斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性研究

樊嬌嬌，喬藝涵，趙崇軍，倪媛媛，楊冉，馮婭茹，馬志強，林瑞超

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斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性研究

樊嬌嬌，喬藝涵，趙崇軍，倪媛媛，楊冉，馮婭茹，馬志強，林瑞超

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 100102

目的 考察斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性。方法 采用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立活體斑馬魚血栓模型。將斑馬魚隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、給藥組，各組給予相應(yīng)藥物或胚胎培養(yǎng)水。16 h后，用鄰聯(lián)茴香胺染色液染色，計算斑馬魚心臟紅細胞染色強度，進行定量分析；觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚血小板聚集情況，進行定性分析。結(jié)果 與模型組比較，100 μg/mL丹酚酸B，300、900 μg/mL丹參水提取物，45 μg/mL 95%乙醇提取物，400、1200 μg/mL消栓通絡(luò)片均能明顯抑制斑馬魚的血栓形成（＜0.01）。結(jié)論 斑馬魚血栓模型對中藥抗血栓活性篩選具有良好的適用性。

斑馬魚血栓模型；中藥；活性篩選；適用性

從中藥中發(fā)現(xiàn)抗血栓活性顯著的先導(dǎo)化合物已成為新藥研發(fā)的一個重要途徑。但中藥化學(xué)成分復(fù)雜，用藥形式多樣，并且目前抗血栓藥物篩選主要采用體外凝血實驗和傳統(tǒng)嚙齒類動物在體血栓模型。前者只能針對部分靶點[1]，后者在進行活性篩選時，所需動物數(shù)量大、操作復(fù)雜、周期長，尚不適用于抗血栓藥物的大規(guī)模篩選[2]，使中藥抗血栓活性成分的篩選成為難題。而斑馬魚作為一種新的動物模型，具有養(yǎng)殖成本低，發(fā)育周期短，幼魚透明易觀察，產(chǎn)卵量大等獨特的優(yōu)勢[3]。且Williams C H等[4]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚與人類血液系統(tǒng)中的血小板和凝血因子有許多共同的特點，因此，逐步成為抗血栓藥物篩選的模型生物。本研究采用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型，篩選不同形式中藥（單體成分、中藥提取物、復(fù)方）的抗血栓活性[5]，進而探討斑馬魚血栓模型在中藥活性篩選中的適用性，為斑馬魚模型用于復(fù)雜的中藥化學(xué)成分體系活性物質(zhì)篩選提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

AB系斑馬魚和血小板熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚（CD41：GFP），購自國家斑馬魚中心，飼養(yǎng)于本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)。

1.2 藥物

丹酚酸B，成都克洛瑪生物科技有限公司，批號115939-25-8；丹參，北京同仁堂股份有限公司，批號501003818，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，符合2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；消栓通絡(luò)片，北京同仁堂股份有限公司，批號15120192。

1.3 主要試劑與儀器

鹽酸腎上腺素（上海源葉生物科技有限公司，批號Y03J7C15662），阿司匹林[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號50-78-2]，鄰聯(lián)茴香胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號119-90-4），二甲基亞砜（DMSO，西隴化工股份有限公司，批號160306），其他試劑均為分析純。斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技公司），1000、5000 μL移液器（Eppendorf），LRH-250Z恒溫培養(yǎng)箱（廣州瑞明儀器有限公司），DZF-6050B真空干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司），SMZ64型體視顯微鏡（尼康株式會社），80i生物熒光顯微鏡（尼康株式會社）。

2 實驗方法

2.1 胚胎收集

成年斑馬魚由本實驗室參照文獻[6-7]方法養(yǎng)殖，溫度控制在（28.5±1）℃，明暗周期14 h/10 h，定時喂養(yǎng)剛孵出的豐年蝦。收集胚胎前1晚，挑選健康性成熟的斑馬魚，按雌雄1∶2比例放入交配缸內(nèi)，次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水將胚胎進行清洗后，放入28 ℃恒溫控光培養(yǎng)箱內(nèi)，每日更換胚胎培養(yǎng)水2次。

2.2 樣品制備

2.2.1 胚胎培養(yǎng)水 按照文獻[6]的標(biāo)準(zhǔn)配制。

2.2.2 單體成分 精密稱取丹酚酸B 15 mg，溶于胚胎培養(yǎng)水中，獲得3000 μg/mL的樣品母液，給藥前再用胚胎培養(yǎng)水稀釋至不同濃度。

2.2.3 單味中藥 根據(jù)含丹參成方制劑的制備過程中丹參的常用提取方法進行制備[8]。取丹參飲片粉碎，過40目篩，稱取2份100 g粉末，分別加入10倍量水、95%乙醇，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，真空干燥。精密稱取2種提取物各30 mg，溶于0.03 mL DMSO，再加胚胎培養(yǎng)水9.97 mL，獲得3000 μg/mL樣品母液，給藥前再用胚胎培養(yǎng)水稀釋成不同濃度的溶液，并保證篩選體系中DMSO終體積分?jǐn)?shù)不高于0.1%[9]。

2.2.4 復(fù)方 取消栓通絡(luò)片，粉碎，過80目篩，精密稱取30 mg，加入胚胎培養(yǎng)水，超聲處理30 min，過濾，制成3000 μg/mL樣品母液，給藥前再用胚胎培養(yǎng)水稀釋至不同濃度。

2.3 造模和分組

在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的72 hpf（hours post-fertilization）斑馬魚幼魚，并將其隨機置于含有3 mL胚胎培養(yǎng)水的6孔板中，每孔30條。除空白組斑馬魚繼續(xù)正常養(yǎng)殖不予造模外，其余斑馬魚用終濃度為15 μmol/L的鹽酸腎上腺素溶液避光處理16 h，用鄰聯(lián)茴香胺染色液染色，以斑馬魚尾靜脈血栓的形成，心臟紅細胞染色強度的減少為指標(biāo)，證實斑馬魚血栓模型造模成功。將板孔按順序編號，按隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組和中藥各劑量組，每組3孔。

2.4 給藥

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)丹酚酸B濃度為100、35、10 μg/mL，丹參水提取物濃度為900、300、90 μg/mL，丹參95%乙醇提取物濃度為45、15、4.5 μg/mL，消栓通絡(luò)片濃度為1200、400、120 μg/mL。給藥組斑馬魚給予上述濃度的試藥，空白組斑馬魚給予胚胎培養(yǎng)水，陽性對照組斑馬魚給予10 μg/mL阿司匹林溶液，置于28.5 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中。取不同親本斑馬魚幼魚重復(fù)實驗3次。

2.5 心臟紅細胞染色強度檢測

已有國家專利（國家專利號：201110126427.2）報道斑馬魚尾靜脈血栓形成的程度與心臟紅細胞數(shù)（紅細胞染色強度）成反比[2]。因此，本實驗用鄰聯(lián)茴香胺染色液對斑馬魚染色，通過計算斑馬魚心臟紅細胞染色強度的方法，對中藥抗血栓活性進行定量分析。染色液配制：精密稱取鄰聯(lián)茴香胺30 mg、醋酸鈉41 mg，置50 mL容量瓶中，加35%過氧化氫溶液1.1 mL，再用40%乙醇定容，搖勻[10]。在實驗終點，從每組隨機抽取10條斑馬魚，用現(xiàn)配的鄰聯(lián)茴香胺染色液染色30 min，再用DMSO清洗3次，用自制發(fā)圈將幼魚取出，側(cè)位放置于雙凹載玻片上，置于鏡下對心臟進行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6圖像處理軟件統(tǒng)計斑馬魚紅細胞染色強度，進行定量分析。

2.6 尾靜脈血小板熒光聚集檢測

取72 hpf的Tg（-6.0itga2b：EGFP）斑馬魚幼魚按“2.3”項下處理，在實驗終點，使用麻醉劑將斑馬魚麻醉，鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)血小板聚集情況并拍照，評價試藥對斑馬魚血小板聚集的抑制作用。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±表示，組間比較采用方差分析。＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 丹酚酸B對斑馬魚血栓形成的影響

與空白組比較，模型組斑馬魚心臟紅細胞染色強度明顯減少（＜0.01），表明建模成功；與模型組比較，陽性對照組斑馬魚心臟紅細胞染色強度增加（＜0.01）。低濃度（≤35 μg/mL）丹酚酸B溶液未表現(xiàn)出血栓抑制作用，而100 μg/mL丹酚酸B組斑馬魚與模型組比較，心臟紅細胞染色強度增加（＜0.01），表現(xiàn)出顯著的抑制血栓形成的作用。結(jié)果見表1。

表1 丹酚酸B對斑馬魚血栓形成的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

4.2 丹參不同提取物對斑馬魚血栓形成的影響

丹參不同提取物在實驗條件下均顯示出有抑制斑馬魚血栓形成的作用。丹參水提物濃度≥300 μg/mL時，斑馬魚心臟紅細胞染色強度與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），但在90 μg/mL時，未表現(xiàn)出抑制血栓形成的作用；其95%醇提物在低劑量時（≤15 μg/mL），也未表現(xiàn)出抑制血栓的作用，但隨著濃度的升高，其抑制作用增強，45 μg/mL時，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 丹參提取物對斑馬魚血栓形成的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

4.3 消栓通絡(luò)片對斑馬魚血栓形成的影響

消栓通絡(luò)片在120 μg/mL時，對斑馬魚血栓形成無明顯影響，但隨著劑量的增加其抑制血栓作用明顯增加，在濃度≥400 μg/mL時，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），能顯著抑制斑馬魚血栓的形成。結(jié)果見表3。

表3 消栓通絡(luò)片對斑馬魚血栓形成的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

4.4 斑馬魚尾靜脈血小板熒光聚集檢測結(jié)果

空白組無血小板聚集，模型組血小板聚集明顯增多，陽性對照組聚集減少，給藥組血小板聚集程度與上述各組斑馬魚心臟紅細胞的染色強度相反，即2種方法得到的各組血栓形成結(jié)果一致。結(jié)果見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D.100 μg/mL丹酚酸B組；E.35 μg/mL丹酚酸B組；F.10 μg/mL丹酚酸B組；G.900 μg/mL丹參水提物組；H.300 μg/mL丹參水提物組；I.90 μg/mL丹參水提物組； J.45 μg/mL丹參95%醇提物組；K.15 μg/mL丹參95%醇提物組； L.4.5 μg/mL丹參95%醇提物組；M.1200 μg/mL消栓通絡(luò)片組； N.400 μg/mL消栓通絡(luò)片組；O.120 μg/mL消栓通絡(luò)片組

5 討論

血栓形成是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要因素。活血化瘀類中藥具有良好的抗血栓活性，已被廣泛應(yīng)用于臨床，并且從中藥中篩選出良好的抗血栓物質(zhì)，進行藥物研發(fā)，已引起國內(nèi)外的普遍重視。隨著斑馬魚血栓模型研究的深入，其逐步成為抗血栓藥物篩選的模型生物。Zhu X Y等[2]研究發(fā)現(xiàn)，一些臨床常用抗血栓藥物如鹽酸地爾硫卓注射液、黃芪注射液、華法林鈉等作用于斑馬魚的藥效與在哺乳動物中的相近，說明利用斑馬魚模型篩選抗血栓藥物的有效性。中藥是一個多成分的復(fù)雜體系，有著多成分、多靶點的作用特點。斑馬魚血栓模型能否應(yīng)用于中藥這種復(fù)雜體系，并且如何評價中藥的抗血栓活性，已成為藥物篩選工作者關(guān)注的問題。

丹酚酸B是從丹參中提取出的一種具有抗血栓活性的成分，通過抑制凝血酶、花生四烯酸等阻止血小板活化[11]，對心腦血管疾病具有治療作用。本實驗結(jié)果顯示，丹酚酸B對斑馬魚血栓形成也具有明顯的抑制作用，模型適用性良好。根據(jù)含丹參成方制劑的制備過程中丹參的常用提取方法，實驗采用水和95%乙醇回流提取的方法，獲得丹參的不同提取成分，進行活性評價。不同丹參提取物在一定劑量下對斑馬魚血栓形成均有較強的抑制作用。中藥復(fù)方由多味中藥組成，比單味中藥的化學(xué)成分體系更為復(fù)雜。本實驗采用斑馬魚血栓模型考察中藥復(fù)方對血栓形成的影響，結(jié)果顯示，消栓通絡(luò)片對斑馬魚血栓形成有明顯的抑制作用，與張冉等[12]采用小鼠、大鼠研究消栓通絡(luò)方的結(jié)果相符，說明在抗血栓藥物的篩選與評估方面，斑馬魚血栓模型與傳統(tǒng)動物血栓模型的效應(yīng)相似。

實驗利用血小板熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚和斑馬魚早期幼魚透明的特點，熒光顯微鏡下對斑馬魚血流速度和血小板聚集情況進行可視化追蹤與定性分析，發(fā)現(xiàn)給藥組斑馬魚與模型組比較，血流速度明顯增加，血小板聚集明顯減少。推測丹參可能是通過加快血流速度和抑制血小板活化來誘導(dǎo)斑馬魚血栓形成，這與臨床應(yīng)用丹參治療血栓性疾病的機制相似。因此，斑馬魚血栓模型能較好地模擬中藥抑制血栓形成的過程，有望用于中藥抗血栓機制的研究。

綜上所述，已知具有抑制血栓形成作用的中藥單體成分、提取物、復(fù)方在斑馬魚血栓模型上顯示了抗血栓作用。斑馬魚與傳統(tǒng)的嚙齒類動物小鼠、大鼠等相比，具有諸多優(yōu)勢。此外斑馬魚對DMSO有良好的耐受性，溶解性較差的藥物可溶解在DMSO中通過皮膚擴散吸收[13]。因此，斑馬魚血栓模型對不同層次中藥形式的抗血栓活性篩選具有良好的適用性，可為中藥抗血栓活性的篩選與新藥研發(fā)提供高通量和重復(fù)性良好的模型生物。

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Applicability of Zebra Fish Thrombosis Model in Antithrombotic Activity Screening of Chinese Materia Medica

FAN Jiao-jiao, QIAO Yi-han, ZHAO Chong-jun, NI Yuan-yuan, YANG Ran, FENG Ya-ru, MA Zhi-qiang, LIN Rui-chao

Objective To investigate the applicability of zebra fish thrombosis model in antithrombotic activity screening of Chinese materia medica. Methods The living zebra fish thrombosis model was induced by adrenaline hydrochloride. Zebra fish were randomly divided into blank control group, model group, positive medicine group and medication group. Each group was given the corresponding medicine or embryo culture water. O-anisidine staining solution was used to stain and calculate the staining intensity of erythrocytes in zebra fish heart, and quantitative analysis was carried out. The platelet aggregation of transgenic zebra fish was observed and under qualitative analysis. Results Compared with the model group, 100 μg/mL salvianolic acid B, 300, 900 μg/mL aqueous extract of Salvia miltiorrhiza, 45 μg/mL 95% ethanol extract and 400, 1200 μg/mL hypothalamus could significantly inhibited the formation of zebra fish thrombosis (<0.01). Conclusion Zebra fish thrombosis model has good applicability in antithrombotic activity screening of Chinese materia medica.

zebra fish thrombosis model; Chinese materia medica; activity screening; adaptability

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.014

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0058-04

北京市科委創(chuàng)新環(huán)境與平臺建設(shè)專項（Z16111000500000）

林瑞超，E-mail：linrch307@sina.com；馬志強，E-mail：mazq1968@sina.com

（2016-11-15）

（2016-12-02；編輯：華強）