健脾生血顆粒對圍產(chǎn)期大鼠的毒性研究Δ

趙 剛，屈 文，肖 飛，郭小娟，楊艷霞，張勇慧，黃志軍#（.健民藥業(yè)集團兒童藥物研究院，武漢4005；.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 4000；.湖北省食品藥品安全評價中心，武漢 4007）

健脾生血顆粒對圍產(chǎn)期大鼠的毒性研究Δ

趙 剛1，2＊，屈 文3，肖 飛1，郭小娟1，楊艷霞1，張勇慧2，黃志軍1#（1.健民藥業(yè)集團兒童藥物研究院，武漢430052；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030；3.湖北省食品藥品安全評價中心，武漢 430073）

目的：考察健脾生血顆粒對圍產(chǎn)期大鼠的毒性作用。方法：將受孕大鼠按體質(zhì)量隨機分為陰性對照組和健脾生血顆粒低、中、高劑量組（0.77、2.31、6.93 g/kg），每組21只，從妊娠第15天開始至分娩后第21天止每天ig相應(yīng)藥物1次。觀察健脾生血顆粒對母代大鼠一般毒性和生育能力的影響，對F1代仔鼠運動能力、學(xué)習(xí)記憶能力、生育能力以及對F2代仔鼠早期發(fā)育能力的影響。結(jié)果：對母代的毒性作用方面，健脾生血顆粒高劑量組母代大鼠妊娠天數(shù)較陰性對照組顯著延長（P＜0.05），給藥初期體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）。對子代的毒性作用方面，健脾生血顆粒高劑量組F1代仔鼠初生體質(zhì)量較陰性對照組顯著降低（P＜0.05），第4、5次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間較陰性對照組顯著縮短（P＜0.01）；對F1代仔鼠生育能力及F2代仔鼠早期發(fā)育能力均未見明顯影響（P＞0.05）。健脾生血顆粒中、低劑量組子代大鼠各指標(biāo)均未見受到明顯影響。結(jié)論：健脾生血顆粒對母代及子代大鼠均未見毒性反應(yīng)的劑量為2.31 g/kg。

健脾生血顆粒；圍產(chǎn)期大鼠；毒性；仔鼠；生育能力；發(fā)育能力

健脾生血顆粒是健民藥業(yè)集團股份有限公司獨家品種，其中藥部分由益氣固表經(jīng)典名方“玉屏風(fēng)散”、健脾益氣經(jīng)典名方“四君子湯”和補腎壯骨經(jīng)典名方“龍骨湯”進行加減而得。君藥為黃芪、龜板，能健脾益肺補腎、益氣生血填精，且能固表止汗，預(yù)防外邪的侵襲，從而達到“肺脾腎三本通補”之功。臣藥為黨參、茯苓、白術(shù)，一方面可增強君藥補脾益肺之功，健脾益氣以生血；另一方面可增強君藥補肺實衛(wèi)、固表止汗之效，以治體虛多汗、易感外邪。山藥、五味子，則可增強君藥滋陰補腎化精之力，鞏固君藥益氣健脾生血之能，補益心神，寧心安神，有輔君之功[1]。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，健脾生血顆粒加入營養(yǎng)補充劑鐵元素，可有效治療缺鐵性貧血并改善相關(guān)癥狀[2-3]。

妊娠期婦女因胎兒快速生長對鐵元素的需求較大，而飲食上鐵的攝入又不足，從而導(dǎo)致缺鐵性貧血的發(fā)病率較高，有的孕婦雖然沒有明顯癥狀，但通過產(chǎn)檢可發(fā)現(xiàn)患有缺鐵性貧血[4-6]。健脾生血顆粒在治療妊娠期婦女缺鐵性貧血方面療效顯著，安全性較好，在臨床上已應(yīng)用數(shù)十年[7-8]。雖然臨床應(yīng)用過程中未出現(xiàn)相關(guān)不良事件的報道，但為了明確妊娠期婦女應(yīng)用本品的安全性，尤其是其生殖毒性作用，筆者通過動物模型分別考察動物在不同妊娠時期服用本品的安全性。其中，健脾生血顆粒對妊娠早、中期大鼠的胚胎-胎仔發(fā)育毒性作用已有相應(yīng)研究，未見相關(guān)毒性[9]。為了覆蓋本品對整個妊娠期過程的毒性作用研究，本課題繼續(xù)探索本品對大鼠妊娠晚期及分娩前后（圍產(chǎn)期）的毒性作用，以期為該產(chǎn)品的科學(xué)安全應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

PL2001-L型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；PGJ-10/20-AS型冠純水機（武漢品冠儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

健脾生血顆粒（健民藥業(yè)集團股份有限公司，批號：140111-18，規(guī)格：每克浸膏相當(dāng)于生藥材3.3 g、含七水硫酸亞鐵0.154 g）；水為飲用純凈水（漢神陽飲品有限公司）。

1.3 動物

2 方法

2.1 檢疫、合籠與給藥

在動物接收時，獸醫(yī)對所有動物進行檢疫，所有動物均檢疫合格、健康狀況良好。給藥開始前，所有大鼠至少適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。合籠時，♀大鼠體質(zhì)量為240～330 g，♂大鼠體質(zhì)量為360～500 g。所有大鼠當(dāng)月均飼養(yǎng)于IVC籠中，每籠2～3只，合籠交配后大鼠單只飼養(yǎng)，墊料為武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供的刨花墊料。動物飲用水為經(jīng)高壓滅菌消毒的瓶裝水。

將已受孕大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分為4組，分別為陰性對照組（純凈水）和健脾生血顆粒低、中、高劑量組（0.77、2.31、6.93 g/kg，以自制純凈水溶解），每組21只，每天ig給藥1次，10m L/kg，給藥周期為妊娠第15天（以觀察到精子或陰栓的當(dāng)天記為妊娠第0天）至離乳（分娩后第21天）。

2.2 大鼠存活期檢查

動物到達當(dāng)天及解剖當(dāng)天觀察1次是否存活；整個實驗期間的其余階段，每天觀察2次存活情況。存活標(biāo)準(zhǔn)為具有自主呼吸及心跳活動。

2.3 母代大鼠一般情況觀察

給藥前，對所有母代大鼠進行1次詳細觀察；給藥期間，每周1次，詳細觀察母代大鼠活動情況、毛發(fā)光澤、掉毛、糞便軟硬、糞便顏色等。對所有存活母代大鼠，給藥期間每次給藥前以及非給藥期均每天進行1次籠邊觀察。從妊娠第20天開始，每天2次檢查母代大鼠有無分娩的體征或者有無分娩。所有母代大鼠每隔3 d稱體質(zhì)量1次并計算攝食量（攝食量＝3 d內(nèi)投放的飼料總質(zhì)量－剩余的飼料總質(zhì)量）。

2.4 母代大鼠生育能力/繁殖能力以及F1代仔鼠生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶能力檢測

喜姑答應(yīng)著，趕緊換了一件衣服，出門一瞧，寶剛爹早已不見了蹤影。她徑直往香娭毑家里走去。老遠就看見香娭毑坐在屋前小坪里，與她坐在一塊的，還有桂娭毑，桃娭毑，這讓喜姑頗感意外。

母鼠分娩完畢后計算活產(chǎn)率（分娩的活體幼仔動物數(shù)/妊娠動物數(shù)）、出生存活率（出生時仔鼠存活數(shù)/出生仔鼠總數(shù)）以及生存率（產(chǎn)后第4天仔鼠存活數(shù)/出生時仔鼠存活數(shù)），并將所有仔鼠從分娩籠內(nèi)暫時取出，辨別每窩仔鼠的性別，稱量整窩仔鼠體質(zhì)量。剔除死仔鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)，仔鼠斷乳前每隔3 d稱量1次整窩仔鼠體質(zhì)量，斷乳后每2周稱量1次單只仔鼠體質(zhì)量。分娩后第2天即開始觀察仔鼠的雙側(cè)耳廓是否完全，記錄觀察到耳廓分離的時間；之后每隔一段時間觀察仔鼠門齒是否萌出，雙眼的覆蓋膜是否消失、雙眼是否均已睜開，腹毛生長情況、長出白色腹毛的時間，兩個外耳道的外口是否張開、耳廓是否有皺褶，♂鼠陰囊內(nèi)有無睪丸、睪丸下降的時間，♀鼠陰道處被膜是否消失、陰道口張開的時間，♂鼠陰莖龜頭是否與包皮分開等，考察其生長發(fā)育能力。上述指標(biāo)記錄的最終時間均為整窩仔鼠達標(biāo)的時間。此外，每窩分揀保留2只仔鼠，分別于分娩后第2天即進行平面翻正反射檢查、斷崖回避反射檢查，第4天進行負趨地性反射檢查，第8天進行觸須定位反射檢查，第12天進行空中翻正反射檢查，第16天進行視覺定位反射檢查，以考察其神經(jīng)發(fā)育能力；于分娩后第4周通過轉(zhuǎn)棒實驗（40 r/min）考察活動能力；于分娩后第11周通過Morris水迷宮實驗考察學(xué)習(xí)記憶能力。

2.5 F1代仔鼠生育能力及F2代仔鼠早期發(fā)育能力檢測

每窩保留1對♂♀仔鼠飼養(yǎng)至12周左右，按1∶1比例合籠進行組內(nèi)交配以檢測F1代的生育能力。按如下方法計算交配指數(shù)及生育力指數(shù)：♂鼠交配指數(shù)＝（交配成功的♂鼠數(shù)/用于交配的♂鼠數(shù)）×100%；♂鼠生育力指數(shù)＝（使♀鼠成功受孕的♂鼠數(shù)/用于交配的♂鼠數(shù)）×100%；♀鼠交配指數(shù)＝（交配成功的♀鼠數(shù)/用于交配的♀鼠數(shù)）×100%；♀鼠受孕指數(shù)＝（成功受孕的♀鼠數(shù)/用于交配的♀鼠數(shù)）×100%。交配后，飼養(yǎng)F1代仔鼠至分娩。記錄娩出的F2代胎鼠數(shù)，觀察死胎、活胎及胎鼠外觀、性別、體質(zhì)量等。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量數(shù)據(jù)均采用±s表示，計量資料的組間比較采用t檢驗分析，生育力/繁殖力指標(biāo)的組間比較采用卡方檢驗。假設(shè)檢驗均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾生血顆粒對母代大鼠的一般毒性

母代大鼠經(jīng)ig高劑量健脾生血顆粒后，主要表現(xiàn)為體質(zhì)量增長減緩、軟便、黑便，其中1只母代大鼠于給藥7 d后出現(xiàn)明顯消瘦、活動減少、身體發(fā)涼、豎毛、黑色軟便；ig低劑量健脾生血顆粒后，1只于妊娠第23天死亡，解剖可見肝臟表面散在暗紅色條紋狀斑塊，胃腸內(nèi)容物顏色偏黑，子宮內(nèi)見數(shù)個死胎，綜合其死亡前無明顯臨床癥狀、體質(zhì)量增長及攝食量均正常等情況，考慮該母代大鼠可能為與供試品無關(guān)的自然難產(chǎn)死亡；其余母代大鼠未見異常。與陰性對照組比較，健脾生血顆粒高劑量組母代大鼠體質(zhì)量在妊娠第18天后顯著降低（P＜0.05），但在產(chǎn)后7 d即恢復(fù)正常，其余各劑量組母代大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 健脾生血顆粒對母代大鼠生育能力/繁殖能力的影響

與陰性對照組比較，健脾生血顆粒高劑量組母代大鼠妊娠天數(shù)顯著增加（P＜0.05），中、低劑量組妊娠天數(shù)則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；健脾生血顆粒各劑量組F1代仔鼠活產(chǎn)率、出生存活率以及生存率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組母代大鼠生育能力/繁殖能力的測定結(jié)果見表1。

表1 各組母代大鼠生育能力/繁殖能力的測定結(jié)果Tab 1 Results of fertility/fecundity ofmaternal rats in each group

3.3 健脾生血顆粒對F1代仔鼠生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與陰性對照組比較，除健脾生血顆粒高劑量組F1代仔鼠整窩體質(zhì)量顯著降低外（P＜0.05），其余各劑量組F1代仔鼠生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)指標(biāo)以及活動能力相關(guān)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高劑量健脾生血顆?？赡軐W(xué)習(xí)記憶能力有一定的影響，與陰性對照組比較，健脾生血顆粒高劑量組F1代仔鼠（♂）第4次和第5次發(fā)現(xiàn)水下平臺的時間顯著延長（P＜0.01），但中、低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組F1代仔鼠運動能力和學(xué)習(xí)記憶能力的測定結(jié)果見表2。

3.4 健脾生血顆粒對F1代仔鼠生育能力及F2代仔鼠早期發(fā)育能力的影響

表2 各組F1代仔鼠運動能力和學(xué)習(xí)記憶能力的測定結(jié)果（±s）Tab 2 Results of athletic，learning and memory ability of F1 offspring rats in each group（±s）

注：與陰性對照組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.negative controlgroup，＊＊P＜0.01

觀察指標(biāo)轉(zhuǎn)棒試驗平均落地時間（♂），s轉(zhuǎn)棒試驗平均落地時間（♀），s第1次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♂），s第1次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♀），s第2次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♂），s第2次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♀），s第3次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♂），s第3次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♀），s第4次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♂），s第4次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♀），s第5次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♂），s第5次發(fā)現(xiàn)水下平臺時間（♀），s到達目標(biāo)象限花費時間（♂），s到達目標(biāo)象限花費時間（♀），s到達目標(biāo)象限經(jīng)過路程（♂），cm到達目標(biāo)象限經(jīng)過路程（♀），cm穿越水下平臺次數(shù)（♂）穿越水下平臺次數(shù)（♀）健脾生血顆粒高劑量組（n=21）28.3±17.3 44.6±16.5 50.2±7.1 54.7±6.2 40.9±11.7 46.4±12.1 35.0±13.7 38.9±13.6 26.3±12.0＊＊39.8±10.9 27.2±10.0＊＊36.2±8.0 16.3±5.5 14.8±8.1 409.9±134.0 362.8±94.9 0.8±1.0 0.3±0.6陰性對照組（n=21）39.4±19.9 52.5±14.4 50.3±7.2 56.9±5.8 41.0±11.9 48.8±10.6 40.3±12.4 44.8±11.1 36.3±9.1 41.9±10.2 37.6±9.6 35.7±6.9 15.9±5.3 13.3±6.6 464.0±166.4 375.3±140.5 0.8±0.7 0.4±0.6健脾生血顆粒低劑量組（n=20）38.8±20.2 48.7±15.4 52.9±6.9 56.4±4.7 44.6±13.7 45.4±10.9 39.9±9.2 42.1±9.7 32.9±9.2 37.8±12.2 35.0±9.3 36.0±5.9 15.5±4.0 12.1±5.6 456.7±148.4 369.1±190.7 1.1±1.0 0.6±1.1健脾生血顆粒中劑量組（n=21）36.2±18.3 46.9±16.5 49.0±7.8 54.3±6.4 42.5±11.7 45.5±8.5 33.6±11.8 43.7±7.3 38.1±10.5 39.6±8.9 31.8±11.1 36.9±7.1 16.5±4.5 14.3±7.7 472.7±136.8 354.5±132.3 1.3±1.0 0.6±0.9

與陰性對照組比較，健脾生血顆粒各劑量組F1代仔鼠的交配指數(shù)、生育力指數(shù)、受孕指數(shù)以及F2代仔鼠的活產(chǎn)率、出生存活率、生存率等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示母代大鼠在圍產(chǎn)期攝入健脾生血顆粒對F1代仔鼠生育力及F2代仔鼠早期發(fā)育均無明顯影響。各組F1代仔鼠生育能力的測定結(jié)果見表3，各組F2代仔鼠早期發(fā)育能力的測定結(jié)果見表4。

表3 各組F1代仔鼠生育能力的測定結(jié)果（%%）Tab 3 Results of fertility of F1 offspring rats in each group（%%）

表4 各組F2代仔鼠早期發(fā)育能力的測定結(jié)果Tab 4 Results of early viability of F2 offspring rats in each group

4 討論

健脾生血顆粒處方共有13味中藥，輔以硫酸亞鐵。前期已有研究對其配方進行了深入探索，研究發(fā)現(xiàn)健脾生血顆粒中藥成分可以上調(diào)大鼠腸道二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1（DMT-1）的表達，從而促進亞鐵離子的轉(zhuǎn)運，相對于單純補充亞鐵效果更優(yōu)[10]。健脾生血顆粒還可以通過促進Hepcidin抗菌肽mRNA的表達，來調(diào)節(jié)腸道對亞鐵的吸收以及血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白的飽和度，綜合作用促使機體高效地吸收與利用亞鐵離子，起到迅速治療缺鐵性貧血的作用。此外，還有研究報道，健脾生血顆粒對血清超氧化物歧化酶的活性、丙二醛的含量以及肝臟過氧化氫酶的活性等方面的影響比富馬酸亞鐵更優(yōu)，說明健脾生血顆粒具有明顯的清除自由基、抗氧化作用，從而起到提高免疫力、改善氣虛脾虛等癥狀的作用[11]。

本課題研究內(nèi)容是承接大鼠生殖毒性實驗研究而開展的，屬于受試藥物對圍產(chǎn)期動物的毒性作用評價。本研究結(jié)果顯示，高劑量的健脾生血顆粒對母代大鼠的一般情況有一定的影響，尤其是對母代大鼠體質(zhì)量的增長影響較大，與陰性對照組間具有顯著性差異。此外，高劑量的健脾生血顆粒還可能對F1代仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定影響，但其他方面指標(biāo)，例如生殖力、神經(jīng)發(fā)育等與陰性對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而低、中劑量的健脾生血顆粒對母代大鼠和子代仔鼠均無毒性作用。綜上可判斷，健脾生血顆粒對母代及子代大鼠的未見毒性反應(yīng)的劑量為2.31 g/kg，該劑量為臨床等效劑量的6倍，并且該給藥劑量是按照成人最大服藥量進行換算設(shè)計的。

[1] 楊勝，張仲林，袁明勇，等.玉屏風(fēng)散對肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響[J].中國藥房，2016，27（22）：3041-3044.

[2] 鄧玉清.對比單純應(yīng)用富馬酸亞鐵與聯(lián)合健脾生血顆粒治療小兒缺鐵性貧血的臨床療效[J].北方藥學(xué)，2016，13（2）：92-93.

[3] 賴冬梅.小兒缺鐵性貧血的藥物治療研究近況[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，18（1）：66-69.

[4] 張華俊，張永健.妊娠與缺鐵性貧血[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34（11）：1484-1486.

[5] 簡皓.妊娠合并缺鐵性貧血孕產(chǎn)婦的臨床分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2016，22（8）：153-154.

[6] 王麗，黃亮，陳力，等.補鐵劑治療缺鐵性貧血的現(xiàn)狀及研究進展[J].中國藥房，2009，20（25）：1995-1997.

[7] 白婧.妊娠合并貧血64例臨床診治分析[J].中國實用醫(yī)藥，2014，9（2）：137-138.

[8] 潘琳莉，張學(xué)勇，吳杰.健脾生血顆粒治療缺鐵性貧血60例療效觀察[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2010，32（2）：158-159.

[9] 趙剛，夏瑩，黃志軍，等.健脾生血顆粒對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（10）：1582-1585.

[10] 李春福，張學(xué)瓊，翟麗，等.健脾生血片益氣生血的作用機制研究[J].中國藥師，2016，19（2）：209-212.

[11] 劉達平.兩種鐵補充劑的藥理研究[J].今日藥學(xué)，2009，19（1）：19-20.

Study on the Toxicity of Jianpi Shengxue Granule on Perinatal Rats

ZHAO Gang1，2，QU Wen3，XIAO Fei1，GUO Xiaojuan1，YANG Yanxia1，ZHANG Yonghui2，HUANG Zhijun1（1.Academy of Pediatric Drugs，Jianm in Pharmaceutical Group，Wuhan 430052，China；2.School of Pharmacy，Tongji Medical College，Huazhong University of Science&Technology，Wuhan 430030，China；3.Center of Food and Drug Safety Evaluation in Hubei Province，Wuhan 430073，China）

OBJECTIVE：To investigate the toxicity effect of Jianpi shengxue granule on perinatal rats.METHODS：Based on body mass，pregnant rats were random ly divided into negative control group and Jianpi shengxue granule low-dose，medium-dose，high-dose groups（0.77，2.31，6.93 g/kg），21 in each group，and intragastrically given relevantmedicines from the 15th d of pregnancy until 21st d after delivery，once a day.Effects of Jianpi shengxue granule on general toxicity and fertility of maternal rats were observed，aswell as the effects on athletic ability，learning and memory ability，fertility of F1 offspring and early viability of F2 offspring.RESULTS：In terms of toxicity effect on maternal rats，compared w ith control group，the days of pregnancy in Jianpi shengxue granule high-dose group was significantly prolonged（P＜0.05），initial body mass of administration was significantly reduced（P＜0.01）.In terms of toxicity effect on offspring，compared w ith negative control group，the initial body mass of F1 offspring in Jianpi shengxue granule high-dose group was significantly reduced（P＜0.05），the time of 4th and 5th time for founding underwater platform was significantly shortened（P＜0.01），and therewas no obvious effect on fertility of F1 offspring and early viability of F2 offspring（P＞0.05）；there was no obvious effect on the indexes of offspring in Jianpi shengxue granule mediumdose，low-dose groups.CONCLUSIONS：The no toxic dose of Jianpi shengxue granule inmaternal and offspring rats is 2.31 g/kg.

Jianpi shengxue granule；Perinatal rat；Toxicity；Offspring rats；Fertility；Viability

R992

A

1001-0408（2017）16-2190-04

2016-11-01

2017-01-24）

（編輯：林 靜）

武漢市漢陽區(qū)“漢陽英才計劃”項目（No.A3-17）

＊高級工程師，博士。研究方向：藥理學(xué)、毒理學(xué)。電話：027-84523889。E-mail：zhaogangsna@126.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：藥理學(xué)。電話：027-84523889。E-mail：452354589@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.08