黎藥益智仁不同極性部位提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠的影響Δ

房磊臣，劉 嬙，高新征，韋 祎，劉一鳴，黃 凌#（.海南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，?？?570；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，吉林吉林 320）

黎藥益智仁不同極性部位提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠的影響Δ

房磊臣1，2＊，劉 嬙1，高新征1，韋 祎1，劉一鳴1，黃 凌1#（1.海南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，海口 571101；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，吉林吉林 132011）

目的：考察黎藥益智仁4種不同極性部位提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠的影響。方法：將益智仁70%乙醇提取物浸膏用水分散后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇提取得相應(yīng)部位提取物。將42只小鼠隨機(jī)分為造模組（36只）和空白組（6只），造模組大鼠采用2，4，6-三硝基苯磺酸法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性腸炎模型。成模后，將造模小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組（柳氮磺胺吡啶腸溶片，52 g/kg）和益智仁不同極性部位（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位）提取物組（劑量均為10 g/kg，以生藥計(jì)），每組6只，ig給藥，每天1次，連續(xù)9 d，給藥體積為0.2m L/10 g；空白組和模型組小鼠ig生理鹽水。測(cè)定小鼠體質(zhì)量變化，對(duì)疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）進(jìn)行評(píng)分，測(cè)定結(jié)腸組織中髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性，觀察結(jié)腸組織病理變化并進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量下降百分率、DAI評(píng)分以及結(jié)腸組織中MPO、MDA活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)腸組織發(fā)生明顯病變。與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量顯著回升，DAI評(píng)分顯著降低，MPO活性顯著降低，病理評(píng)分顯著降低；陽(yáng)性組、益智仁正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物組小鼠結(jié)腸組織中SOD活性顯著升高，陽(yáng)性組和益智仁乙酸乙酯提取物組小鼠結(jié)腸組織中MDA活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：益智仁4種極性部位提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠均有一定改善作用，其中以乙酸乙酯部位和正丁醇部位效果較好。

益智仁；提取部位；實(shí)驗(yàn)性腸炎；小鼠

益智仁為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla M iq.）的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于海南和廣東，喜溫暖、濕潤(rùn)氣候，多生長(zhǎng)于林下陰濕處[1]。海南產(chǎn)益智仁較其余產(chǎn)地益智仁質(zhì)量更好，作為海南古老黎藥方劑中的常用藥材，是海南省著名的黎藥資源[2]。大量文獻(xiàn)表明，益智仁不僅具有抗氧化應(yīng)激、治療阿爾茨海默病的作用[3-6]，而且對(duì)消化系統(tǒng)疾病（如腹瀉等）也有一定的改善作用[4，7]。炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，嚴(yán)重影響了人們的身體健康和生活質(zhì)量，亟待發(fā)現(xiàn)安全有效的IBD治療藥物。在本研究中，筆者擬借助經(jīng)典實(shí)驗(yàn)性腸炎模型，觀察益智仁不同極性部位對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎小鼠的影響，為該藥的進(jìn)一步研究及綜合開發(fā)利用指出新的方向。

1 材料

1.1 儀器

722S型分光光度計(jì)（上海棱光儀器廠）；JD5000-2型電子天平（天津市安特傳感技術(shù)有限公司）；LDZ5-2型快速離心機(jī)（北京芬格爾華安科技有限責(zé)任公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

益智仁（海南省海口市國(guó)瑞堂醫(yī)藥公司，批號(hào)：20140520），經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院王勇副研究員鑒定為真品；柳氮磺胺吡啶腸溶片（SASP，上海中西三維有限公司，批號(hào)：H31020450，規(guī)格：0.25 g/片）；髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140728、20140531、20140910）；正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.3 動(dòng)物

健康KM小鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量為15～22 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無(wú)不良反應(yīng)即進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 益智仁不同極性部位提取物的制備

取益智仁1.5 kg，粉碎，過一號(hào)篩，加70%乙醇9 L回流提取2次，每次1 h，紗布濾過，合并2次濾液，60以下減壓蒸餾，得益智仁70%醇提物浸膏108 g。稱取浸膏100 g，加水400m L攪拌成乳濁液，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，得到相應(yīng)萃取物，減壓干燥后得到相應(yīng)部位浸膏。取益智仁各部位浸膏各10 g，加入研缽中，分別往各研缽中慢慢滴加聚山梨酯80（加入量不超過5m L）并研磨，直至浸膏乳化，再加入雙蒸水補(bǔ)充體積至10m L，繼續(xù)研磨至乳濁液狀態(tài)，得到1 g/m L的益智仁不同極性部位提取物藥液。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[8]中方法建立實(shí)驗(yàn)性腸炎小鼠模型。將42只小鼠隨機(jī)分為造模組（36只）和空白組（6只），造模組小鼠禁食不禁水24 h，然后輕度乙醚麻醉，用直徑為2 mm的橡膠軟管插入肛門約4 cm，灌腸注入100μL含 1.0mg 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）的50%乙醇溶液，24 h后，灌腸注入含0.5mg TNBS的50%乙醇溶液100 μL，單次操作在30 s內(nèi)完成；導(dǎo)管保留在腸道幾秒，然后輕輕取出，再倒立30 s，使藥液達(dá)全結(jié)腸，然后將小鼠放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。空白組小鼠灌腸注入等體積生理鹽水，其余操作相同。

2.3 給藥

造模24 h后，將造模小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為模型組、陽(yáng)性組（SASP，52 g/kg）和益智仁不同極性部位（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位）提取物組[給藥劑量以益智仁生藥量計(jì)均為10 g/kg，經(jīng)人臨床用量的等效劑量換算而來(lái)]。ig給藥，給藥體積為0.2m L/10 g，每天1次，連續(xù)9 d；空白組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水。

2.4 小鼠體質(zhì)量測(cè)定

給藥期間每天稱定小鼠體質(zhì)量1次，觀察益智仁不同極性提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠體質(zhì)量的影響，并計(jì)算給藥第1、4、9天后小鼠體質(zhì)量下降百分率[（Wn－W1）/W1×100%，其中Wn表示給藥第n天小鼠的體質(zhì)量，W1表示給藥第1天小鼠的體質(zhì)量]。

2.5 小鼠一般情況與疾病活動(dòng)情況觀察

給藥后，每天觀察小鼠便血情況、大便性狀以及體質(zhì)量丟失率，參考文獻(xiàn)[9-10]中方法進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分[DAI評(píng)分＝（體質(zhì)量丟失率評(píng)分+大便性狀評(píng)分+便血情況評(píng)分）/3]。

2.6 小鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD、MDA活性測(cè)定

末次給藥2 h后處死小鼠，取一小段結(jié)腸組織，加入冰生理鹽水，制成10%組織勻漿，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，測(cè)定結(jié)腸組織中MPO、SOD、MDA活性。

2.7 小鼠結(jié)腸組織病理觀察

取小鼠部分結(jié)腸組織，常規(guī)制作病理切片后以蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察結(jié)腸黏膜損傷，根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分，指標(biāo)包括潰瘍、炎癥、肉芽腫及病變深度等。潰瘍：無(wú)潰瘍計(jì)0分，小潰瘍（直徑小于3mm）計(jì)1分，大潰瘍（直徑大于3mm）計(jì)2分；炎癥：無(wú)炎癥表現(xiàn)計(jì)0分，輕度炎癥（高倍視野下白細(xì)胞浸潤(rùn)低于10%，無(wú)結(jié)構(gòu)改變）計(jì)1分，中度炎癥（高倍視野下白細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)10%～24%，黏膜層的腺管伸長(zhǎng)、腸壁增厚，無(wú)潰瘍）計(jì)2分，重度炎癥（高倍視野下白細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)25%～50%，血管密度增高、腸壁增厚超出黏膜層）計(jì)3分，極重度炎癥（高倍視野下顯著的白細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)50%，高血管密度、腺管延長(zhǎng)扭曲、杯狀細(xì)胞丟失、透壁的腸壁增厚，伴隨潰瘍）計(jì)4分；肉芽腫：無(wú)計(jì)0分，有計(jì)1分；病變深度：至黏膜下層計(jì)0分，至肌層計(jì)1分，至漿膜層計(jì)2分。最后得分為各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分之和。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量變化

給藥第4天，與空白組比較，其余各組小鼠體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，益智仁不同極性部位提取物組小鼠體質(zhì)量下降程度更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第9天，與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量均明顯回升（P＜0.05），結(jié)果詳見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量下降百分率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of decrease percentage of bodymass of m ice in each group（±s，n＝6）

表1 各組小鼠體質(zhì)量下降百分率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of decrease percentage of bodymass of m ice in each group（±s，n＝6）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05

第9天1.74±1.34 24.59±5.33 4.45±3.46#11.04±3.58#10.14±1.76#9.86±1.17#9.46±0.84#組別空白組模型組陽(yáng)性組益智仁石油醚提取物組益智仁三氯甲烷提取物組益智仁乙酸乙酯提取物組益智仁正丁醇提取物組給藥前體質(zhì)量，g 22.2±1.04 22.5±1.17 20.5±1.22 23.7±1.07 21.4±1.31 21.6±1.21 24.2±1.02給藥不同時(shí)間后體質(zhì)量下降百分率，%第1天0000000第4天2.10±2.06 12.39±5.98＊＊9.16±2.93＊＊17.69±3.97＊＊19.59±5.56＊＊19.09±2.16＊＊18.60±6.27＊＊

3.2 小鼠DAI評(píng)分結(jié)果

給藥第9天，與空白組[DAI評(píng)分為（0.28±0.14）分]比較，模型組小鼠DAI評(píng)分[（2.89±0.34）分]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性組和益智仁石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取物組小鼠DAI評(píng)分[分別為（0.38±0.14）、（0.72±0.25）、（0.78±0.17）、（0.83± 0.18）、（0.72±0.14）分]均顯著降低（P＜0.01）。

3.3 小鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD、MDA活性測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性、陽(yáng)性組和益智仁乙酸乙酯提取物組小鼠結(jié)腸組織中MDA活性均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），陽(yáng)性組、益智仁乙酸乙酯提取物組和益智仁正丁醇提取物組小鼠結(jié)腸組織中SOD活性顯著升高（P＜0.05），結(jié)果詳見表2。

3.4 小鼠結(jié)腸組織病理觀察結(jié)果

與空白組（結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分為0分）比較，模型組小鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分[（9.16±0.93）分]顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組和益智仁石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取物組小鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分[分別為（1.78±0.33）、（2.26±0.33）、（1.96±0.53）、（2.11±0.14）分]均顯著降低（P＜0.05）。病理切片圖詳見圖1。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織MPO、SOD、MDA活性測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of MPO，SOD，MDA activities in colon tissue ofm ice in each group（±s，n＝6）

表2 各組小鼠結(jié)腸組織MPO、SOD、MDA活性測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of MPO，SOD，MDA activities in colon tissue ofm ice in each group（±s，n＝6）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

MDA，nmol/mL 15.12±1.33 45.56±1.56＊＊16.34±1.03##35.66±2.53 36.38±2.34 29.56±1.09#37.54±2.45組別空白組模型組陽(yáng)性組益智仁石油醚提取物組益智仁三氯甲烷提取物組益智仁乙酸乙酯提取物組益智仁正丁醇提取物組MPO，U/g 0.26±0.21 2.76±0.61＊1.28±0.53#1.97±0.31#1.99±0.51#1.56±0.13#1.48±0.43#SOD，U/mL 25.26±1.29 8.76±1.79＊15.28±0.83#18.97±2.51 19.49±2.99 16.56±2.58#15.46±2.16#

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理切片圖（HE染色，×200）Fig 1 Pathological sections of colon tissue ofm ice in each group（HE staining，×200）

4 討論

TNBS是一種弱有機(jī)酸，能在乙醇灼傷結(jié)腸黏膜后與灼傷的結(jié)腸黏膜組織中大分子組織蛋白的賴氨酸ε-氨基團(tuán)結(jié)合成為一種全抗原物質(zhì)，從而激發(fā)局部免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)腸炎的發(fā)生，且TNBS代謝產(chǎn)生的活性氧及過氧化物能對(duì)組織上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性而損傷腸壁組織。TNBS法造成的腸損傷與人類的炎癥性腸病在發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)等方面相似，是現(xiàn)在常用的結(jié)腸炎動(dòng)物模型造模法之一[12]。本課題組采用TNBS造模后，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)結(jié)腸壁增厚、結(jié)腸透壁性壞死、肉芽腫等結(jié)腸炎典型特征，并且伴隨著體質(zhì)量的持續(xù)下降，這提示本研究中的炎癥性結(jié)腸炎動(dòng)物模型成功建立。SASP由于具有良好的抑制TNBS所致實(shí)驗(yàn)性腸炎的作用，而成為實(shí)驗(yàn)性腸炎研究中最常用的陽(yáng)性藥物[13]。

本研究結(jié)果顯示，益智仁不同極性部位提取物組小鼠的體質(zhì)量都有明顯回升，大便全部變?yōu)楦稍餇顟B(tài)，都由顯性出血轉(zhuǎn)變?yōu)椴怀鲅?。病理?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益智仁不同極性部位提取物組小鼠結(jié)腸組織糜爛、潰瘍伴黏膜和黏膜下顯著的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。DAI綜合評(píng)分結(jié)果顯示，益智仁不同極性部位提取物組小鼠給藥第9天的DAI評(píng)分均顯著低于模型組，提示益智仁不同極性部位提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎均有較好改善作用。

MPO是中性粒細(xì)胞中含量較高的一種酶，可間接反映炎癥在組織中的存在，可用來(lái)衡量組織炎癥的程度。益智仁不同極性部位提取物均能顯著降低實(shí)驗(yàn)性腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中MPO活性，從而改善或減輕結(jié)腸炎癥。SOD是存在于生物體內(nèi)的一種抗氧化酶，能特異性地清除超氧陰離子，催化超氧化自由基分解成過氧化氫，進(jìn)而在過氧化酶的作用下分解成水分子和氧分子[14]。MDA是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使DNA損傷、酶及激素失活，損害細(xì)胞及細(xì)胞膜。在本研究結(jié)果中，模型組小鼠結(jié)腸組織中SOD活性顯著降低、MDA活性顯著升高，也進(jìn)一步證明了小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎模型成功建立。當(dāng)給予益智仁不同極性部位提取物后，發(fā)現(xiàn)益智仁乙酸乙酯提取物能顯著升高結(jié)腸組織中SOD活性，并能顯著降低結(jié)腸組織中MDA活性，這說明益智仁乙酸乙酯提取物能有效提高結(jié)腸組織對(duì)過氧化物的清除能力，減少過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)物生成。

綜上所述，益智仁4種極性部位均具有一定改善實(shí)驗(yàn)性腸炎的作用，且以益智仁乙酸乙酯和正丁醇提取物作用較好，筆者推測(cè)其作用與降低腸炎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，但其作用機(jī)制及有效成分物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Extracts from Different Polar Parts of Li M edicine Alpinia oxyphylla Fruit on M odel M ice w ith Experimental Colitis

FANG Leichen1，2，LIU Qiang1，GAO Xinzheng1，WEIYi1，LIU Yim ing1，HUANG Ling1（1.Teaching and Research Section of Pharmacology，Hainan Medical University，Haikou 571101，China；2.Reproductive Center，the Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin Jilin 132011，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of 4 polar parts extracts from Limedicine Alpinia oxyphylla fruit on model m ice w ith experimental colitis，and screen the effective parts of A.oxyphylla fruit in the treatment of colitis.METHODS：A fter 70%ethanol extract dispersed by water，petroleum ether，trichloromethane，ethyl acetate and n-butanolwere used in turn to obtain extractions in related parts.42m ice were random ly divided into modeling group（36m ice）and blank group（6m ice）.M ice inmodeling group were taken 2，4，6-nitrobenzne sulfonic acid method to replicate the experiment colitis.After modeling，model mice were random ly divided into model group，positive group（Sulfasalazine enteric coated tablets，52 g/kg），petroleum ether，trichloromethane，ethyl acetate，n-butanol extract from A.oxyphylla fruit groups（10 g/kg，calculated by crude drug），6 in each group，intragastrically adm inistrated once a day，for 9 d，0.2 m L/10 g；m ice in blank group and model group were intragastrically given normal saline.After adm inistration，body mass ofmice was determined，disease activity index（DAI）was scored and colonic myeloperoxidase（MPO），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）activities in colon tissue were detected，and the colon pathological changes were observed and scored.RESULTS：Compared w ith blank group，decrease percentage of body mass，DAI score，MPO and MDA activities in colon tissue inmodel group were increased（P＜0.05 or P＜0.01）；colon tissue was pathologically changed.Compared w ithmodel group，body mass was increased，DAIscore，MPO activity and pathological score in each adm inistration groupswere decreased；SOD activities in positive group，n-butanol extract from A.oxyphylla fruit group and ethyl acetate extract from A.oxyphylla fruit group were significantly increased，MDA activities in positive group and ethyl acetate extract from A.oxyphylla fruit group were significantly decreased，w ith statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS： The 4 polar parts extracs from A.oxyphylla fruit have certain improvement effects on modelm ice w ith experimental colitis，in which ethyl acetate and n-butanol parts are preferred.

Alpinia oxyphylla fruit；Extraction parts；Experimental colitis；M ice

R285

A

1001-0408（2017）16-2220-04

2016-10-27

2017-03-04）

（編輯：林 靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81360586，81473618）；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.812186，814290）；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目（No.ZY201332）；?？谑兄攸c(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013-50）

＊主治醫(yī)師，博士。研究方向：泌尿生殖。電話：0432-69989888。E-mail：470048098@qq.com

#通信作者：副教授，副研究員，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥動(dòng)學(xué)、新藥藥理學(xué)。電話：0898-31350701。E-mail：puer6@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.16