清腦片對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用Δ

黎丹東，謝國旗，高延玲，蘇 峰，王希東，李 艷，張正臣（1.解放軍第71醫(yī)院醫(yī)務處，河南新鄉(xiāng)5000；.解放軍第71醫(yī)院腦外科，河南新鄉(xiāng) 5000；.解放軍第71醫(yī)院感染科，河南新鄉(xiāng) 5000；.解放軍第71醫(yī)院藥械科，河南新鄉(xiāng) 5000）

清腦片對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用Δ

黎丹東1＊，謝國旗2#，高延玲2，蘇 峰3，王希東4，李 艷4，張正臣4（1.解放軍第371醫(yī)院醫(yī)務處，河南新鄉(xiāng)453000；2.解放軍第371醫(yī)院腦外科，河南新鄉(xiāng) 453000；3.解放軍第371醫(yī)院感染科，河南新鄉(xiāng) 453000；4.解放軍第371醫(yī)院藥械科，河南新鄉(xiāng) 453000）

目的：研究清腦片對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用。方法：取大鼠隨機分為假手術組、模型組、腦絡通膠囊組（陽性對照，0.05 g/kg）和清腦片高、中、低劑量組（1.52、0.76、0.38 g/kg），每組10只。各給藥組大鼠ig相應藥物，假手術組和模型組大鼠ig等體積羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥1 h后，除假手術組外其余各組大鼠均采用線栓法制作腦缺血再灌注損傷模型。于缺血再灌注22 h后，進行大鼠神經功能缺失評分，觀察腦組織海馬區(qū)病理學變化，測定腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠出現不同程度神經功能缺失（評分降低）以及海馬區(qū)神經元稀疏、排列不規(guī)則等病理改變；腦組織中ATP、SOD水平降低（P＜0.01），LDH、TNF-α水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，清腦片各劑量組大鼠神經功能缺失評分升高（P＜0.05），病理損傷改善；除清腦片低劑量組外，其余各給藥組大鼠腦組織中各指標也顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。結論：清腦片可升高腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織中ATP、SOD水平，降低LDH、TNF-α水平，并明顯改善大鼠病理損傷。

清腦片；腦缺血再灌注損傷；大鼠；預防作用

腦血管疾病已成為我國居民死亡的第二大原因，其中缺血性腦血管疾病約占腦血管疾病的75%[1]。缺血性腦血管疾病的發(fā)病機制是由于腦組織血流量突然中斷或減少，當缺血區(qū)恢復供血后卻出現了更加嚴重的腦損傷，稱之為缺血性腦損傷[2]。如何有效地防治缺血性腦損傷已成為當今醫(yī)學界亟待解決的難題。缺血性腦損傷在中醫(yī)體系中歸屬于“中風”范疇，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點[3]，中醫(yī)理論中認為缺血性腦中風以氣虛血瘀最為常見[4]。

清腦片是解放軍第371醫(yī)院的院內協定處方，由白芷、川芎、當歸、鉤藤、細辛等7味中藥材組成，具有活血、行氣通竅、止痛、清利頭目的功效，臨床上主要用于頭痛、頭暈、腦震蕩后遺癥等的治療，安全性較高[5]。在本研究中，筆者擬通過測定腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平并結合腦組織海馬區(qū)病理變化，考察清腦片對缺血性腦損傷的作用，為其應用提供一定的實驗參考。

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV1000紫外-可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；CYT3MFVDG細胞成像微孔板檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）；BX61電動顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

清腦片（本院自制，批號：20141125，規(guī)格：0.3 g/片，生藥量為0.48 g/片）；腦絡通膠囊（河南輔仁堂制藥有限公司，批號：150309，規(guī)格：0.5 g/粒）；ATP、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160107、20160118）；大鼠TNF-α、LDH酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號均為20151201A）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級W istar大鼠，♂，體質量為250～280 g，購自濟南悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20140007。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將80只大鼠隨機分為6組，分別為假手術組（羧甲基纖維素鈉）、模型組（羧甲基纖維素鈉）、腦絡通膠囊組（陽性對照，0.05 g/kg，根據臨床用量的10倍劑量換算而得）及清腦片高、中、低劑量組（1.52、0.76、0.38mg/kg，分別根據臨床用量的20、10、5倍劑量換算而得），其中假手術組10只大鼠，其余各組均為14只。正常飼養(yǎng)3 d后，每天ig給藥1次，1m L/100 g，連續(xù)5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后ip 10%水合氯醛（0.35 m L/100 g）麻醉大鼠，頸部正中偏左切口，逐層分離暴露左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，阻斷頸內動脈，于頸外動脈距離分叉5mm處剪0.2 mm小口，將線栓插入，經頸總動脈分叉部進入頸內動脈，向上深入至分叉以上18～20mm，直至有阻力，即阻斷大腦中動脈入口處，結扎頸外動脈近端，2 h后輕輕抽出栓線；假手術組大鼠只暴露左側血管不作插線處理[6]。所有大鼠只栓塞左側大腦中動脈，復制腦缺血再灌注損傷模型。模型大鼠清醒后出現同側霍納綜合征及對側上肢重于下肢的癱瘓癥狀視為造模成功[7]。

2.2 神經功能缺失評分

大鼠再灌注22 h后，采用Zealonga法[8]對其神經功能缺失進行評分：無神經功能缺失癥狀、活動正常者，計0分；不能完全伸展對側前爪者，計1分；爬行時出現向右轉圈者，計2分；行走時身體向偏癱側傾倒者，計3分；不能自發(fā)行走、意識喪失者，計4分；死亡者，計5分。評分為0分或4分以上者均剔除，剔除后隨機補充大鼠保證每組10只。

2.3 腦組織病理形態(tài)學觀察

處死大鼠，取出腦組織，用4%緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋腦組織并制成4μm厚的切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察腦組織形態(tài)學改變[9]：“-”表示海馬區(qū)結構正常、神經細胞結構清晰；“+”表示腦組織海馬區(qū)水腫、神經元水腫、少數神經元壞死；“++”表示腦組織海馬區(qū)水腫、成片神經元壞死，梗死面積占海馬面積的1/3以內；“+++”表示腦組織海馬區(qū)水腫、成片神經元壞死，梗死面積占海馬面積的1/3以上。

2.4 腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測定

制備10%的腦組織勻漿，按相應試劑盒說明書操作，測定ATP、SOD、LDH、TNF-α水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者采用Games-Howell檢驗。等級資料采用Ridit檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 神經功能缺失評分結果

與假手術組（評分為0分）比較，模型組大鼠出現不同程度的神經功能缺損癥狀，神經功能缺失評分[（2.50±0.97）分]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡通膠囊組和清腦片高、中、低劑量組大鼠神經功能缺失癥狀均顯著改善，神經功能缺失評分[依次為（1.40± 0.52）、（1.50±0.53）、（1.70±0.48）、（1.70±0.67）分，n＝10]均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

3.2 腦組織海馬區(qū)病理觀察結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織海馬區(qū)神經元稀疏、排列不規(guī)則等，表現出顯著病變（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡通膠囊組和清腦片高、中劑量組大鼠腦組織海馬區(qū)病變顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。病理分級見表1，病理切片見圖1。

表1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)病理改變的測定結果（n＝10，只）Tab 1 Results of pathological changes of hippocampus of brain tissue of rats in each group（n＝10，case）

圖1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)病理切片圖（HE，×400）Fig 1 Pathological pictures of hippocam pus of brain tissueof rats in each group（HE，×400）

3.3 腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中ATP、SOD水平顯著降低（P＜0.01），LDH、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡通膠囊組和清腦片高、中劑量組大鼠腦組織中上述指標顯著改善（P＜0.05或P＜0.01），清腦片低劑量組大鼠上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Results of ATP，SOD，LDH，TNF-αlevels in brain tissueof rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Results of ATP，SOD，LDH，TNF-αlevels in brain tissueof rats in each group（±s，n＝10）

注：與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α，pg/mL 20.23±3.00 43.90±5.35＊＊29.67±5.38##29.47±3.72##34.94±2.76##43.82±3.67組別假手術組模型組腦絡通膠囊組清腦片高劑量組清腦片中劑量組清腦片低劑量組ATP，μmol/gprot 865.99±71.44 620.57±81.05＊＊791.42±91.59##716.34±74.91#710.03±85.02#675.13±72.98 SOD，U/mgprot 190.45±24.74 154.74±21.06＊＊182.10±21.25#174.85±19.06#172.16±15.49#166.33±18.36 LDH，U/L 1.20±0.22 1.80±0.30＊＊1.31±0.22##1.32±0.22##1.49±0.29#1.62±0.17

4 討論

清腦片中的白芷，味辛，性溫，具有通竅止痛、散風除濕的作用，為君藥。川芎，具有活血行氣、祛風止痛的功效；當歸，性溫，味辛，歸肝、心、脾經，具有補血、活血、止痛的作用[10]；鉤藤，性微寒，味甘，具有息風止痙、清熱平肝之功效[11]；細辛，性溫，味辛，具有祛風散寒、通竅止痛的功效，4藥合用共為臣藥。龍骨，性平，味甘、澀，歸心、肝、腎經，具有鎮(zhèn)驚安神、平肝潛陽、收斂固澀的作用，為佐藥。薄荷，性涼，味辛，具有疏散風熱、清利頭目之功效，為使藥。諸藥合用，具有活血、行氣、通竅止痛、清利頭目之作用。腦絡通膠囊為非處方心腦血管類藥品，具有擴張血管、增加腦血流量的作用，臨床用于各種腦血管疾病引起的頭痛、眩暈、半身不遂、肢體發(fā)麻、神疲乏力等癥，且臨床效果明顯，故在本研究中以此為陽性藥物。

腦組織中ATP含量不足會導致組成細胞架的蛋白和脂質降解，磷脂降解的產物（如溶血磷脂、自由脂肪酸和花生四烯酸等）可進一步觸發(fā)或發(fā)生氧化代謝反應而加重腦損傷[12]。LDH水平異常升高，一方面抑制了線粒體的呼吸功能，導致細胞內ATP耗竭，使腦的能量供給顯著減少；另一方面促使細胞內Ca2+超載和自由基生成，導致廣泛的腦損傷。SOD作為體內重要的抗氧化酶，可與超氧陰離子發(fā)生反應生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶催化轉變成水，保護細胞免受損傷[13]。TNF-α被認為是炎癥反應的始動介質，在炎癥網絡中具有關鍵作用，在腦缺血再灌注早期，TNF-α合成或分泌的增加是腦梗死形成的重要原因[14]。觀察腦神經細胞最可靠的方法是形態(tài)學，可發(fā)現缺血會造成大鼠腦神經細胞的損傷，表現為退化性的改變，同時神經細胞數也減少。本實驗研究結果顯示，高、中、低劑量清腦片均能夠明顯改善大鼠神經缺失癥狀，減輕腦組織海馬區(qū)病理損傷；高、中劑量清腦片均可明顯升高腦損傷大鼠腦組織中ATP、SOD水平，降低腦損傷大鼠腦組織中LDH、TNF-α水平。

綜上所述，清腦片能有效預防大鼠腦缺血再灌注損傷，其中以高、中劑量作用效果較好，但其具體作用機制仍需進一步研究。

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Preventive Effect of Qingnao Tablet on Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury in Rats

LI Dandong1，XIE Guoqi2，GAO Yanling2，SU Feng3，WANG Xidong4，LIYan4，ZHANG Zhengchen4（1.Dept.of Medical Service，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；2.Dept.of Cerebral Surgery，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；3.Dept.of Infectious Disease，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；4.Dept.of Instrument，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the preventive effect of Qingnao tablet on cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats. METHODS：Rats were random ly divided into sham operation group，model group，Naoluotong capsule group（positive control，0.05 g/kg），Qingnao tablet high-dose，medium-dose，low-dose groups（1.52，0.76，0.38 g/kg），10 in each group.Rats in all adm inistration groupswere intragastrically given relevantmedicines，rats in sham operation group and model group were intragastrically given equal volume of sodium carboxymethylcellulose solution，once a day，for 5 d.After 1 h of last administration，all rats were induced for cerebral ischemia-reperfusion injury model by suture-occluded method except for sham operation group.After 22 h of ischemia-reperfusion，neurological function deficit scoring was conducted；the pathological changes of the hippocampuswere observed；superoxide dismutase（SOD），adenosine triphosphate（ATP），lactate dehydrogenase（LDH），tumor necrosis factorα（TNF-α）levels in brain tissue weremeasured.RESULTS：Compared w ith sham operation group，rats in model group appeared different degrees of neurological deficits（score declined），sparse neurons，irregularly arranged in hippocampus aswell as other pathological changes；ATP，SOD levels in brain tissue were decreased（P＜0.01），LDH，TNF-αlevelswere increased（P＜0.01）.Compared w ith model group，neurological function deficit scores in Qingnao tablet doses groups were increased（P＜0.05），neurological deficits were improved.Except for sham operation group，brain tissue indexes in other adm inistration groups were significantly improved（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Qingnao tablet can increase ATP and SOD levels in brain tissue homogenate of model ratsw ith cerebral ischemia-reperfusion，decrease LDH and TNF-αlevels，and obviously improve rats’cerebral ischem ia-reperfusion injury.

Qingnao tablet；Cerebral ischemia-reperfusion injury；Rat；Preventive effect

R965.1

A

1001-0408（2017）16-2198-04

2016-10-14

2017-01-10）

（編輯：林 靜）

河南新鄉(xiāng)重點科技攻關項目（No.CXGG16054）

＊主治醫(yī)師。研究方向：神經外科、藥理學。電話：0373-5193515。E-mail：lidandong001@163.com

#通信作者：主任醫(yī)師，碩士。研究方向：神經內科、藥理學。電話：0373-3541018。E-mail：xiegq152@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.10