丹參酮膠囊對(duì)大鼠同種異體肝移植后缺血再灌注肝損傷的防護(hù)作用*

秦雪琴徐 航吳文琴雷尚芳陳 悅

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）感染科 （湖北 十堰，442000） 2.十堰市太和醫(yī)院急診科

丹參酮膠囊對(duì)大鼠同種異體肝移植后缺血再灌注肝損傷的防護(hù)作用*

秦雪琴1徐 航1吳文琴2△雷尚芳1陳 悅1

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）感染科 （湖北 十堰，442000） 2.十堰市太和醫(yī)院急診科

目的：研究丹參酮膠囊對(duì)大鼠同種異體肝臟移植后P450亞型酶及肝功能的影響，分析術(shù)后缺血再灌注肝損傷的防護(hù)機(jī)制。方法：SD大鼠64只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、丹參酮膠囊小、大劑量組，除對(duì)照組外其余3組大鼠均采用改良雙袖套法建立大鼠同種異體肝移植模型，丹參酮膠囊小、大劑量組大鼠分別用1%和2%丹參酮膠囊溶液灌胃3W，對(duì)照組及模型組大鼠灌等體積生理鹽水。3W后取靜脈血檢測(cè)大鼠肝功能五項(xiàng)、血清總超氧化物歧化酶（T-SOD）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）水平；取大鼠肝臟檢測(cè)肝微粒體P450亞型酶活性。結(jié)果：丹參酮膠囊小、大劑量組大鼠T-SOD明顯提高、CYP2E1、CYP2C9酶活性、IL-6、PGE2及r-GT、TBA、TBil明顯下降，存活率分別達(dá)56.25%及62.5%，與模型組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：丹參酮膠囊可提高同種異體大鼠肝臟移植術(shù)后T-SOD活性，促進(jìn)氧自由基清除酶清除氧自由基、降低炎癥因子IL-6、PGE2刺激機(jī)體造成的炎癥反應(yīng)，并通過抑制P450亞型酶活性來減輕藥物代謝時(shí)對(duì)肝臟的毒性，其活血化瘀的藥理特性可增加移植肝臟組織供氧，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，提高肝臟移植存活率。

丹參酮膠囊；同種異體肝移植；P450亞型酶；肝功能；防護(hù)作用

我們用丹參酮膠囊配制成1%和4%的溶液灌胃，觀察其對(duì)同種異體大鼠肝臟移植術(shù)后P450亞型酶及肝功能的影響，分析術(shù)后藥物干預(yù)缺血再灌注肝損傷的防護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SD大鼠64只，6～8周齡，雄性，體重180～200g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為SCXK（京）2005-0013。按隨機(jī)原則分為對(duì)照組、模型組、丹參酮膠囊小、大劑量組，每組16只。

1.2 儀器及藥品 Thmorgan LC2000R型高速冷凍離心機(jī)（北京托摩根生物科技有限公司閣）；島津Shimadzu LC-15C型高效液相色譜儀（蘇州島津，產(chǎn)品）；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器（常州國華振蕩器生產(chǎn)）；丹參酮膠囊（河北興隆希力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.25g／粒，批號(hào)：30Z00211）。

1.3 大鼠同種異體肝移植術(shù)及治療方法 采用改良雙袖套法，手術(shù)時(shí)采用“2回折、3結(jié)扎、4貫通”的方法制備同種異體肝移植動(dòng)物模型［1］。造模前分別取各組受體和供體8只大鼠同時(shí)手術(shù)（每組合計(jì)16只），目的是節(jié)約動(dòng)物，這符合減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理要求［2］。術(shù)前供、受體大鼠均自由飲水，禁食，配對(duì)大鼠體質(zhì)量應(yīng)相差≤20g。于術(shù)前20min肌肉注射阿托品0.04mg，3%戊巴比妥鈉0.1ml／100g腹腔注射麻醉，剃去腹部毛發(fā)，碘伏消毒，腹部向上仰臥位固定于大鼠固定器，打開腹腔（供體、受體手術(shù)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行），將受、供體大鼠肝臟各取1／2進(jìn)行交叉植入配對(duì)動(dòng)物，吻合植入肝臟血管，分層縫合腹腔，碘伏消毒創(chuàng)口1w（1次／d），對(duì)照組大鼠不手術(shù)僅作為空白對(duì)照。術(shù)后參照人與動(dòng)物體表面積換算公式［3］，將丹參酮膠囊配制成1%和4%的溶液備用，大鼠用藥劑量（mg／kg）＝w（人與兔體表面積換算系數(shù)）×A（人用藥劑量）。經(jīng)以上公式計(jì)算，丹參酮膠囊小、大劑量組大鼠分別用1%和2%丹參酮膠囊溶液1m l· kg－1·d－1（即2.5mg·kg－1·d－1、5mg·kg－1·d－1）灌胃；對(duì)照組及模型組大鼠灌等體積生理鹽水，均灌胃3w。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)［4］，眶靜脈取大鼠靜脈血0.5mL，編號(hào)檢測(cè)肝功能［包括：血清總膽汁酸（TBA）、r-谷氨酰軟肽酶（r-GT）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清總膽紅素（TBil）等5項(xiàng)］。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靜脈血T-SOD、IL-6、PGE2水平。取血后斷頭處死大鼠，并給肝組織編號(hào)置于-4℃冰箱，制備大鼠肝微粒體時(shí)用高速冷凍離心機(jī)，差速離心法制備肝微粒體混合液。方法：用500μL加樣器取勻漿緩沖液加入肝微粒體混合液中，4℃下5000轉(zhuǎn)離心30min，勻漿30min后將離心管中沉淀組織重懸于0.25 mol·L的蔗糖溶液中，用500μL加樣器吸取100μL上述勻漿混合液（肝微粒體），-80℃冰箱暫存以備檢測(cè)大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶。檢測(cè)將上述肝微粒體勻漿混合液用SHZ-82A水浴恒溫振蕩器37℃先孵育30min，然后再振蕩30min，再用型高速冷凍離心機(jī)離心20min，取試管中上清液，用高效液相色譜儀進(jìn)樣，檢測(cè)4組大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶（包括CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9）的活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，肝功能、血清T-SOD、IL-6、PGE2及細(xì)胞色素P450亞型酶等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能檢測(cè)情況 見表1。

表1 各組大鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

表1 各組大鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

與對(duì)照組比較△P＜0.05；與模型組比較▲＜0.05

對(duì)照組16 10.30± 0.50）31.58± 4.57 91.37± 8.57 137.39± 10.56 34.57± 3.32模型組4 29.23± 2.05△90.07± 8.97△254.23± 24.20△404.32± 32.92△97.87± 10.61△丹參酮膠囊小劑量組9 19.78± 1.10▲49.74± 3.13▲132.74± 13.15▲245.72± 21.11▲65.01± 7.44▲丹參酮膠囊大劑量組10 18.92± 1.37▲42.32± 3.62▲129.32± 12.31▲219.21± 18.72▲64.79± 7.38▲

2.2 各組大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 各組大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2結(jié)果比較 （±s）

表2 各組大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2結(jié)果比較 （±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別n T-SOD（μmol／L）PGE2（U／L）IL-6（U／L）對(duì)照組16 111.37±10.53 5.58±0.27 9.37±0.53模型組4 34.23±2.20△27.07±2.90△154.23±14.25△丹參酮膠囊小劑量組9 59.74±4.11▲19.72±3.78▲102.74±10.11▲丹參酮膠囊大劑量組10 62.32±5.39▲17.329±3.61▲97.32±10.39▲

2.3 各組大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶活性檢測(cè)情況 見表3。

表3 各組大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶活性比較 （±s，nmoL／mL）

表3 各組大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶活性比較 （±s，nmoL／mL）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別n CYPIA2 CYP2E1 CYP2C9 CYP3A4 CYP2D6對(duì)照組16 1.79± 0.27 1.59± 0.21 4.49± 0.15 2.58± 0.21 2.12± 0.25模型組4 5.34± 0.59△3.95± 0.27△7.17± 0.43△9.90± 0.47△4.58± 0.37丹參酮膠囊小劑量組9 4.87± 0.31 2.49± 0.21▲5.41± 0.41▲8.98± 0.51 4.07± 0.28丹參酮膠囊大劑量組10 4.73± 0.43 2.12± 0.23▲5.09± 0.67▲9.12± 0.54 4.18± 0.29

2.4 各組大鼠存活及一般情況 見表4。對(duì)照組大鼠反應(yīng)敏捷，體毛光澤，飲食正常，無動(dòng)物死亡。模型組大鼠存活4只，存活率25%，存活大鼠卷縮，拒絕活動(dòng)，體重明顯降低，精神極差，無添足添毛等自潔行為，偶有攝食、少量飲水。丹參酮膠囊小、大劑量組分別有9、10只大鼠存活，存活率56.25%和62.5%，存活率明顯高于模型組。存活大鼠動(dòng)物自潔行為、攝食、飲水及體重明顯優(yōu)于模型組。

表4 各組大鼠存活及體質(zhì)量比較（±s）

表4 各組大鼠存活及體質(zhì)量比較（±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別存活例數(shù)（只）存活率（%）體質(zhì)量（g ）對(duì)照組16 100 207.49±17.15模型組4 25△125.38±10.27△丹參酮膠囊小劑量組9 56.25▲149.42±9.21▲丹參酮膠囊大劑量組10 62.25▲145.12±10.23▲

3 討論

血清T-SOD可促進(jìn)氧自由基的清除，清除氧自由基、降低炎癥因子IL-6、PGE2刺激機(jī)體造成的炎癥反應(yīng)。PGE2是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子，是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物，PGE2過多分泌是造成炎癥反應(yīng)的重要因素。細(xì)胞色素P450亞型酶包括CYPIA2、CYP2E1、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6等多種亞型，是藥代謝的主要水解酶，藥物吸收后90%均經(jīng)過細(xì)胞色素P450亞型酶代謝分解，P450活性增強(qiáng)常導(dǎo)致藥物代謝加快、藥物活性降低或失效而影響治療作用［5］。任何抑制與誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450亞型酶活性的藥物均會(huì)影響藥物療效。肝功能五項(xiàng)可客觀反應(yīng)肝功能，因此，我們采用P450亞型酶、PGE2、T-SOD及肝功能五項(xiàng)等指標(biāo)評(píng)定丹參酮膠囊對(duì)大鼠同種異體肝臟移植的影響。

由于CYP2C9和CYP2E1酶與藥物代謝及相互作用密切相關(guān)［6］，CYP2C9和CYP2E1酶降低有利于藥物的代謝，減少不良反應(yīng)、增加療效，對(duì)缺血再灌注肝臟具有防護(hù)作用［7，8］。本實(shí)驗(yàn)中，丹參酮膠囊通過抑制CYP2C9和CYP2E1酶活性，降低代謝產(chǎn)物毒性，增加療效。機(jī)體在代謝正常的狀態(tài)時(shí)，氧自由基生成與清除保持在動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)組織由于缺血，再灌注時(shí)，T-SOD活性急劇下降，大量氧自由基產(chǎn)生，這些氧自由基會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，肝臟移植后隨著血管吻合后血液再通會(huì)造成嚴(yán)重的缺血＼再灌注損傷，多項(xiàng)觀察指標(biāo)異常升高，這在模型組中得以證實(shí)。而丹參酮膠囊小、大劑量組大鼠在治療3W后T-SOD酶的活性明顯提高，IL-6和PGE2炎癥因子的釋放明顯降低，提示丹參酮膠囊確有肝臟術(shù)后缺血＼再灌注損傷防護(hù)作用，這與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致［9，10］。TSOD酶活性提高的作用機(jī)制有可能與降低細(xì)胞內(nèi)H-ATP酶水解活性、同時(shí)增加H-ATP酶合成，阻止黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶的轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝，減少自由基的產(chǎn)生有關(guān)［11］。腺苷蛋氨酸由機(jī)體ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸環(huán)化酶的作用下生成，當(dāng)機(jī)體在缺血或其他病理改變時(shí)，腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基功能受限，質(zhì)膜磷脂甲基化降低，肝臟細(xì)胞膜流動(dòng)性和Na-K＋-ATP酶的泵功能均會(huì)下降，這會(huì)造成肝功能5項(xiàng)指標(biāo)均升高，肝臟解毒功能降低或喪失［12，13］。結(jié)果還說明丹參酮膠囊具有促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用，這可能丹參酮具有增加組織分泌腺苷蛋氨酸，增強(qiáng)Na-K＋-ATP酶泵功能，調(diào)節(jié)Na-H的交換，促進(jìn)質(zhì)膜磷脂甲基化，抑制肝細(xì)胞Na-Ca2＋鈣交換，阻止肝組織間液Ca2＋內(nèi)流造成的鈣超載，改善肝細(xì)胞能量代謝有關(guān)［14］。同時(shí)，丹參酮還可肝臟的微循環(huán)，增加缺血肝臟供氧，減輕IL-6和PGE2炎癥因子對(duì)血管壁炎癥刺激，而對(duì)缺血＼再灌注損傷而起到防護(hù)作用。

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The protective effect of Salvia m iltiorrhiza Capsule on ischem ia reperfusion injury after liver transplantation in rats

QIN Xue-qin1，XU Hang1，WUWen-qin2，etal.1.Departmentof infectious disease，Shiyan Taihe Hospital（Affiliated Hospitalof HubeiMedical College）（Shiyan Hubei，442000）China.

Objective：To study the effects of Salviamiltiorrhiza Capsule on ischemia reperfusion injury after liver transplantation in rats and to analyze its protectivemechanism.Methods：64 male SD rats were randomly divided into control group，model group，tanshinone capsule low and high dose group，except the control group were treated with modified double cuffmethod to establish rat orthotopic liver transplantation model，tanshinone capsule low and high dose group were used 1%and 2%of tanshinone capsule solution by gavage for 3 weeks（W），control group and model group were given equal volume of saline.After 3 W，liver function，serum total superoxide dismutase（TSOD），interleukin-6（IL-6），prostaglandin E2（PGE2）level and livermicrosomal P450 subunit activity were detected in the rat liver.Results：compared with themodel group，The T-SOD in tanshinone capsule low，high dose group increased significantly；CYP2E1，CYP2C9 enzyme activity，IL-6，PGE2，GGT，total bile acid（TBA），STB decreased significantly，the survival rate were 56.25%and 62.5%，respectively，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Tanshinone capsule could increase the T-SOD activity after allograft orthotopic liver transplantation in rats，promote oxygen free radical scavenging enzyme oxygen free radical removal，reduce inflammatory cytokines IL-6 and PGE2 stimulated body.

Salviamiltiorrhiza Capsule；liver transplantation；P450 subtype；liver function；protective

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.012

湖北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)西醫(yī)類重點(diǎn)項(xiàng)目（No.WJ2015MB224）；△通信作者，E-mail：fenyanqin163163＠126.com

2016－11－19 編輯：肖明中）