鯉魚(yú)2種脂酰輔酶A脫氫酶基因cDNA克隆、表達(dá)及活性研究

喻文娟，俞菊華，，李紅霞，李建林，唐永凱，于 凡 ，何 楓，傅純潔

(1．南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類(lèi)遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081；3.東?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 東海 222300)

鯉魚(yú)2種脂酰輔酶A脫氫酶基因cDNA克隆、表達(dá)及活性研究

喻文娟1，俞菊華1，2，李紅霞2，李建林2，唐永凱2，于 凡2，何 楓1，傅純潔3

(1．南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類(lèi)遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081；3.東?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 東海 222300)

為探究脂酰輔酶A脫氫酶對(duì)脂肪酸β氧化的調(diào)控機(jī)制，使用RT-PCR 在鯉魚(yú)肝臟克隆了脂酰輔酶A脫氫酶家族中的MCAD和LCAD全長(zhǎng)cDNA序列，閱讀框分別為1 275，1 326 bp，編碼424,441個(gè)氨基酸，分析表明他們均具備ACADs家族的特征序列：FAD結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)、催化位點(diǎn)等，與斑馬魚(yú)MCAD和LCAD的一致性分別為93.16%和94.56%。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明，MCAD和LCAD主要在肝臟和心臟表達(dá)；不同脂肪源對(duì)MCAD的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，但魚(yú)油對(duì)LCAD的表達(dá)有明顯的刺激作用。此外，構(gòu)建了原核表達(dá)載體MCADs-pEASY(E2)和LCADs-pEASY(E2)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了原核表達(dá)蛋白，分子量分別為43.0，43.6 kDa。經(jīng)檢測(cè)這2個(gè)蛋白在370，450 nm處有明顯的吸收峰，表明他們能自然結(jié)合FAD輔基。吩嗪硫酸甲酯反應(yīng)法結(jié)果表明：MCAD和LCAD酶活性最適溫度均為28 ℃，酶活分別為9.12，10.29 U/g。結(jié)果表明，與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，鯉魚(yú)MCAD和LCAD在肝臟和心臟表達(dá)量高；高不飽和脂肪酸對(duì)LCAD的表達(dá)有促進(jìn)作用。

鯉魚(yú)；MCAD；LCAD；克??；原核表達(dá)；酶活性

脂酰輔酶A脫氫酶(Acyl-CoA dehydrogenases，ACADs)是以黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)為輔基的酶，主要參與線粒體脂肪酸、氨基酸等代謝過(guò)程。該酶首先在細(xì)胞核編碼，然后在細(xì)胞質(zhì)中合成比成熟蛋白大2～4 kDa具有前導(dǎo)肽的蛋白質(zhì)前體，并轉(zhuǎn)移到線粒體中，最后通過(guò)蛋白水解過(guò)程將氨基端的前導(dǎo)肽切除而成為成熟的蛋白[1]。脂肪酸的氧化是動(dòng)物、許多原生生物及一些細(xì)菌獲得能量的主要代謝途徑，人體內(nèi)大約30%的能量來(lái)源于脂肪酸的氧化代謝，氧化方式有β氧化、丙酸氧化、α氧化、ω氧化等[2]。在正常生理?xiàng)l件下，線粒體脂肪酸β氧化是脂肪酸氧化的主要的代謝途徑，第一步反應(yīng)由ACADs所催化。ACADs家族成員有11個(gè)亞型，他們的分子量、結(jié)構(gòu)以及分布不同，且各有特性。其中短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Short-chain Acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)、中鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，LCAD)、極長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Very-long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD)和脂酰輔酶A脫氫酶9(9-Acyl-CoA dehydrogenase，ACAD9)是催化各種長(zhǎng)度直鏈脂肪酸β氧化第一步脫氫反應(yīng)的重要酶。對(duì)動(dòng)物或原核生物ACADs的研究發(fā)現(xiàn)，ACADs不僅參與真核生物β氧化過(guò)程，還可作為多種氨基酸(Ile、Leu、Val)的代謝酶類(lèi)，以及催化輔酶A共軛脂肪酸的脫飽和反應(yīng)；此外，在脅迫作用下ACADs基因上調(diào)表達(dá)還可能與細(xì)胞膜的組分調(diào)節(jié)等有關(guān)。人類(lèi)的一些疾病與ACADs的缺乏有關(guān)，常見(jiàn)于急性病變，如急性病毒感染、各種毒素?fù)p傷、代謝障礙和急性的妊娠脂肪肝等；隨著關(guān)于代謝綜合征機(jī)制研究的進(jìn)行，越來(lái)越多的因子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACADs的缺乏與代謝綜合征、肥胖和胰島素抵抗有著密切的關(guān)系。但對(duì)于ACADs的研究國(guó)內(nèi)外剛剛起步，其中以細(xì)胞因子為切入點(diǎn)研究脂代謝紊亂、肥胖、肝臟脂肪變性的關(guān)系已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。

MCAD催化4～12個(gè)碳原子的脂酰輔酶A脫氫，最佳催化底物為8個(gè)碳原子的脂酰輔酶A(C8-CoA)，LCAD催化8～20個(gè)碳原子的脂酰輔酶A脫氫，最佳催化底物為16個(gè)碳原子的脂酰輔酶A(C16-CoA)[3]。研究表明，MCAD和LCAD的缺乏癥會(huì)引起表現(xiàn)為代謝紊亂相似的疾病[4]，且還發(fā)現(xiàn)FAD結(jié)合位點(diǎn)、催化活性和理化性質(zhì)是一致的。MCAD和LCAD基因從肝臟的研究現(xiàn)狀來(lái)看[5]，在基因組成、氨基酸種類(lèi)、酶的活性位點(diǎn)方面具有幾個(gè)明顯的同質(zhì)性，這說(shuō)明MCAD和LCAD在功能上具有一致性。關(guān)于MCAD和LCAD蛋白活性方面的研究，利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，測(cè)量了不同溫度、不同底物分子作用下對(duì)MCAD和LCAD酶活性的影響[6]，結(jié)果表明溫度過(guò)高酶活性下降，在最適底物作用下酶活性最高。MCAD是這些脂酰輔酶脫氫酶中研究最為深入、最具代表性的一個(gè)[7]，直接參與線粒體脂肪酸β-氧化過(guò)程，這表明MCAD是脂肪酸氧化重要的參與和控制者，本試驗(yàn)對(duì)于其研究是具有意義的。此后，關(guān)于MCAD和LCAD多集中于代謝綜合癥，特別是對(duì)缺乏癥的一系列研究。Bala等[8]通過(guò)幾個(gè)案例表明MCAD缺乏時(shí)中鏈?；鈮A或其他代謝產(chǎn)物的積累會(huì)引起心律失常。Yan等[9]對(duì)于LCAD在肝等疾病脂肪酸代謝上報(bào)道一項(xiàng)更新的研究，Hickmann等[10]的研究發(fā)現(xiàn)LCAD缺乏患者細(xì)胞中一元羧酸的蓄積會(huì)破壞肝臟線粒體的能量平衡，他們的研究都在一定程度上解釋了影響患者肝臟病變的原因。Mccoin等[11]對(duì)LCAD有了一項(xiàng)新的研究，利用血液和尿液中的LCAD酶檢測(cè)來(lái)診斷長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化障礙，新的研究結(jié)果表明LCAD酶對(duì)于脂肪酸氧化障礙的確診有關(guān)鍵性的作用，對(duì)臨床運(yùn)用有很大的推動(dòng)力。Rudolf等[12]對(duì)于LCAD中間體的研究發(fā)現(xiàn),可以催化平極霉素和平極素的β氧化為新的天然藥物研發(fā)提供可能性。也有研究顯示線粒體LCAD的缺乏會(huì)導(dǎo)致脂肪酸氧化能力的下降而造成甘油二酯的蓄積和肝臟胰島素抵抗[13]。目前，關(guān)于脂肪酸β氧化方面在人類(lèi)和小鼠的研究中已有一定的基礎(chǔ)而對(duì)于魚(yú)類(lèi)在脂肪酸β氧化方面的研究少有報(bào)道，對(duì)于魚(yú)類(lèi)MCAD和LCAD的克隆有一定的研究，比如羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)、大黃魚(yú)和伯氏樸麗魚(yú)等的cDNA序列都已經(jīng)得到，但是對(duì)于鯉魚(yú)MCAD和LCAD基因克隆、表達(dá)及活性研究未見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，脂肪酸β氧化過(guò)程中ACADs的缺失或突變而引起的脂肪酸氧化代謝紊亂的疾病較多，且脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，不僅可引起生物膜中磷脂所含脂肪酸種類(lèi)的變化，而且還會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。此外，真核生物體內(nèi)器官、組織和細(xì)胞中包含著機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖所需的遺傳信息，但這些遺傳信息并不全都表達(dá)，肝細(xì)胞表達(dá)的基因一般不超過(guò)20%，許多基因處于沉默狀態(tài)；但當(dāng)外界環(huán)境和自身?xiàng)l件發(fā)生改變時(shí)，比如，水溫、水質(zhì)變化，魚(yú)體發(fā)育階段、飼料營(yíng)養(yǎng)變化等，機(jī)體內(nèi)基因表達(dá)情況即會(huì)發(fā)生改變，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)相對(duì)應(yīng)的功能蛋白質(zhì)的量，從而適應(yīng)外界環(huán)境或自身?xiàng)l件的變化。因而脂肪酸氧化過(guò)程中ACADs結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理的研究將有助于相關(guān)疾病的診斷與治療。

因此，本試驗(yàn)以鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)為研究對(duì)象，利用RT-PCR、RACE克隆MCAD和LCAD基因的cDNA序列，并對(duì)MCAD和LCAD基因在不同組織、脂肪源等條件下的表達(dá)情況及溫度對(duì)酶活性影響進(jìn)行了分析，為研究脂肪酸代謝機(jī)理和魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)需要，及由脂肪酸代謝引起的疾病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚(yú) 鯉魚(yú)取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，試驗(yàn)所用魚(yú)為當(dāng)年人工繁殖的同池養(yǎng)殖魚(yú)種，平均體重70 g，體長(zhǎng)10～15 cm。

1.1.2 主要試劑 Total RNA Kit、pMD18-T載體、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、 Competent Cell Preparation Kit、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、TaqDNA聚合酶等購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT Master Mix購(gòu)自O(shè)mega生物技術(shù)公司；pEASY-E2 Expression Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)科技有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Biosharp公司；millipore超濾管購(gòu)自北京利華開(kāi)順貿(mào)易有限公司。C16∶0-CoA、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。

1.1.3 引物 所有引物信息見(jiàn)表1，P1、P2用于擴(kuò)增MCADcDNA序列，P5、P6為構(gòu)建LCAD原核表達(dá)重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物序列；P3、P4用于擴(kuò)增LCADcDNA序列，P7、P8為構(gòu)建LCAD原核表達(dá)重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物序列。所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 使用的引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 根據(jù)OMEGA Total RNA Kit試劑盒說(shuō)明，抽提鯉魚(yú)各個(gè)組織中的Total RNA，以O(shè)ligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2MCAD和LCAD基因編碼區(qū)cDNA序列克隆 使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索已有的斑馬魚(yú)相關(guān)MCAD、LCAD基因序列，在本實(shí)驗(yàn)室已有的鯉魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組中篩選到相關(guān)同源序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物(P1-P2和P5-P6)。20 μL RT反應(yīng)體系中加5 μg肝臟RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，以O(shè)ligo dT為引物進(jìn)行RT擴(kuò)增，合成出cDNA第一條鏈。50 μL PCR反應(yīng)體系中，以RT產(chǎn)物為模板，使用P1、P2和P5、P6進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，再經(jīng)克隆鑒定送至上海博尚生物有限公司進(jìn)行測(cè)序、拼接，最終得到MCAD和LCAD基因完整的cDNA編碼區(qū)序列。

1.2.3 序列分析 采用ExPASy在線工具對(duì)MCAD和LCAD的氨基酸理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；通過(guò)DNAMAN 6軟件分析MCAD和LCAD的核苷酸序列并進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)；使用MEGA 5.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4MCAD和LCADmRNA組織表達(dá) 熒光定量選用SYBR Green作為結(jié)合染料，選用β-actin作為內(nèi)標(biāo)基因，通過(guò)溶解曲線檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。根據(jù)Real-time PCR分析結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析MCAD和LCAD基因在心臟、肝臟、腦、肌肉等組織中的表達(dá)情況。

1.2.5MCAD和LCAD不同脂肪源mRNA組織表達(dá) 以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟中MCAD和LCAD基因的表達(dá)量，選用β-actin作為內(nèi)標(biāo)基因，通過(guò)溶解曲線檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。根據(jù)Real-time PCR分析結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析MCAD和LCAD基因在不同脂肪源鯉魚(yú)肝臟組織中的表達(dá)情況，并用SPSS 13.0軟件及逆行分析。

1.2.6 原核表達(dá)蛋白純化、復(fù)性 試驗(yàn)選用Transetta(DE3)表達(dá)菌株，選用pEASY(E2)表達(dá)載體，構(gòu)建ACADs-pEASY(E2)-Transetta(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)。試驗(yàn)選用100 mL 2YT液體培養(yǎng)基，將擴(kuò)大培養(yǎng)之后菌液轉(zhuǎn)移至2YT中，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度OD600達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加入0.5 mmol/L的IPTG，28 ℃，160 r/min條件下誘導(dǎo)6 h后收集菌體，其中未加IPTG的菌體作為空白對(duì)照。誘導(dǎo)結(jié)束后，從對(duì)照組和試驗(yàn)組各吸取1 mL菌液，離心棄上清，用200 μL 1×PBS緩沖液打散菌體，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻，沸水煮20 min，4 ℃離心10 min，各取上清10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白表達(dá)結(jié)果。剩余菌液經(jīng)4 ℃離心收集后，用1×PBS緩沖液洗滌沉淀2次，加入菌體裂解液，冰上超聲破碎，收集超聲后的液體，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，沉淀加入適量1×PBS緩沖液重懸。分別取200 μL上清和沉淀重懸液200 μL，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻，沸水煮20 min，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白純化采用鎳柱親和層析純化方法，純化的蛋白經(jīng)過(guò)millipore超濾管(10 kDa)超濾之后，取200 μL清液，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻，沸水煮20 min，離心10 min，SDS-PAGE電泳分析。蛋白濃度測(cè)定采用Biosharp公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒方法。

1.2.7MCAD和LCAD活性測(cè)定 25 ℃孵育25 min后，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)為200～600 nm，檢測(cè)FAD輔基的裝載。

酶活力單位：酶活力單位的定義為25 ℃，pH值7.0的條件下，以每分鐘催化1 μmol C18∶0-CoA所需的酶量為1個(gè)活力單位U。蛋白的活性測(cè)試采用吩嗪硫酸甲酯反應(yīng)法[14]，脂酰輔酶A脫氫酶通過(guò)一系列人工電子受體，如與吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)發(fā)生反應(yīng)催化脂肪酸的氧化，而借助中間產(chǎn)物顏色的變化，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)即可定量。反應(yīng)總體積200 μL，加入終濃度為20 mmol/L(pH值7.4)的磷酸緩沖液，1.5 mmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，48 μmol/L 2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)和10 μL蛋白在室溫孵育。然后加入底物C16∶0-CoA，孵育25 min后監(jiān)測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的吸收值變化。以不含酶的體系作為對(duì)照。

分別在20，25，28，30，33 ℃這5個(gè)不同溫度，波長(zhǎng)600 nm條件下孵育25 min后測(cè)定MCAD和LCAD的吸光值，然后計(jì)算酶活，確定最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1MCAD和LCADcDNA序列

MCADcDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)1 275 bp，編碼424個(gè)氨基酸；LCADcDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)1 326 bp，編碼441個(gè)氨基酸。ExPASy在線工具預(yù)測(cè)表明MCAD和LCAD蛋白的等電點(diǎn)分別為8.52和7.63，分子量分別為43.0，43.6 kDa。

2.2 MCAD和LCAD氨基酸序列一致性比較

使用DNAMAN軟件，將MCAD和LCAD氨基酸序列與其他物種的MCAD和LCAD氨基酸序列進(jìn)行同源性比較如圖1，2。MCAD和LCAD氨基酸序列一致性為31.01%。再分別將MCAD和LCAD氨基酸序列與其他物種同種氨基酸序列進(jìn)行一致性比較如表2。表2結(jié)果顯示鯉魚(yú)MCAD與哺乳動(dòng)物人和原鴿的相似性分別為78.62%，82.61%，與斑馬魚(yú)相似性為93.16%，與西洋鮭、短鰭花鳉、羅非魚(yú)、海龜、河豚的相似性分別為86.26%，83.89%，84.43%，79.72%，82.66%。表2結(jié)果顯示鯉魚(yú)LCAD與哺乳動(dòng)物人和原鴿的相似性分別為70.70%，73.09%，與斑馬魚(yú)相似性為94.56%，與西洋鮭、短鰭花鳉、羅非魚(yú)、海龜、河豚的相似性分別為75.91%，71.43%，76.64%，75.29%，72.87%。

表2 基于氨基酸序列鯉魚(yú)MCAD和LCAD與其他物種的MCAD和LCAD的一致性

2.3 基于MCAD和LCAD氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育

根據(jù)分離的MCAD和LCAD氨基酸序列以及在NCBI基因庫(kù)中其他物種的相關(guān)序列，使用MEGA 5.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中選用人LPL(Homosapiens)作為外群，其結(jié)果表明，鯉魚(yú)MCAD和同為鯉形目的斑馬魚(yú)聚為一支，然后與西洋鮭、短鰭花鳉、羅非魚(yú)、伯氏樸麗魚(yú)、河豚、大黃魚(yú)聚為一大支。鯉魚(yú)LCAD和同為鯉形目的斑馬魚(yú)聚為一支，然后與斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一小支，隨后又與伯氏樸麗魚(yú)、羅非魚(yú)、西洋鮭、大黃魚(yú)、河豚聚為一大支。

Cc.鯉魚(yú)；Cg.黑線倉(cāng)鼠；Cl.原鴿；Dr.斑馬魚(yú)； On.羅非魚(yú)； Xm.劍魚(yú)； Om.虹鱒； Mz.斑馬宮麗魚(yú)；Pr.孔雀魚(yú)。 在序列中一致的氨基酸序列用黑色背影表示。正方形.蛋白激酶位點(diǎn)；單橫線.蛋白激酶域；圓形.氨基糖苷憐酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn)；箭頭.酯酰輔酶脫氧酶端； 三角形.酯酰輔酶脫氫酶端；五角星.谷氨酸催化活性位點(diǎn)。

Cc.Cyprinuscarpio；Cg.Cricetulusgriseus；Cl.Columbalivia;Dr.Danioreri；On.Oreochromisniloticus；Xm.Xiphophorusmaculatus；Om.Oncorhynch，usmykiss；Mz.Maylandiazebra；Pr.Poeciliareticulata. Black shading with white letters shows identical amino acid residues in sequences. Square. Protein kinasesite； Single line.Protein kinase domain； Round.Amino sugar flow acid transferase binding sites； Arrow.Ester；Triangles.Acyl coenzyme deoxidizingenzy me ester side acyl coenzyme dehydrogenase；Star.Glutamic acid catalytic activesite.

圖1 鯉魚(yú)MCAD與其他物種MCAD氨基酸序列比對(duì)圖

Fig.1 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence ofCyprinuscarpio(Cc) MCAD with the corresponding sequences from other species

Cc.鯉魚(yú); Hs.人;Gg.雞; Dr.斑馬魚(yú); Ss.西洋鮭; Pm.短鰭花鳉;Xm.劍魚(yú);Ip.斑點(diǎn)叉尾鮰; Sr.犀牛金線鲅。在序列中一致的氨基酸序列用黑色背影表示。正方形.蛋白激酶位點(diǎn);單橫線.蛋白激酶域;圓形.氨基糖苷憐酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn);箭頭.酯酰輔酶脫氧酶端; 三角形.酯酰輔酶脫氫酶端;五角星.谷氨酸催化活性位點(diǎn)。

Cc.Cyprinuscarpio;Hs.Homosapiens;Cg.Cricetulusgriseus;Dr.Danioreri;Ss.Salmosalar;PmPoeciliaMexicana;Xm.Xiphophorusmaculatus;Ip.Ictaluruspunctatus;Sr.Sinocyclocheilusrhinocerous.Black shading with white letters shows identical amino acid residues in sequences. Square. Proteinkinasesite; Singleline.Proteinkinasedomain; Round.Aminosugarflowacidtransferasebindingsites; Arrow.Ester;Triangles.Acylcoenzymedeoxidizingenzymeestersideacylcoenzymedehydrogenase;Star.Glutamicacidcatalyticactivesite.

圖2 鯉魚(yú)LCAD與其他物種LCAD氨基酸序列比對(duì)圖

Fig. 2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence ofCyprinuscarpio(Cc) LCAD with the corresponding sequences from other species

圖3 基于MCAD和LCAD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4MCAD和LCAD的組織表達(dá)

熒光定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，MCAD和LCADmRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量差異很大。其中MCAD在肝臟中表達(dá)量最高，其次為心臟、頭腎、腎臟和腦，在其他組織中表達(dá)相對(duì)很少，在鰓中基本不表達(dá)；LCAD在心臟中表達(dá)量最高，在肝臟中表達(dá)量也比較高，但在其他組織中表達(dá)很少(圖4)。

圖4 MCAD和LCAD在組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.5 不同脂肪源對(duì)肝臟MCAD和LCAD表達(dá)影響

熒光定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，不同脂肪源中肝臟MCAD和LCAD表達(dá)水平不同。其中MCAD在亞麻油和魚(yú)油中表達(dá)量相對(duì)較高，在豆油和豬油中表達(dá)相對(duì)較少；LCAD在魚(yú)油中表達(dá)量最高，在豬油中表達(dá)量其次，在亞麻油中表達(dá)比較少，在豆油中未見(jiàn)表達(dá)(圖5)。

圖5 MCAD和LCAD在不同脂肪源肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.6MCAD和LCAD原核表達(dá)、蛋白純化

2.6.1 蛋白表達(dá)的鑒定 近幾年，通過(guò)原核表達(dá)的方式已經(jīng)可以將線粒體脂肪酸β氧化的一些關(guān)鍵酶進(jìn)行大量表達(dá)并純化出來(lái)，如SCAD[22]、MCAD[23]。本試驗(yàn)，重組體pEASY(E2)-ACADs(MCAD和LCAD蛋白分子量分別為43.0，43.6 kDa，在Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后實(shí)現(xiàn)了特異性融合蛋白表達(dá)。對(duì)收集的菌體超聲破碎，離心后得到的上清液和沉淀分別進(jìn)行電泳，確定MCAD和LCAD主要以包涵體的形式存在(圖6)。

M.預(yù)染蛋白Marker； 1.上清液中MCAD的表達(dá)； 2.包涵體中MCAD的表達(dá)； 3.包涵體中LCAD的表達(dá)； 4.上清液中LCAD的表達(dá)。

M. Prestained protein Marker； 1. The expression of MCAD in the supernatant； 2.The expression of MCAD in the including； 3.The expression of LCAD in the including； 4.The expression of LCAD in the supernatant.

圖6 蛋白可溶性鑒定

Fig.6 Soluble identification of proteins

2.6.2 MCAD和LCAD蛋白純化 經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后得到單一條帶(圖7)。純化后的蛋白經(jīng)濃縮之后，BCA蛋白測(cè)定得MCAD的濃度為0.86 μg/μL，LCAD的濃度為0.90 μg/μL。

M.預(yù)染蛋白Marker；1.MCAD純化后的蛋白；2.LCAD純化后的蛋白。

2.7 MCAD和LCAD原核表達(dá)蛋白活性測(cè)定

檢測(cè)FAD裝載：分別取MCAD和LCAD蛋白20 μL用雙蒸水稀釋至200 μL，進(jìn)行200～600 nm波長(zhǎng)下紫外掃描。掃描結(jié)果如圖8所示，280 nm處有明顯的蛋白吸收峰，且該蛋白在370，450 nm存在吸收峰。由于370，450 nm是FAD輔基的標(biāo)準(zhǔn)吸收峰，表明FAD輔基已裝載。

2.8 溫度對(duì)MCAD和LCAD酶活性的影響

由圖9可以看出，MCAD酶活性的最適溫度在28 ℃左右，LCAD酶活的最適溫度也在28 ℃；此時(shí)酶活性分別為9.12,10.,29 U/g。MCAD和LCAD都是有活性的蛋白，溫度過(guò)高或者過(guò)低對(duì)于酶活的影響都是比較大的，MCAD和LCAD酶活性在隨著溫度的升高而增強(qiáng)，達(dá)到最適溫度后又隨著溫度的升高而減弱。

圖8 不同波長(zhǎng)下的蛋白吸收值

圖9 不同溫度下蛋白酶活性

3 討論與結(jié)論

3.1MCAD和LCAD基因序列

本研究克隆了MCAD和LCAD開(kāi)放閱讀框cDNA序列，序列分析表明MCADcDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)1 275 bp，編碼424個(gè)氨基酸；LCADcDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)1 326 bp，編碼441個(gè)氨基酸。本研究克隆的MCAD和LCAD主要功能域包含蛋白激酶位點(diǎn)、蛋白激酶域(單橫線)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn)、酯酰輔酶脫氧酶端、酯酰輔酶脫氫酶端、谷氨酸催化活性位點(diǎn)。研究結(jié)果與小鼠SCAD[15]的ACADS的催化活性位點(diǎn)和植物油茶[16]ACADs的活性位點(diǎn)分析一致，表明MCAD和LCAD具有ACADs家族的共同特點(diǎn)；即底物結(jié)合位點(diǎn)(S228、F335、L342、N343、R346、F456和e457)用于固定催化底物，F(xiàn)AD結(jié)合位點(diǎn)(F219、L221、T222、G227、S228、W254、S256、I462、T469和D471)用于固定輔酶FAD，一個(gè)高度保守的谷氨酸殘基(Glu376)作為催化位點(diǎn)[17]。氨基酸序列上與其他魚(yú)類(lèi)比對(duì)比較保守，而對(duì)MCAD和LCAD一致性分析可知相似性比較低只有30.01%，其基本功能FAD功能區(qū)等卻極為相似[18]，這與其他物種的研究結(jié)果基本一致，這可能是由于功能選擇性表達(dá)導(dǎo)致的。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)鯉魚(yú)MCAD哺乳動(dòng)物MCAD聚為一支，鯉魚(yú)LCAD和西洋鮭、斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一支，這表明MCAD和LCAD在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了不同的進(jìn)化方向，這些可能是魚(yú)類(lèi)特有的3輪全基因組復(fù)制的結(jié)果。

3.2MCAD和LCAD在各組織中的表達(dá)

ACADs是由組織中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成后分泌到胞外的，同一種組織合成的MCAD和LCAD不會(huì)通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送到其他組織中發(fā)揮作用。這在一定程度上確保了用熒光定量技術(shù)檢測(cè)MCAD和LCAD各組織中表達(dá)量的準(zhǔn)確性。MCAD和LCAD均在肝臟和心臟高表達(dá)，這與人體中的高表達(dá)組織是一致的[19]，這說(shuō)明本試驗(yàn)可信度很高，主要是由于這些組織富含線粒體。不同組織中，MCAD和LCAD表達(dá)的水平并不完全相同，可能與長(zhǎng)期進(jìn)化時(shí)不同組織中MCAD和LCAD在脂肪代謝中作用程度不同有關(guān)。

3.3 不同脂肪源對(duì)肝臟MCAD和LCAD的表達(dá)影響

MCAD和LCAD肝臟mRNA在不同脂肪源的相對(duì)表達(dá)量水平不同。其中MCAD在魚(yú)油、豆油、亞麻油這3組相對(duì)表達(dá)量高于豬油，但這3組之間無(wú)顯著差異；LCAD在魚(yú)油和豬油這2組相對(duì)表達(dá)量不同。脂肪源的差異實(shí)質(zhì)上就是脂肪酸組成及比例(n-3/n-6)的差異，從本試驗(yàn)各組飼料脂肪源組成發(fā)現(xiàn)，魚(yú)油富含n-3型多不飽和脂肪酸(n-3，PUFA)、EPA和DHA；豆油富含棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸；亞麻油富含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸；豬油富含大量飽和脂肪酸。研究發(fā)現(xiàn)，MCAD催化4～12個(gè)碳原子的脂酰輔酶A脫氫，最佳催化底物為8個(gè)碳原子的脂酰輔酶A(C8-CoA)，LCAD催化8～20個(gè)碳原子的脂酰輔酶A脫氫，最佳催化底物為16個(gè)碳原子的脂酰輔酶A(C16-CoA)[18]；在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)MCAD催化能力只有LCAD的1.2%，脂酰輔酶A脫氫酶催化不同長(zhǎng)度脂肪酸的能力是棕櫚酸>花生四烯酸>二十二碳六烯酸>辛酸[20]；同時(shí)黃鱔和羅非魚(yú)利用豆油的能力與魚(yú)油接近，優(yōu)于豬油，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明筆者的結(jié)果是具有信度的。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，這可能與MCAD和LCAD主要催化不同碳原子的脂肪酸有關(guān)。MCAD的結(jié)果可能是魚(yú)油、豆油、亞麻油都富含不飽和脂肪酸而豬油組富含不飽和脂肪酸，因此，MCAD對(duì)飽和脂肪酸的催化能力優(yōu)于不飽和脂肪酸而導(dǎo)致豬油組中的MCAD表達(dá)量低；LCAD結(jié)果顯示LCAD肝臟mRNA在魚(yú)油組表達(dá)量很高，這與魚(yú)油組富含DHA和EPA有關(guān)，而其高于豬油組，可能與豬油組多含43個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸而LCAD由于脂肪酸碳鏈過(guò)長(zhǎng)無(wú)法催化有關(guān)。由此推測(cè)，MCAD和LCAD肝臟mRNA在不同脂肪源的相對(duì)表達(dá)量表示的是MCAD和LCAD對(duì)不同長(zhǎng)度碳原子脂肪酸的選擇催化能力。

3.4MCAD和LCAD原核表達(dá)

本研究選用高效表達(dá)載體pEASY-E2，將MCAD和LCAD基因目的片段與其相連接，成功構(gòu)建了pEASY(E2)-MCAD、pEASY(E2)-LCAD原核表達(dá)載體，在大腸桿菌Transetta(DE3)中于28 ℃經(jīng)過(guò)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h之后，高效表達(dá)出相對(duì)分子量約為43.0 kDa的融合蛋白，隨后經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和層析蛋白純化、復(fù)性、超濾，獲得了高純度的融合蛋白。

3.5 溫度對(duì)MCAD和LCAD酶活的影響

目前，關(guān)于脂肪酶活性的測(cè)定方法有很多種，如堿滴定法、對(duì)硝基苯酚法、銅皂法[21]。本研究蛋白的活性測(cè)試采用的是吩嗪硫酸甲酯反應(yīng)法測(cè)定了原核表達(dá)純化蛋白MCAD和LCAD在底物充足的情況下，不同溫度范圍內(nèi)的酶活。

魚(yú)類(lèi)屬于變溫動(dòng)物，環(huán)境溫度變化直接影響著魚(yú)類(lèi)機(jī)體內(nèi)的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響魚(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育的情況。魚(yú)類(lèi)消化酶活性受溫度影響已有很多研究報(bào)道，一般認(rèn)為，水溫升高能夠提高魚(yú)的各種生理代謝強(qiáng)度，消化系統(tǒng)的代謝強(qiáng)度也增強(qiáng)，消化酶的基礎(chǔ)分泌會(huì)增加；另一方面，魚(yú)的攝食量會(huì)隨著環(huán)境溫度上升而增加，魚(yú)類(lèi)消化酶的分泌活性與飽食程度有關(guān)。魚(yú)類(lèi)消化酶主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等幾種，其活性隨種類(lèi)、生長(zhǎng)階段和健康狀況的不同而有所差異，同時(shí)受外界環(huán)境因子諸如溫度、鹽度、pH值及重金屬離子的影響[22]。有研究表明[23]，魚(yú)類(lèi)消化酶的最適溫度一般為30～50 ℃；黃燕華等[24]對(duì)蝦的研究表明肝胰臟脂肪酶的最適溫度為30 ℃；李加兒等[25]的研究表明斜帶髭鯛(Hapalogenysnitens)消化道不同部位脂肪酶活性的最適溫度均為35℃；郭娟等[26]對(duì)同屬于鯉科魚(yú)類(lèi)團(tuán)頭魴的研究表明脂肪酶的最適溫度為50 ℃，本研究MCAD和LCAD酶活的最適溫度與上面研究結(jié)果有一定的差異，表明不同種魚(yú)不同消化器官的不同消化酶，其適宜溫度各不相同，也有可能與在體外克隆與原核表達(dá)時(shí)其谷氨酸活性位點(diǎn)的突變有關(guān)。鯉魚(yú)生長(zhǎng)的適宜溫度是20～28 ℃，從ACADs活性的最適溫度與環(huán)境溫度相比較來(lái)看，水體環(huán)境的溫度難以維持ACADs活性所需要的最適溫度，這一點(diǎn)與倪壽文[27]在研究溫度與魚(yú)消化酶作用關(guān)系時(shí)的結(jié)論相近似，蝦類(lèi)也存在類(lèi)似現(xiàn)象[28]。究其原因，可能跟鯉魚(yú)體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境有關(guān)，而且試驗(yàn)中測(cè)定的ACADs活性是在一定的限制性條件下進(jìn)行的，所以最適溫度只有在一定的條件下才會(huì)有意義，也在一定程度上反映了溫度對(duì)ACADs的表達(dá)具有一定影響。

3.6 結(jié)論

脂酰輔酶A脫氫酶是催化各種長(zhǎng)度直鏈脂肪酸β氧化第一步脫氫反應(yīng)的限速酶，而線粒體脂肪酸β氧化是脂肪酸氧化的主要的代謝途徑。目前，MCAD和LCAD在哺乳動(dòng)物中研究較多，而在魚(yú)類(lèi)尚無(wú)深入探討且非常有限。本研究克隆并獲得鯉魚(yú)MCAD和LCAD全長(zhǎng)，通過(guò)與斑馬魚(yú)比對(duì)，其同源性高達(dá)93.16%和94.56%，表明該基因家族在物種進(jìn)化中較為保守；組織表達(dá)研究表明MCAD和LCAD在富含線粒體且脂肪酸代謝旺盛的組織器官：心臟和肝臟中表達(dá)較高，而在其他組織中表達(dá)量較少；Real-time試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同脂肪源營(yíng)養(yǎng)條件下，MCAD和LCAD在富含最佳長(zhǎng)度脂肪酸的脂肪源作用明顯增強(qiáng)，對(duì)脂肪酸β氧化起關(guān)鍵調(diào)控作用。此外溫度對(duì)MCAD和LCAD的影響比較大，溫度對(duì)其活性的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明養(yǎng)殖最適溫度28 ℃左右。綜上所述，本研究初步證實(shí)MCAD和LCAD在鯉魚(yú)肝臟中對(duì)脂肪酸β氧化具有關(guān)鍵調(diào)控作用，并為改善鯉魚(yú)飼料配方和養(yǎng)殖條件提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝在實(shí)驗(yàn)期間幫助我的導(dǎo)師俞菊華和師兄周杰，謝謝你們對(duì)試驗(yàn)的關(guān)鍵性協(xié)助和對(duì)我個(gè)人生活方面的關(guān)心，這對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的完成都至關(guān)重要。對(duì)你們獻(xiàn)上我最誠(chéng)摯的謝意！

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Cloning，Expression and Activity Analysis of Two Kinds ACADs inCyprinuscarpio

YU Wenjuan1，YU Juhua1，2，LI Hongxia2，LI Jianlin2，TANG Yongkai2，YU Fan2,HE Feng1,FU Chunjie3

(1. Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi 214081，China； 2. Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater，Ministry of Agriculture，Wuxi 214081，China；3.Donghai Fisheries Technical Extension Station，Donghai 222300,China)

To investigate the regulatory mechanism of fatty acids fatty Acyl coenzyme A (Acyl-CoA dehydrogenase，ACADs) on fatty acids β-oxidation in mitochondrial，this experiment cloned two genes，MCADandLCAD，of ACADs family from the liver tissue ofCyprinuscarpiousing classic RT-PCR.The open reading frames ofMCADandLCADwere 1 275，1 326 bp in length respectively，encoding 424 and 441 amino acids with characteristics of ACADs family structure (such as FAO binding sites，the substrate binding site and catalytic site)，sharing high homology with zebrafish，93.16% and 94.56% respectively.The results of RT-PCR showed thatMCADandLCADmainly expressed in the liver and heart. No significant influence was observed of different sources of fat on the expression ofMCAD，while fish oil could obviously stimulate the expression ofLCAD. After IPTG induction，both the two prokaryotic expression vectors，MCADs-pEASY(E2)，andLCADs-pEASY(E2)，expressed fusion proteins of 43.0，43.6 kDa in molecular weight，with obvious absorption peak at 370，450 nm，which was proved to be able to naturally bind to FAO cofactors. Phenazine methyl sulfate reaction method was applied to determine the enzyme activity of Prokaryotic expression protein，and the results indicated that the optimum temperature for MCAD and LCAD enzymes were 28 ℃，and the enzyme activity were 9.12，10.29 U/g respectively. This study preliminary confirmed thatMCADandLCADhad highly expression in liver and heart ofCyprinuscarpio，similar as in Mammals，and high unsaturated fatty acid could promote the expression ofLCAD.

Cyprinuscarpio；MCAD；LCAD； Clone； Prokaryotic expression；Enzyme activity

2017-03-10

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)課題(2016HY-ZD0303)；江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目(Y2015-4)；中央級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2015JBFM10)

喻文娟(1989-)，女，河南信陽(yáng)人，在讀碩士，主要從事遺傳育種與分子生物學(xué)研究。

俞菊華(1966-)，女，江蘇蘇州人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事遺傳育種與分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)03-0048-10

10.7668/hbnxb.2017.03.008