載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的制備及抑瘤作用研究

劉 煒，王曉彤，王建華（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 00038；2.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 00853）

載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的制備及抑瘤作用研究

劉 煒1＊，王曉彤1，王建華2#（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038；2.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853）

目的：制備載阿霉素聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸-聚乙二醇（PLGA-PLL-PEG）納米粒，并研究其抑瘤作用。方法：應(yīng)用PLGA-PLL和活化PEG聚合而成的PLGA-PLL-PEG為載體包載阿霉素，制得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒。檢測納米粒的形態(tài)大小、粒徑分布、阿霉素的含量，計算載藥量和包封率，比較納米粒和阿霉素在144 h內(nèi)的累積釋放率（Q）和對乳腺癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制率，計算半數(shù)抑制率（IC50）。結(jié)果：所制載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒為規(guī)則圓形，分散性良好，無黏連，平均粒徑為（136.7±9.3）nm（n＝5），平均包封率為（76.67±8.63）%，平均載藥量為（3.86±0.55）%（n＝3）；阿霉素的Q12h達100%，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的Q24h為52.9%、Q144h為81.2%。載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率較阿霉素增長緩慢，二者的IC50分別為1.844、0.345μg/m L。結(jié)論：成功制得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，其具有良好的緩釋效果，其抑瘤作用強于阿霉素。

阿霉素；聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸；聚乙二醇；納米粒；腫瘤細(xì)胞；抑制

阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，通過干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止信使RNA（mRNA）的形成發(fā)揮抗腫瘤作用，目前在臨床上常用于各種實體腫瘤治療[1]。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物給藥方法難以使藥物濃度聚集在腫瘤局部，因此臨床療效差，而且對全身組織器官的毒副作用顯著。本研究旨在應(yīng)用具有緩控釋特點的骨架型高分子材料，通過改變藥物劑型來改變藥物的釋放特點，并應(yīng)用于局部腫瘤治療中，使腫瘤局部持續(xù)緩慢地形成高濃度藥物，以增強抗腫瘤作用，并降低其對機體的毒副作用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一類可生物降解的高分子聚合物，聚賴氨酸（PLL）是具有氨基酸重復(fù)單元的多肽，具有帶正電的氨基基團，經(jīng)過PLL修飾后的PLGA納米粒，能顯著增加細(xì)胞的攝取率，再通過聚乙二醇（PEG）修飾可以延長納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時間。本研究應(yīng)用復(fù)乳法，以PLGA-PLL和活化的PEG聚合而成的PLGA-PLLPEG為載體包載阿霉素，制成載阿霉素PLGA-PLLPEG納米粒，并觀察其體外釋放行為和抗腫瘤作用，旨在為研究抗腫瘤藥物的局部應(yīng)用劑型提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與透析袋

F-7000熒光分光光度計、JEM-200CX透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Zetasizer-3000激光粒度分布測量儀（英國Malvern公司）；ST16離心機（美國Thermo公司）；伯樂680全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；透析袋（美國MFPI公司，截留分子量：7 000）。

1.2 藥品與試劑

阿霉素原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：160219，純度：99.0%）；PLGA-PLL（美國Sigma公司，批號：16010785，分子量：2 000）；活化PEG（CDI-PEGCDI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20160317，分子量：2 000）；聚乙烯醇（PVA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純）；MTT（上海碧云天生物技術(shù)研究所，分析純）。

1.3 細(xì)胞

乳腺癌HeLa細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 PLGA-PLL-PEG的制備

取0.5 g CDI-PEG-CDI，溶于無水DMF中，再加入1.0 g PLGA-PLL，攪拌反應(yīng)48 h。CDI-PEG-CDI帶有活潑的?；溥蚧鶊F，可以酰胺鍵與PLGA-PLL的氨基酸基團相連，生成PLGA-PLL-PEG。反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋透析上述反應(yīng)液，共24 h，將透析后的產(chǎn)物真空干燥24 h，得PLGA-PLL-PEG。

2.2 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的制備

取一定量的PLGA-PLL-PEG溶于2 m L二氯甲烷中，作為油相；取阿霉素溶于聚山梨酯80水溶液（質(zhì)量濃度為60mg/m L）10m L中，作為水相；將水相逐滴加至油相中，超聲形成乳液。將上述乳液加入至50m L PVA水溶液（質(zhì)量濃度為3mg/m L），攪拌2 h，15 000 r/min（離心半徑14 cm）離心30m in，冷凍干燥24 h，得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒。

2.3 納米粒的特征

取適量的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，用超純水稀釋，滴在載有碳膜的銅網(wǎng)上，應(yīng)用透射電子顯微鏡分析納米粒的形態(tài)大小。同樣取稀釋的納米粒應(yīng)用激光粒度分布測量儀分析其粒徑分布。

2.4 阿霉素的含量測定

[2]方法，應(yīng)用熒光分光光度計對阿霉素的含量進行測定，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長590 nm。

2.5 納米粒的載藥量與包封率

取一定量冷凍干燥的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒粉末，溶于定量DMSO溶液中，稀釋至一定濃度，按照“2.4”項下方法測定納米粒中阿霉素的含量，計算納米粒的載藥量和包封率。載藥量（%）＝納米粒中阿霉素的質(zhì)量/納米粒的質(zhì)量×100%，包封率（%）＝納米粒中阿霉素的質(zhì)量/阿霉素的加入質(zhì)量×100%。

2.6 納米粒的體外釋放試驗

精密量取適量的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，分散于pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）中，置于透析袋中，再將透析袋置于200 m L釋放介質(zhì)（pH 7.4 PBS）中，在37恒溫?fù)u床中進行釋放試驗。分別于2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144 h取樣，取樣同時補加等量等溫釋放介質(zhì)，測定樣品中阿霉素含量，計算累積釋放率（Q）。另取阿霉素原料藥作為對照，按上述方法測定其Q，比較載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒和阿霉素在不同時間點的Q。

2.7 納米粒的抑瘤作用

調(diào)整HeLa細(xì)胞密度為2×104個/m L，接種在96孔板上，試驗分為阿霉素組和納米粒組，分別加入阿霉素質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/m L的阿霉素原料藥或載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。作用12、24、48、72、96 h后，移除含藥培養(yǎng)基，每孔加入200μL含10%MTT（0.5mg/m L）的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入200μL的DMSO。用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的光密度（OD），計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－加藥孔OD值）/空白對照孔OD值×100%。應(yīng)用SPSS 18.0軟件計算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3 結(jié)果

3.1 納米粒的表征

所制載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒為規(guī)則圓形，分散性良好，無黏連，平均粒徑為（136.7±9.3）nm（n＝5）。載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的透射電鏡圖見圖1，粒徑分布見圖2。

圖1 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的透射電鏡圖Fig 1 TEM images of adriam ycin-loaded PLGAPLL-PEG nanoparticles

圖2 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.2 納米粒的包封率與載藥量

所制3批載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的包封率分別為77.6%、74.9%、77.5%，平均值為（76.67± 8.63）%；載藥量分別為3.85%、3.78%、3.95%，平均值為（3.86±0.55）%。

3.3 體外釋放行為

阿霉素的Q2h為83.6%，Q12h已達100%；載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的Q12h為41.3%，Q24h為52.9%，Q144h為81.2%。結(jié)果提示阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒具有緩釋作用，可持續(xù)釋放144 h以上。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的釋放曲線見圖3。

圖3 阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的釋放曲線Fig 3 Release curves of adriam ycin and adriam ycinloaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.4 抑瘤作用

3.4.1 不同作用時間下的抑瘤作用 在阿霉素質(zhì)量濃度為0.2μg/m L時，隨作用時間延長，阿霉素對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率增長迅速，作用12 h的增殖抑制率已達56.2%，作用48 h后增殖抑制率逐漸進入平臺期，作用96 h的增殖抑制率為96.7%。與阿霉素比較，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率隨作用時間的延長緩慢增長，作用12 h的增殖抑制率為19.6%，作用96 h的增殖抑制率為73.1%，提示載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒具有緩釋作用。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率-時間曲線見圖4A。

圖4 阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制曲線Fig 4 Proliferation inhibition curves of adriam ycin and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleson HeLa cells

3.4.2 不同藥物濃度下的抑瘤作用 與阿霉素比較，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率增加，阿霉素的IC50為0.345μg/m L，載阿霉素PLGAPLL-PEG納米粒的IC50為1.844μg/m L，提示載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒比同濃度的阿霉素表現(xiàn)出更強的抑瘤作用。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制率-藥物濃度曲線見圖4B。

4 討論

藥物緩釋系統(tǒng)是將藥物負(fù)載于可降解或不可降解的載體中，從而降低藥物的釋放速度。藥物的擴散除自身擴散外，還包括通過骨架的生物降解和溶蝕作用、滲透壓作用，達到緩釋的目的[3-4]。

生物相容性好和生物降解性是緩控釋體系載體材料的主要特點，具有良好的生物降解性的高分子材料如明膠、血清蛋白等具有較好的生物相容性[5-6]。明膠作為一種水溶性高分子材料，可作為藥物微球或微膠囊化的載體，然而此類載體制備困難、成本較高，因此近年來由于合成類的可生物降解聚合物載體對藥物具有緩釋作用，故逐漸開發(fā)應(yīng)用于緩控釋體系中，如脂肪族聚酯類、聚氨基酸類[7-8]。目前研究最廣泛的合成類聚合物載體是聚乳酸及其衍生物，已有研究應(yīng)用復(fù)乳法制備了各種藥物的聚乳酸微球[9]。然而聚乳酸具有親油疏水性，在水溶液中的懸浮性較差，因此常加入帶羥基化合物如聚乙二醇單甲醚（mPEG）交聯(lián)進行改造，mPEG等親水性物質(zhì)能調(diào)節(jié)聚乳酸載體的降解速度[10-11]。PLGA與m PEG交聯(lián)形成的mPEG-PLGA為兩性聚合物，能夠轉(zhuǎn)載親水性藥物或疏水性藥物[12-13]。本研究應(yīng)用復(fù)乳法制備的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，阿霉素的包封率為（76.57±8.63）%，載藥量為（3.86±0.55）%（n＝3）。

抗腫瘤藥物的緩慢釋放，能提高藥物的療效，并降低毒副作用，因此藥物的釋放速率是考察藥物緩釋系統(tǒng)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，制備的載阿霉素PLGAPLL-PEG納米粒Q12h為41.3%，Q24h為52.9%，Q144h為81.2%。這提示24 h內(nèi)為起始突釋期，為藥物從載體表面的釋放或近表面的藥物在幾小時內(nèi)快速釋放時期；24 h之后藥物的釋放共包括兩種機制，即聚合物載體的溶蝕和載體孔道的擴散，聚合物載體溶蝕后釋放出部分藥物，載體溶蝕后或形成孔道，藥物從孔道擴散釋放，構(gòu)成體外釋放的降解緩釋期。

本研究通過比較不同濃度載阿霉素PLGA-PLLPEG納米粒和阿霉素對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對細(xì)胞的IC50顯著高于阿霉素，說明PLGA-PLL-PEG納米粒提高了阿霉素對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，具有更強的抗腫瘤作用。

參考文獻

[1] Prylutska SV，Skivka LM，Didenko GV，etal.Complex of C60 fullerenew ith doxorubicin asa promising agent in antitumor therapy[J].Nanoscale Res Lett，2015，10（1）：499.

[2] 李桂云.熒光分析法測定注射用鹽酸阿霉素的含量[J].中國藥物與臨床，2013，13（S1）：26-27.

[3] ChiangWL，Hu YC，Liu HY，etal.Injectablemicrobeads w ith a thermo-responsive shell and a pH-responsive coreas a dual-sw itch-controlled release system[J].Small，2014，10（20）：4100-4105.

[4] Yao J，Zhang S，LiW，etal.Correction：in vitro drug controlled-release behavior of an electrospun modified poly（lactic acid）/bacitracin drug delivery system[J].Rsc Advances，2015，6（1）：515-521.

[5] 余琰，范凌云，高建德，等.鹽酸小檗堿微囊的制備及其體外釋放研究[J].中國藥房，2015，26（1）：109-112.

[6] 張華，張卿，賈運濤，等.紫外分光光度法測定姜黃素白蛋白納米混懸劑的包封率[J].中國藥房，2012，23（43）：4068-4070.

[7] Zhao J，Qiao Y，Zhou M，etal.Antitumor efficacy of irreversible electroporation and doxorubicin-loaded polymericmicelles[J].AcsMacro Lett，2015，4（10）：1081-1084.

[8] Langroodi FA，GhahestaniZH，A libolandiM，etal.Evaluation of the effect of crocetin on antitumor activity of doxorubicin encapsulated in PLGA nanoparticles[J].Nanomedicine，2016，3（1）：23-34.

[9] LiRD，Zhang JJ，Chen JF，etal.Modified polylactic acid loading docetaxel for anticancer drug delivery[J].Ciesc J，2014，65（6）：2357-2362.

[10] WangW，Chen S，Zhang L，etal.Poly（lactic acid）/chitosan hybrid nanoparticles for controlled release of anticancer drug[J].Mater SciEng CMater Biol Appl，2015，doi：10.1016/j.msec.2014.10.048.

[11] Cumm ins C，Mokarian-Tabari P，Holmes JD，etal.Selective etching of polylactic acid in poly（styrene）-block-poly（d，l）lactide diblock copolymer for nanoscale patterning [J].JApplPolym Sci，2014，131（18）：9493-9504.

[12] Liu P，Sun Y，Wang Q，et al.Intracellular trafficking and cellular uptake mechanism of mPEG-PLGA-PLL and mPEG-PLGA-PLL-Gal nanoparticles for targeted delivery to hepatomas[J].Biomaterials，2014，35（2）：760-770.

[13] Lv W，Cheng L，Li B.Development and evaluation of a novel TPGS-mediated paclitaxel-loaded PLGA-m PEG nanoparticle for the treatment of ovarian cancer[J].Chem Pharm Bull：Tokyo，2015，63（2）：68-74.

（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation and Antitumor Activity of Adriam ycin-loaded PLGA-PLL-PEG Nanoparticles

LIU Wei1，WANG Xiaotong1，WANG Jianhua2（1.Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China；2.Institute of Geriatrics，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To prepare adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles，and study its antitumor activity.METHODS：PLGA-PLL-PEG w ith the polymerization of PLGA-PLL and activated polyethylene glycol was used as carrier for adriamycin，and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleswere prepared.The shape size，particle size distribution，adriamycin content of nanoparticles were detected，drug loading and encapsulation efficiency were calculated.Cumulative release rate（Q）of nanoparticles and adriamycin w ithin 144 h and its proliferation inhibition rate on breast cancer HeLa cells were compared，and half inhibitory rate（IC50）was calculated.RESULTS：Prepared adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles were regular circular w ith good dispersion and no adhesion.The average particle size was（136.7±9.3）nm（n＝5），average encapsulation efficiency was（76.67±8.63）%，average drug loading was（3.86±0.55）%（n＝3）.Q12hof adriamycin had reached 100%；Q12hof adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles was 52.9%，Q144hwas 81.2%.The inhibitory rate of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles on HeLa cells increased slow ly than adriamycin；IC50were 1.844，0.345μg/m L，respectively.CONCLUSIONS：Adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles are prepared successfully，show ing good sustained-release effect and more significant inhibitory effect than adriamycin.

Adriamycin；PLGA-PLL；PEG；Nanoparticles；Tumor cells；Inhibitory

R943

A

1001-0408（2017）16-2262-04

2016-11-03

2017-02-17）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥劑學(xué)。電話：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：老年醫(yī)學(xué)。電話：010-66876421。E-mail：rambler973@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.28