清肺利氣通絡(luò)法中藥對(duì)哮喘模型大鼠肺組織白介素17表達(dá)的影響

趙久齡+王玉水+王欣

摘要：目的探討清肺利氣通絡(luò)法中藥對(duì)卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠肺組織白介素17（IL-17）表達(dá)的影響。方法40只雄性SD鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組，每組10 只。空白組不給予任何處理，其余3組動(dòng)物均以O(shè)VA致敏和激發(fā)方案建立哮喘模型。模型組僅造模，不給予任何其他藥物處理；布地奈德組在每次霧化激發(fā)前1h給予布地奈德混懸液霧化吸入15min；清肺利氣通絡(luò)組在每次霧化激發(fā)前分別給予清肺利氣通絡(luò)顆粒灌胃。末次激發(fā)4 h后處死大鼠，取肺組織進(jìn)行病理切片，HE染色觀察肺組織病理形態(tài)及免疫組化檢測(cè)IL-17的表達(dá)。結(jié)果HE染色鏡下顯示：與模型組比較，布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組的肺組織病理形態(tài)均有減輕。模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)組大鼠肺組織中IL-17平均光密度（OD）值均較空白組顯著增高（P<0.01）；布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值較模型組顯著降低（P<0.01）；布地奈德組與清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論以清肺利氣通絡(luò)法組方的清肺利氣通絡(luò)顆?？梢酝ㄟ^減輕哮喘大鼠肺組織IL-17的表達(dá)，改善肺組織病理形態(tài)，具有較好的效果，值得進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：支氣管哮喘；清肺利氣通絡(luò)；白介素17；中藥

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）06-0018-05

【Abstract】Objective： To study the effect of Qingfei Liqi Tongluo （QLT） method on the expression of interleukin-17 in lung tissue of asthmatic rats induced by ovalbumin （OVA）. Methods： 40 male SD rats were randomly divided into a blank group， a model group， a budesonide group and a QLT granule group， 10 rats per group. The blank group was not treated with any drug and the other three groups of the rats were induced by OVA to sensitization and stimulation to establish asthma models. The model group was only modeled with no other drug. The budesonide group was given inhalation of budesonide suspension for 15 min at 1 hour after each atomization. The QLT group was administrated with QLT granule before each atomization. The rats were sacrificed 4 hours later at the last stimulation， and their lung tissue was taken for pathological sections. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining and the expression of IL-17 was detected by immunohistochemistry. Results： Compared with the model group， the histopathological changes of the lung tissue in the budesonide group and QLT granule group decreased under HE staining. The mean optical density （OD） of IL-17 in the model group， budesonide group and QLT group were significantly higher than those in blank group （P<0.01）. But the mean OD value of IL-17 in the lung tissue of the budesonide group and QLT granule group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）. There was no statistically significant difference （P>0.05） in the mean OD of IL-17 in the lung tissue of the rats between the budesonide group and QLT granule group. Conclusion： QLT granule can ruduce the expression of IL-17 in lung tissue of asthmatic rats and improve the pathological morphology of lung tissue， worthy of further study.

【Key words】bronchial asthma， Qingfei Qi Tongluo， interleukin 17， traditional Chinese medicine

哮喘，即支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，臨床上以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為主要表現(xiàn)[1-2]。兒童哮喘的發(fā)病率逐年增高，且易反復(fù)發(fā)作。臨床治療需要長(zhǎng)期規(guī)范吸入糖皮質(zhì)激素和支氣管擴(kuò)張劑以及口服白三烯受體拮抗劑等，嚴(yán)重者甚至需要使用全身激素，影響兒童的身體和心理健康，也給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[3-4]。

哮喘的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，尚有許多機(jī)制仍不是很清楚。目前國(guó)內(nèi)外研究表明：哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床患者的血清、肺泡灌洗液、痰液和肺組織中白介素17（IL-17）均可有不同程度的升高，提示IL-17在哮喘的發(fā)病中起到重要作用[5-8]。中醫(yī)藥治療哮喘取得了較多新的進(jìn)展，筆者長(zhǎng)期應(yīng)用清肺利氣通絡(luò)法治療兒童哮喘，取得了滿意的療效。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，建立卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠模型，評(píng)價(jià)以清肺利氣通絡(luò)法組方的清肺利氣通絡(luò)顆粒對(duì)哮喘大鼠肺組織IL-17表達(dá)的影響。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康6周齡雄性SD大鼠40只，體重180～220 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（軍）-2009-003，飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥物實(shí)驗(yàn)用清肺利氣通絡(luò)顆粒由炙麻黃、杏仁、生石膏、生甘草、浙貝母、地龍、紫蘇子和葶藶子組成，采用北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥免煎配方顆粒配置而成，實(shí)驗(yàn)前配置成濃度為2 g（生藥）/ml的蒸餾水混懸液；吸入用布地奈德混懸液（澳大利亞AstiaZeneca Pty Ltd.批號(hào)319722）。

1.3試劑材料卵清蛋白（OVA）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)A5503），氫氧化鋁Al（OH）3（分析純）（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2016072092），水合氯醛（上海化學(xué)試劑公司，批號(hào) 20140825），0.9%生理鹽水（天津百特醫(yī)療用品有限公司，批號(hào)C1608017）兔抗大鼠IL-17抗體（美國(guó)AbSci公司，批號(hào) 6909），SP免疫組化染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 999098）及增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào) P4617）。

1.4儀器403E型空氣壓縮式霧化機(jī)（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），CX31 型光學(xué)生物顯微鏡（日本Olympus公司），BW3200S型電子天平及BL-220H型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），ASP200S全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司），EG1150C獨(dú)立冷臺(tái)-分體式石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica 公司），RM2235切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

2方法

2.1分組將40只SPF大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為4組：空白組、模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組，每組均為10只?？瞻捉M不給予任何處理，其余3組動(dòng)物均按照文獻(xiàn)方法[9]，以O(shè)VA致敏和激發(fā)方案建立哮喘模型：造模實(shí)驗(yàn)的第0、7、14 d給予40 mg OVA+2 mg AI（OH）3+1 mL生理鹽水混懸液腹腔注射致敏；第21～27 d，分別將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于1自制長(zhǎng)方體密閉玻璃箱內(nèi)，給予OVA和0.9%生理鹽水配置成的1% OVA 霧化激發(fā)建立哮喘模型，每日霧化1次，每次30 min。模型組僅造模，不給予任何其他藥物處理；布地奈德組在每次霧化激發(fā)前1 h給予布地奈德混懸液霧化吸入15 min；清肺利氣通絡(luò)顆粒組在每次霧化激發(fā)前分別給予清肺利氣通絡(luò)混懸液2 mL灌胃。末次激發(fā)4 h后取材。

2.2取材方法以5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定，開胸取新鮮雙肺組織，將左肺置于10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)方法石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2.3肺組織HE染色大鼠肺組織于10%福爾馬林溶液固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備厚度4 μm的切片，貼片，恒溫箱烘干，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5張切片，然后蘇木素染色、酸水及氨水分色，沖洗、梯度酒精脫水，入酒精伊紅染色，純酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

2.4免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織中IL-17的表達(dá)常規(guī)固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片，貼片，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5張切片，脫蠟、復(fù)水。3% H2O2 20 min抗原修復(fù)，PBS清洗5 min×3，山羊血清封閉30 min，加一抗（以1：100 稀釋的兔抗大鼠IL-17），以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃冰箱保持過夜，PBS清洗5 min×3，加二抗（生物素標(biāo)記的抗兔IgG）于37℃恒溫孵育30 min，PBS清洗5 min×3，加DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行圖像采集，并利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析測(cè)定其光密度值（OD）進(jìn)行比較。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量資料均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用Kolmogorov–Smirnov test分析均屬于正態(tài)分布。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）比較，組間兩兩比較采用Dunnetts t-test。P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1各組大鼠一般表現(xiàn)空白組大鼠無異常表現(xiàn)；模型組動(dòng)物在接受OVA霧化吸入后開始表現(xiàn)為豎毛、煩躁、抓耳撓鼻、呼吸急促，后表現(xiàn)為精神倦怠、蜷縮、腹肌抽搐、甚至有大小便失禁等；布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組上述表現(xiàn)程度均較模型組減輕。

3.2各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變光鏡下觀察肺組織HE染色病理片?？瞻捉M大鼠各級(jí)支氣管無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠支氣管壁周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，皺襞增多，部分肺泡腔增大、破裂、融合。布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織病理形態(tài)改變均較模型組減輕。見圖1。

3.3各組大鼠肺組織IL-17免疫組化比較模型組、布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值均較空白組顯著增高（P=0.000，0.000，0.000均<0.01）；布地奈德組和清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值較模型組顯著降低（P=0.000<0.01）；布地奈德組與清肺利氣通絡(luò)顆粒組大鼠肺組織中IL-17平均OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.547>0.05）。見圖2、表1。

4討論

我國(guó)兒童哮喘已呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)患兒身心健康以及家庭社會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3，4，10]。而哮喘的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，尚不完全明確，目前公認(rèn)與免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌因素和遺傳學(xué)背景等密切相關(guān)。最新的研究表明，除了Th1/Th2失衡在哮喘的發(fā)病中起到重要作用，Th17細(xì)胞分泌的IL-17在哮喘的發(fā)病過程中同樣起到了關(guān)鍵作用[11-12]。IL-17能夠通過某些炎癥因子或趨化因子介導(dǎo)而募集活化的炎癥細(xì)胞于氣道內(nèi)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致哮喘相關(guān)的病理因素增加，進(jìn)而誘發(fā)或加重哮喘[8，11]。實(shí)驗(yàn)研究表明模型組大鼠肺組織IL-17表達(dá)顯著高于空白組，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

根據(jù)全球哮喘防治創(chuàng)議（GINA）及我國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南，哮喘的治療主要依賴于吸入糖皮質(zhì)激素（ICS），如布地奈德、氟替卡松等，并根據(jù)階梯方案適當(dāng)選擇白三烯受體拮抗劑或/和β2受體激動(dòng)劑，嚴(yán)重者需要使用全身激素等[3]。有報(bào)道哮喘兒童ICS治療易引起口腔菌群失調(diào)，治療的前1～2年可能減緩生長(zhǎng)速度，且家長(zhǎng)對(duì)于長(zhǎng)期吸入激素的心理壓力，往往造成治療依從性下降，導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作[3，13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的發(fā)作，是由于內(nèi)有伏痰，感受外邪而誘發(fā)。所謂外邪侵入肺經(jīng)，肺失宣肅，肺氣閉阻，引動(dòng)伏痰，痰凝氣道，氣機(jī)升降不利，而致喘息、呼吸困難、喉間痰鳴，發(fā)為哮喘[14]。筆者認(rèn)為肺絡(luò)是由肺經(jīng)分出后，又逐層分級(jí)，形成由別絡(luò)至孫絡(luò)的布散于肺組織的各級(jí)分支組成的一個(gè)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。肺絡(luò)在解剖形態(tài)上與類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的氣管支氣管，在功能上包括了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)意義上的氣管支氣管以及神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的功能[15]。因此，哮喘發(fā)作實(shí)質(zhì)是外邪引動(dòng)伏痰，肺絡(luò)閉阻，氣機(jī)不利而致喘息、痰鳴等證候。在哮喘治療上，運(yùn)用清肺利氣通絡(luò)法組方的清肺利氣通絡(luò)顆粒治療兒童哮喘取得了滿意的臨床療效。其組成主要為炙麻黃、杏仁、生石膏、生甘草、浙貝母、地龍、紫蘇子和葶藶子。方中麻黃辛溫，開肺平喘，解表散邪，有宣肺利氣通絡(luò)之功；杏仁利氣平喘，并與麻黃相使，助麻黃平喘；生石膏味甘、辛，性寒，與麻黃、杏仁合用，寓麻杏甘石湯之意而宣肺泄熱，清肺利氣平喘。此外，方中葶藶子歸肺、膀胱經(jīng)，有瀉肺滌痰、利氣平喘之功；紫蘇子利氣定喘，止嗽消痰；地龍味咸性寒，長(zhǎng)于清熱平肝、熄風(fēng)止痙、平喘、利尿、通絡(luò)除痹，本方之中取其清肺熱、通肺絡(luò)、平氣喘之用，更可增麻黃宣通肺絡(luò)之功；浙貝母苦寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱化痰、利氣止咳、消痰散結(jié)之功，全方合用具有較好的清肺利氣、通絡(luò)平喘的功效。

本研究表明，清肺利氣通絡(luò)顆?？梢酝ㄟ^減輕哮喘大鼠肺組織IL-17的表達(dá)，改善肺組織病理形態(tài)，與布地奈德干預(yù)組比較，無明顯的差異，具有較好的效果，提示清肺利氣通絡(luò)法中藥治療支氣管哮喘具有很好的優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步深入研究。

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