之功效，主要用于感冒發(fā)熱，寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等病證的治療。2015年版《中華人民共和國藥典》[3]中規(guī)定的正品柴胡為傘形科植物柴胡DC.或狹葉柴胡Willd.的干燥根，前者習(xí)稱“北柴胡”，后者習(xí)稱“南柴胡”。在分子生藥學(xué)發(fā)展的20多年里，關(guān)于柴胡的分子生藥學(xué)方面的研究也在持續(xù)進(jìn)行。本文對(duì)近年柴胡分子生藥學(xué)方面的研究進(jìn)行了總結(jié)，以期為在分子水平對(duì)柴胡進(jìn)行更深層次的研究提供參考。

1 柴胡生藥鑒定的分子標(biāo)記研究

生藥鑒定是生藥學(xué)的重要組成部分，生藥鑒定的主要任務(wù)是研究生藥的來源、品種鑒定、質(zhì)量評(píng)價(jià)等。我國生藥的品種繁多、來源復(fù)雜，在一定程度上制約了中藥的安全應(yīng)用。柴胡作為我國常用的大宗中藥材，具有來源復(fù)雜、品種豐富等特點(diǎn)[4]，而利用傳統(tǒng)的理化鑒別和性狀鑒別的方法不能準(zhǔn)確鑒別柴胡藥材的來源和種屬，因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)研究柴胡的種屬鑒別逐漸成為研究熱點(diǎn)。

分子標(biāo)記技術(shù)以1974年Grozdicker首創(chuàng)RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）為開端，到2003年P(guān)aul Hebert提出DNA條形碼技術(shù)，短短30年的時(shí)間里各國的科學(xué)家提出了十幾種分子標(biāo)記技術(shù)，其中常用的有RFLP、RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、SSR（簡單重復(fù)序列）、AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）、ISSR（簡單重復(fù)序列區(qū)間）和DNA barcoding（DNA條形碼）等。

1.1 RAPD技術(shù)

RAPD是第二代分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)在植物中的應(yīng)用比較廣泛，但其不足之處是穩(wěn)定性相對(duì)較差，不同的物種需要使用不同的反應(yīng)條件，即使同一物種的同一引物在實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)產(chǎn)生的譜帶也會(huì)發(fā)生改變。AFLP技術(shù)與RAPD技術(shù)相似，其特點(diǎn)也是可以簡單快速的鑒定植物，但其穩(wěn)定性也不佳。2002年，梁之桃等[5]對(duì)柴胡屬的物種植物進(jìn)行了RAPD分析和分類鑒別，這是對(duì)柴胡進(jìn)行RAPD研究的開始。2003年，王秀全等[6]對(duì)柴胡種源的道地性進(jìn)行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)利用RAPD可以準(zhǔn)確的鑒定柴胡的道地性。隨著對(duì)柴胡研究的深入，全國柴胡的主產(chǎn)區(qū)都開展了柴胡品種的RAPD鑒定[7-10]，同時(shí)，對(duì)RAPD的技術(shù)進(jìn)行了一些優(yōu)化[11]，使其更適合柴胡的分析。在資源鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)柴胡的干根藥材、愈傷組織、試管植株等進(jìn)行了RAPD分析[12-14]。

1.2 SSR和ISSR技術(shù)

SSR又稱為微衛(wèi)星DNA或短串聯(lián)重復(fù)，ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)。SSR和ISSR可揭示更高的多態(tài)性，而且快速、簡便，因此在中藥材鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。2008年，隋春等[15]首次以北柴胡為材料進(jìn)行了ISSR分析，這為利用ISSR技術(shù)鑒定柴胡種質(zhì)資源、分子標(biāo)記輔助育種以及遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。2010年，戰(zhàn)晴晴等[16]利用SSR和ISSR技術(shù)構(gòu)建了北柴胡的遺傳圖譜，使對(duì)柴胡的研究進(jìn)一步深入。2013年，楊旻等[17]利用綜合評(píng)分法對(duì)柴胡的ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。2015年，馬艷芝等[18]對(duì)不同柴胡種質(zhì)資源的ISSR和ITS進(jìn)行了序列分析，認(rèn)為將ISSR和ITS（轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）技術(shù)相結(jié)合可提高柴胡種質(zhì)資源鑒定的準(zhǔn)確性。隨著SSR和ISSR技術(shù)的不斷完善，利用該技術(shù)鑒定柴胡的研究不斷深入。趙香妍等[19]對(duì)北京地區(qū)野生的柴胡種質(zhì)資源進(jìn)行了ISSR研究，確定了百花山山腰及山腳的柴胡適宜推廣種植，為柴胡栽培品種的選育提供了新選擇。吳素瑞等[20]對(duì)柴胡的栽培品種進(jìn)行了SSR的分子標(biāo)記鑒別。通過長期反復(fù)的實(shí)驗(yàn)摸索，采用SSR和ISSR技術(shù)成為鑒別柴胡種質(zhì)資源的有效方法。

1.3 DNA條形碼

DNA條形碼的鑒定是分子鑒定的最新發(fā)展方向，它是通過比較物種中的一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定[21]。適于植物的條形碼包括psbA-TrnH、rbcL、rpoC1、rpoB、matK、ITS、ITS2等。2004年，Neves S S等[22]首次基于柴胡屬植物的ITS序列對(duì)其進(jìn)行了聚類分析。2005年，武瑩等[23]對(duì)5種習(xí)用柴胡進(jìn)行了ITS的序列鑒別。2006年，謝暉等[24]對(duì)9種柴胡屬植物的核糖體ITS序列進(jìn)行了擴(kuò)增和應(yīng)用。近5年來，柴胡的鑒定主要以ITS和ITS2擴(kuò)增為主要方法[25-29]，這為柴胡種質(zhì)資源鑒定以及藥材市場柴胡的真?zhèn)舞b別提供了快速簡便的方法。

在ITS擴(kuò)增的研究基礎(chǔ)上，劉力等[30]進(jìn)行了DNA芯片研究，涉及18種柴胡DNA芯片，發(fā)現(xiàn)基于18種柴胡的ITS序列的差別所設(shè)計(jì)的DNA芯片可以將其區(qū)分開，這為柴胡的鑒定提供了新的方法。

2 柴胡有效成分生物合成分子機(jī)理與調(diào)控研究

傳統(tǒng)中藥材的有效成分絕大多數(shù)為次生代謝產(chǎn)物，合成路徑復(fù)雜，其反應(yīng)過程往往需要十幾個(gè)甚至幾十個(gè)酶的催化，因此，找到形成特定產(chǎn)物的關(guān)鍵酶就成為對(duì)藥材進(jìn)行合成的分子機(jī)理與調(diào)控研究的關(guān)鍵步驟，從而進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥用植物的有效成分。柴胡皂苷的結(jié)構(gòu)均為五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，20世紀(jì)90年代，人們對(duì)萜類的生物合成途徑進(jìn)行了研究，根據(jù)Ruzika原則提出了萜類生物合成的中心途徑。在此基礎(chǔ)上，董樂萌等[31]開始對(duì)合成皂苷途徑的關(guān)鍵酶的基因片段進(jìn)行了克隆和序列分析，為進(jìn)一步克隆全序列及了解調(diào)控柴胡皂苷的生物合成奠定了基礎(chǔ)。2010－2015年，北柴胡鯊烯合酶基因[32]、IPPI基因[33]、UGT基因[34]、北柴胡細(xì)胞色素P450基因[35]、北柴胡糖基轉(zhuǎn)移酶基因BcUGT1[36]、BcUGT3和BcUGT6[37]、BcUGT8[38]、與P450相關(guān)基因cyp716y1[39]等與北柴胡皂苷合成相關(guān)基因相繼被克隆和分析，同時(shí)還進(jìn)行了一些遺傳轉(zhuǎn)化方面的初步研究[40]。此類研究為揭示柴胡皂苷合成途徑的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

中藥材是非模式植物，因此進(jìn)行基因克隆一般按照與其相似的植物序列來設(shè)計(jì)通用引物，序列擴(kuò)增后還要進(jìn)行比對(duì)，從而確定是否為該藥用植物的正確序列。這種研究基因的方法工作量很大，且無法反映基因表達(dá)的全貌。轉(zhuǎn)錄組研究較好克服了上述缺點(diǎn)，具有時(shí)間性和空間性，它反映的是特定條件下活躍表達(dá)的基因。通過轉(zhuǎn)錄組的分析，可高通量地獲得基因表達(dá)的RNA水平相關(guān)信息，而且可揭示基因表達(dá)和生命現(xiàn)象之間的聯(lián)系，從而揭示生命體的生理活動(dòng)規(guī)律，確定其代謝特性[2]。2011年，Sui C等[41]利用新一代的高通量測(cè)序技術(shù)454 GS-FLX Titanium對(duì)北柴胡進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，揭示了柴胡皂苷合成的分子途徑，為后續(xù)的皂苷關(guān)鍵酶基因克隆及功能分析奠定了基礎(chǔ)。2015年，該課題組對(duì)“南柴胡”和“北柴胡”進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了二者之間皂苷合成途徑的差異，為從分子水平揭示道地藥材形成的原因提供了較好范本[42]。

3 脅迫條件下柴胡皂苷合成的分子機(jī)制研究

許多植物的藥效成分都是該植物的次生代謝產(chǎn)物，植物次生代謝產(chǎn)物是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)，同時(shí)也是植物的主要防御機(jī)制之一，植物的防御反應(yīng)可誘導(dǎo)多種萜類的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累[43]。2016年，張宇等[44]研究了干旱脅迫下北柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)適度的干旱脅迫能夠提高柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)量與皂苷含量呈正相關(guān)，從而為揭示脅迫下藥用植物藥效成分積累的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

隨著柴胡轉(zhuǎn)錄組研究和功能基因的克隆與分析的深入，柴胡響應(yīng)脅迫的分子機(jī)制的研究必將取得較大發(fā)展。

4 柴胡細(xì)胞、組織和轉(zhuǎn)基因器官培養(yǎng)與活性成分生產(chǎn)

運(yùn)用分子生物學(xué)的方法來研究中藥材的最終目的是最大限度地獲得中藥材的藥效成分，從而彌補(bǔ)中藥材資源不足的情況。利用細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速、安全地獲得中藥材的藥效成分，是中藥材研究和開發(fā)的新方向。柴胡的細(xì)胞培養(yǎng)研究尚處在初級(jí)水平。1995年，郝建平等[45]進(jìn)行了柴胡細(xì)胞的固定化培養(yǎng)，但之后的十幾年此類研究發(fā)展不大。2008年，吳曉玲等[46]進(jìn)行了銀柴胡細(xì)胞培養(yǎng)的嘗試。2012年，徐爽等[47]研究了三島柴胡懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。2016年，程玉鵬等[48]對(duì)狹葉柴胡的愈傷和懸浮細(xì)胞成分進(jìn)行了分析。上述研究為大規(guī)模進(jìn)行柴胡的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了有益的探索。

5 展望

柴胡的分子生藥學(xué)研究只是我國中藥材研究的一部分，而利用分子生藥學(xué)技術(shù)對(duì)柴胡的研究尚處于起步階段，前景廣闊。利用分子生藥學(xué)可以辨別柴胡的真?zhèn)危U述皂苷合成的分子機(jī)理，但由于柴胡完整的基因序列尚不明確，大部分柴胡基因相關(guān)研究只是一個(gè)“近似值”，這也是我國中藥材研究的現(xiàn)狀。

利用分子生藥學(xué)的方法研究中藥材實(shí)現(xiàn)了我國中藥材研究的突破，使我國中藥材研究邁入新的階段，為中藥材資源保護(hù)和利用開創(chuàng)了新的局面。

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Research Progress in Molecular Pharmacognosy of BupleuriRadix

HAN Xiao-wei, YAN Yu-ping, WU Lan-fang, YANG Jia-hu, ZHENG Yu-guang

Molecular pharmacognosy is an emerging interdisciplinary subject with crude drugs as research subjects. Its development provides a new theoretical method and technique for traditional pharmacognosy research, so that the study of crude drugs has reached the level of gene. As traditional Chinese materia medica, Bupleuri Radix has developed molecular pharmacognosy research on the basis of traditional research methods, and achieved certain results. This article summarized the research achievements of Bupleuri Radix through molecular pharmacognosy method in recent years, and prospected this field, in order to further provide references for the protection, development and utilization of Bupleuri Radix resources and other TCM resources.

molecular pharmacognosy; gene; Bupleuri Radix; molecular biological technology; TCM resources

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.032

R284

A

1005-5304(2017)07-0125-04

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃（2015081）；河北中醫(yī)學(xué)院博士科研基金（BSZ2015003）；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2015073）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系中藥材產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)（2017年）；河北中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（7002016012019）

鄭玉光，E-mail：zyg314@163.com

（2016-08-08；編輯：向宇雁）