固相萃取-HPLC法測定辣椒油中偶氮染料

邢燕，高慧，劉玉棟，王勤

（1.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026；2.淄博市科學(xué)技術(shù)情報研究所，山東淄博255025）

固相萃取-HPLC法測定辣椒油中偶氮染料

邢燕1，高慧1，劉玉棟2，王勤1

（1.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026；2.淄博市科學(xué)技術(shù)情報研究所，山東淄博255025）

建立一種基于大孔吸附樹脂柱對辣椒油中蘇丹紅I-IV、蘇丹紅7B和對位紅等6種偶氮染料進(jìn)行的前處理方法。辣椒油樣品經(jīng)正己烷稀釋，用自制大孔吸附樹脂柱凈化，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測，自制固相萃取柱經(jīng)再生過程可重復(fù)使用。結(jié)果顯示，6種染料在0.05 μg/mL～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高于0.999 8，在3個加標(biāo)濃度下，日內(nèi)和日間的加標(biāo)回收率在90.9%～104.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.7%。

偶氮染料；辣椒油；固相萃?。灰合嗌V；大孔吸附樹脂

近年來，非法添加和濫用合成染料已成為食品安全領(lǐng)域的主要隱患。偶氮類染料是印染工藝中應(yīng)用最廣泛的一類合成染料，由于其色澤鮮艷、著色穩(wěn)定、價格低廉，近年來常被非法添加到食品中作為著色劑使用。由于偶氮類染料能分解產(chǎn)生致癌芳香胺，經(jīng)過活化作用改變?nèi)梭w的DNA結(jié)構(gòu)引起機(jī)體病變和誘發(fā)癌癥，我國、美國和歐盟等國家嚴(yán)禁在食品中使用該類染料[1]。但利益驅(qū)使下仍有不法廠商在辣椒等食品中非法添加，因此加強(qiáng)對食品中偶氮類著色劑的檢測十分必要。

目前偶氮類染料檢測的預(yù)處理方法多是固相萃取[2-4]、液液萃取[5-7]、凝膠滲透色譜[8-9]、分子印跡固相萃取[10-12]、基質(zhì)固相分散萃取[13-15]等方法。因固相萃取技術(shù)節(jié)省溶劑、操作簡單，成本低廉，回收率高，目前已成為最受歡迎的樣品前處理方法[16]，而固相萃取吸附劑的選擇是決定其富集效率最重要的因素之一。GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的測定方法高效液相色譜法》中使用氧化鋁固相萃取柱對樣品進(jìn)行了凈化，并且僅針對食品中的蘇丹紅I-IV。大孔吸附樹脂具有獨(dú)特的吸附性能，具有機(jī)械強(qiáng)度高、耐酸堿、易于再生等特點(diǎn)。它被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離與提純，關(guān)于它的使用作為固相萃取吸附劑的研究較少。楊文翰等用大孔吸附樹脂作為固相吸附劑，對食品中天然色素梔子黃進(jìn)行測定，可重復(fù)使用10次以上[17]，大孔樹脂固相萃取柱的最大優(yōu)勢是再生性[18]。本文選用大孔吸附樹脂作為固相吸附劑，建立了一種基于大孔吸附樹脂固相萃取柱的前處理方法，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測辣椒油中蘇丹紅I-IV、蘇丹紅7B和對位紅6種偶氮類染料，對試驗條件，如洗脫溶劑，固相萃取柱再生次數(shù)，方法的檢測限和適用性等進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695/2998系列高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器：美國Waters；N-EVAPTM 112型氮吹濃縮儀：美國Organomation公司；12位SPE固相萃取儀：美國Supelco公司。

甲醇、乙腈（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷、環(huán)己烷（農(nóng)殘級）：迪馬科技；甲酸（分析純）：天津巴斯夫化學(xué)公司；蘇丹紅I-IV標(biāo)準(zhǔn)品（純度均為90%）：西格瑪–奧德里奇；蘇丹紅7B（純度為89%）、對位紅（純度為98%）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司。6 mL SPE柱管（PP）、篩板（PE）：上海安譜實驗科技股份有限公司；大孔吸附樹脂（LX-68）：西安藍(lán)曉科技有限公司。

1.2 色譜條件

Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6mm，5 μm）。流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液，（95∶5，體積比）；柱溫 30℃，流速 1 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。對位紅，蘇丹紅I、II的檢測波長為510 nm；蘇丹III、蘇丹紅7B和蘇丹IV的檢測波長為480 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅7B和對位紅各10.0 mg（按實際含量折算），用乙酸乙酯溶解后用乙腈分別定容至100 mL，蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅7B和對位紅的濃度為100 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)系列：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液 0、5、10、50、100 μL，用乙腈定容至 10 mL，此標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為 0、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL。

1.4 大孔樹脂固相萃取柱的制備及再生

3 g的LX-68大孔樹脂（相當(dāng)于1.8 g干樹脂）添加到6 mL SPE柱管（底部預(yù)先放置一塊篩板），上端用微孔篩板固定。

使用過的固相萃取柱用10 mL乙醇去除殘留二氯甲烷，然后用10 mL的水除去乙醇。用5 mL 5%鹽酸洗滌，用水洗至中性，再用5 mL 5%氫氧化鈉洗滌，重新用水洗至中性，固相萃取柱進(jìn)行再生完成。

1.5 樣品預(yù)處理

稱取0.2g辣椒油于1.5 mL的離心管中，加入1 mL正己烷稀釋樣品，以備過柱。用5 mL 1%甲酸-甲醇活化固相萃取柱，上樣后用4 mL正己烷淋洗，除去油中的脂肪等雜質(zhì)，用8 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯抵两?。?.5 mL乙酸乙酯溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后經(jīng)HPLC分析。此外，在整個凈化過程中，溶劑流速保持在約1 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察了不同流動相對偶氮染料的分離行為，包括甲醇，乙腈和不同比例的乙腈-乙酸水溶液。在相同的檢測波長下，染料在乙腈流動相中的峰面積大于甲醇流動相，目標(biāo)物的保留時間也縮短。當(dāng)流動相為乙腈-1%甲酸水溶液（95∶5，體積比）時，目標(biāo)分析物可以達(dá)到基線分離。1 μg/mL的6種偶氮染料標(biāo)準(zhǔn)的HPLC色譜圖如圖1（A）所示。圖1（B）為加標(biāo)辣椒油樣品的色譜圖。在試驗條件下，染料的峰形良好，并且能達(dá)到基線分離。

圖1 6種偶氮染料的HPLC色譜圖1.0 μg/mL（A）；加標(biāo)辣椒油樣品的HPLC色譜圖（B）Fig.1 HPLC chromatograms of 6 kinds azo dyes standards 1.0 μg/mL（A）；Sample spiked with azo dyes standards（B）

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

試驗對LX-68大孔吸附樹脂柱的活化溶劑、淋洗溶劑、洗脫溶劑和洗脫溶劑體積等條件進(jìn)行了優(yōu)化，用于優(yōu)化試驗的樣品為0.4 μg/mL的加標(biāo)辣椒油樣品，樣品取樣質(zhì)量為0.2 g。

測定了甲醇、0.5%甲酸-甲醇、1%甲酸-甲醇和2%甲酸-甲醇作為活化溶劑時，大孔吸附樹脂柱對6種染料的回收效果，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，1%甲酸-甲醇作為淋洗液時偶氮染料的回收率最高。

為了獲得可靠、重復(fù)性高的結(jié)果，除雜是固相萃取中的一個關(guān)鍵因素。樣品加到固相萃取柱上以后，需要用合適的溶劑洗滌除去脂肪和極性較小的類胡蘿卜素等雜質(zhì)，這樣可以保證得到干凈無干擾的色譜圖，并且使洗脫液可以氮吹至近干，試驗驗證了正己烷、乙酸乙酯、甲醇的除雜效果，發(fā)現(xiàn)正己烷的除雜效果最好，且不影響偶氮染料的回收率。試驗考察不同極性溶劑（甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷）對偶氮染料的洗脫效果，不同洗脫溶劑對辣椒油樣品加標(biāo)回收率的影響如圖3所示。

圖2 不同活化溶劑對染料回收率的影響Fig.2 Effects of different pre-elution solvents on the recoveries of azo dyes

圖3 不同洗脫溶劑對染料回收率的影響Fig.3 Effects of different eluent solvents on the recoveries of azo dyes

圖3中試驗數(shù)據(jù)表明二氯甲烷進(jìn)行回收率比較高，用8 mL二氯甲烷作為洗脫溶劑可以使目標(biāo)化合物得到滿意的回收率。

2.3 回收率、精密度

在最佳試驗條件下，6種染料在0.05 μg/mL～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高于0.999 8，試驗數(shù)據(jù)見表1。定量限（LOQ）以10倍信噪比計算，在0.008 mg/kg～0.023 mg/kg之間（按取樣量0.2 g計算），結(jié)果一同列于表1中。對辣椒油中6種染料進(jìn)行高、中、低3個濃度的加標(biāo)提取試驗，加標(biāo)濃度為0.05、0.25、0.40 mg/kg，用外標(biāo)法定量。每個加標(biāo)水平做6組平行試驗，次日重復(fù)加標(biāo)樣品試驗，試驗結(jié)果列于表2中。在不同的加標(biāo)濃度下，日內(nèi)和日間的加標(biāo)回收率在90.9%～104.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.7%，用大孔吸附樹脂柱萃取辣椒油中偶氮染料方法準(zhǔn)確可靠。加標(biāo)樣品的回收率和精密度見表2。

表1 6種偶氮染料的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression parameters of 6 kinds of azodyes

表2 加標(biāo)樣品的回收率和精密度Table 2 Analytical parameters for assessing the feasibility of the method

2.4 大孔吸附樹脂柱的再生次數(shù)

大孔吸附樹脂柱的再生按照1.4的方法，使用加標(biāo)辣椒油樣品（0.40 mg/kg添加水平）檢測再生后樹脂柱的萃取效果，同時做3個平行試驗，再生次數(shù)為5次。大孔吸附樹脂柱再生后對加標(biāo)樣品中偶氮染料的回收率見圖4。

圖4 大孔吸附樹脂柱再生后對加標(biāo)樣品的萃取效果Fig.4 The extract effectiveness of regeneration macroporous resin for spiking sample

從圖4可以看出，再生樹脂與新樹脂具有相同的吸附、洗脫性能。因此，大孔樹脂固相萃取柱可以通過再生步驟重復(fù)使用至少5次。

3 結(jié)論

將自制的大孔吸附樹脂柱成功應(yīng)用于辣椒油中偶氮染料的檢測，提供了一個非常簡單，快速，靈敏和環(huán)保的前處理方法。辣椒油樣品經(jīng)正己烷稀釋，用自制大孔吸附樹脂柱凈化，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，6種染料在0.05 μg/mL～1.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高于0.999 8，在不同的加標(biāo)濃度下，日內(nèi)和日間的加標(biāo)回收率在90.9%～104.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.7%，用大孔吸附樹脂柱萃取辣椒油中偶氮染料方法準(zhǔn)確可靠。

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Determination of Azo Dyes in Chilli Oil by SPE Coupled with HPLC

XING Yan1，GAO Hui1，LIU Yu-dong2，WANG Qin1
（1.Zibo Municipal Center for Disease Control and Prevention，Zibo 255026，Shandong，China；2.Science and Technology Information Research Institute，Zibo 255025，Shandong，China）

An innovative pretreatment method for 6 kinds of azo dyes，such as Sudan I-IV，Sudan 7B，Para red，in chilli oil based on homemade macroporous resin solid-phase extraction（SPE）cartridge was established.The chilli oil samples were diluted by n-hexane and purified by a self-made macroporous resin cartridge，determined by high performance liquid chromatography（HPLC）coupled with diode array detector（DAD）.The homemade SPE cartridge simplified the preparation procedure of samples and could be reused by regeneration steps.Results showed that the recoveries of 6 azo dyes added to the chilli products had a good linear in the rang from 0.05 μg/mL-1.0 μg/mL.The correlation coefficients were more than 0.999 8 for all experimental batches.Under three spiking levels，the recovery rates of intra-day and inter-day were ranged from 90.9%to 104.3%，and the relative standard deviations（RSDs）were lower than 3.7%.

azo dyes；chilli oil；solid-phase extraction；HPLC；macroporous resin

2016-07-26

山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2015PH035）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2013WS0028）；浙江省科技廳分析測試項目（2015C37009）

邢燕（1982—），女（漢），主管技師，博士，從事食品、環(huán)境中有機(jī)污染物檢測研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.029